微小单胞菌（Parvimonas micra）通过苯乳酸诱导DNA损伤促进结直肠癌发生

《Clinical and Translational Medicine》：Parvimonas micra promotes carcinogenesis of colorectal cancer through phenyllactic acid-induced DNA damage

　　

近期研究已证实肠道菌群在结直肠癌（CRC）发病机制中的重要性，但其具体作用尚未明确。为此，研究人员建立了一个临床队列并收集了CRC患者和健康对照者的粪便样本。宏基因组分析发现，微小单胞菌（Parvimonas micra）的存在与CRC的发生关系最为显著。通过对来自八个公共队列的1379个粪便宏基因组的分析，证实了CRC中P. micra定植的增加。随后进行的非靶向代谢组学鉴定出CRC患者粪便样本中苯乳酸（PLA）的积累。在研究人员分离的P. micra上清液中检测到更高浓度的PLA。全基因组测序证实，在P. micra基因组中观察到一系列与PLA生物合成相关的基因，如pdhD。重要的是，在ApcMin/+和氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸钠（DSS）小鼠模型中，P. micra和PLA均诱导了致癌作用。P. micra和PLA在CRC发展中的作用与DNA损伤有关。编码来自P. micra的异源pdhD的大肠杆菌BL21工程菌也能诱导DNA损伤。从机制上讲，在Ahr?/?小鼠中，PLA诱导的DNA损伤和CRC致癌作用显著减轻。芳烃受体（AHR）抑制剂显示出减少小鼠致癌作用的治疗潜力。这些发现确立了P. micra及其代谢物的作用，从而为治疗CRC提供了诊断和治疗靶点。

该研究针对结直肠癌（CRC）发病机制中肠道菌群及其代谢物的具体作用机制尚不明确的科学问题展开。尽管已有研究表明口腔微生物可能通过肠道定植影响CRC，但特定的口腔源性菌种如微小单胞菌（Parvimonas micra）在致癌过程中的确切功能及代谢驱动因素仍待阐明。为此，研究人员通过整合多组学分析与体内外模型，深入探究了P. micra及其代谢产物苯乳酸（PLA）在CRC发展中的作用及分子机制。研究结果表明，P. micra通过其代谢产物PLA激活芳烃受体（AHR）信号通路，上调活性氧（ROS）和细胞色素P450 1B1（CYP1B1），进而诱导DNA损伤，最终促进结直肠癌的发生发展。这一发现为CRC的早期诊断和治疗提供了新的靶点和理论依据，相关成果发表在《Clinical and Translational Medicine》期刊上。

在研究技术方法方面，研究人员首先建立了包含CRC患者和健康对照的临床队列，并收集了八个公共数据集的1379个粪便宏基因组进行验证。采用非靶向代谢组学分析粪便样本以筛选差异代谢物。通过厌氧分离技术从CRC粪便中分离出P. micra并进行全基因组测序。利用Apc^Min/+小鼠和氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠模型评估P. micra和PLA的体内致癌效应。此外，还构建了携带异源pdhD基因的工程大肠杆菌BL21以及Ahr^?/?基因敲除小鼠模型，结合彗星实验、免疫荧光和Western blotting等技术，从细胞、类器官及组织层面验证了DNA损伤及相关信号通路的激活情况。

研究结果部分主要包括以下内容：

1. P. micra丰度升高与CRC发展相关

研究人员通过临床队列的宏基因组分析发现，与健康对照组相比，CRC患者粪便中P. micra的丰度显著增加，且与疾病的发生关系最为显著。通过对八个公共队列数据的验证分析，进一步证实了P. micra在CRC患者粪便中的富集现象，表明其定植增加与CRC的发展密切相关。

2. PLA上调参与CRC进程

对临床队列粪便样本的非靶向代谢组学分析显示，CRC患者粪便中代谢物谱发生显著改变。其中，苯乳酸（PLA）在CRC患者组中呈现出最显著的积累。整合公共代谢数据集分析发现，PLA是多个数据集中共同且显著升高的代谢物，且在独立的临床队列中通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）验证了CRC患者粪便中PLA浓度显著升高，提示PLA可能是介导CRC发展的关键代谢物。

3. P. micra通过生物合成PLA促进CRC

通过Mantel检验和Procrustes分析，研究人员证实了粪便微生物组与代谢组之间存在紧密关联。利用梯度提升决策树模型计算SHAP值，发现P. micra是对PLA生物合成贡献度最高的物种之一。在分离的P. micra上清液中检测到高水平的PLA，且全基因组测序结果显示P. micra基因组中存在完整的PLA生物合成相关基因簇（如pdhD）。这证实了P. micra能够通过pdhD等基因介导PLA的生物合成，从而推动CRC的发展。

4. P. micra及其代谢物在CRC小鼠模型中的作用

在Apc^Min/+小鼠和AOM/DSS诱导的CRC小鼠模型中，灌胃给予P. micra或其代谢产物PLA均能显著提高粪便中PLA的浓度，并导致结肠肿瘤数量和负荷显著增加，同时促进Ki-67阳性细胞的增殖。在患者来源的CRC类器官模型中，PLA处理同样增加了类器官的直径，提高了Ki-67的表达并降低了E-钙粘蛋白（E-cadherin）的水平，表明其促进了肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。

5. P. micra来源的PLA诱导DNA损伤

体外细胞实验显示，P. micra及其上清液、以及外源性PLA处理均能显著降低多种结直肠癌细胞系和正常上皮细胞的凋亡，并促进其增殖。彗星实验和γ-H2AX免疫荧光检测证实，P. micra和PLA处理导致了显著的DNA损伤。在类器官和小鼠肠道组织中，PLA处理也上调了DNA损伤标志物γ-H2AX的表达，表明P. micra和PLA通过诱导DNA损伤来促进CRC的发展。

6. P. micra通过pdhD基因调控PLA生物合成

研究人员构建了过表达P. micra pdhD基因的大肠杆菌BL21工程菌。该工程菌能够显著提高PLA的产量，其产生的上清液在体外诱导了NCM460细胞发生DNA损伤，并在AOM/DSS小鼠模型中促进了肿瘤的发生。这直接证明了pdhD基因是P. micra介导PLA生物合成及促进致癌的关键基因。

7. P. micra来源的PLA通过AHR介导CRC致癌

分子对接模拟显示PLA能与AHR的活性位点结合。在Ahr^?/?基因敲除小鼠中，PLA诱导的肿瘤发生和DNA损伤得到了显著缓解。机制研究发现，AHR抑制剂能够逆转P. micra和PLA诱导的细胞DNA损伤及体内致癌作用。进一步的实验表明，AHR的激活上调了活性氧（ROS）和CYP1B1的表达，从而导致DNA损伤。

在讨论与结论部分，研究人员指出，本研究揭示了口腔机会性病原体P. micra在CRC中的关键作用，阐明了其通过生物合成代谢产物PLA，激活AHR信号通路，进而诱导上皮DNA损伤并促进结直肠癌发生的分子机制。尽管研究利用了多种小鼠模型和类器官进行了验证，但仍存在一定的局限性，例如P. micra调控PLA代谢的深层机制以及AHR影响上皮DNA损伤的具体细节有待进一步探索。总体而言，这项工作确立了P. micra及其代谢物PLA在CRC发展中的核心地位，为CRC的诊断和靶向AHR的治疗策略提供了新的视角和科学依据。