亲水性相互作用色谱法与串联质谱法在甲基化寡核苷酸表征中的应用

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Hydrophilic Interaction Chromatography and tandem mass spectrometry for the characterization of methylated oligoribonucleotides

**Khaoula Adouairi | Carole Farre | Carole Chaix | Sébastien Pfeffer | Karine Faure**
**法国里昂第一克劳德·伯纳德大学，ISA UMR 5280，法国国家科学研究中心（CNRS），Doua街5号，69100 Villeurbanne**

**摘要**
寡核苷酸的化学修饰，特别是N-6-甲基腺苷（m6A），对其它类别的RNA（包括微小RNA（miRNA）有重要影响。然而，对这些修饰在完整序列上的表征仍然具有挑战性。本文开发了一种基于离子对自由亲水相互作用液相色谱-高分辨率串联质谱（HILIC-HRMS/MS）的工作流程，用于分析合成批次中的miRNA类似物，这些类似物的长度可达22个核苷酸，包括甲基化水平不同以及含有相同数量甲基基团的位置异构体。该方法结合了基于酰胺的HILIC分离技术以及顶端向下碰撞诱导解离（CID）质谱/质谱（MS/MS），能够在20分钟内完成三个层次的表征。它可以（i）分离并识别杂质（短链片段）与全长产物（FLP），（ii）对长达22个核苷酸的序列进行全局甲基化形式（0、1和2个甲基基团）的色谱分离，（iii）基于特定片段的存在与否来区分位置异构体。在复杂样品上的应用证明，即使异构体浓度不同，该方法也能稳健地识别每个异构体，例如具有相同m6A计数的位置异构体和不同甲基化水平的非等摩尔混合物。

**1. 引言**
miRNA是小型非编码RNA，在基因表达的转录后调控中起重要作用。通过引导RNA诱导的沉默复合体（RISC）识别互补的信使RNA，miRNA调节mRNA的稳定性和翻译，从而影响分化、增殖、凋亡和应激反应等关键细胞过程[1]。miRNA表达或功能的失调已被证明与许多病理状况有关，包括癌症和神经退行性疾病[2][3]。miRNA的化学修饰，特别是N6-甲基腺苷（m6A），已成为一个额外的表观遗传调控因素，影响RNA的稳定性、成熟度和目标识别[4]。除了细胞中的miRNA外，许多病毒也会编码自己的miRNA，以重塑宿主途径并促进病毒持续存在。其中一些病毒miRNA作为细胞同源物发挥作用，模仿其常规的调控网络。例如，由卡波西肉瘤疱疹病毒（KSHV）编码的病毒miR-K11与内源性miR-155具有功能同源性，并已知能调节宿主的免疫和信号通路[5][6]。值得注意的是，KSHV的RNA在感染过程中会携带丰富的m6A标记[7]。这表明KSHV的miRNA，包括miR-K11，也可能受到m6A的调控。因此，选择miR-K11作为模型目标，以开发分析方法，并支持未来对病毒和细胞miRNA的区分。

尽管越来越多的研究认识到某些miRNA中的m6A甲基化[8]，但在成熟miRNA序列中准确定位和量化m6A仍然具有分析上的挑战性。大多数现有方法依赖于酶法或化学消化后进行液相色谱-质谱（LC-MS）来分析核苷酸谱型[9][10]，或者使用下一代测序技术，如MeRIP-seq[11]。这些方法确实已被广泛认可，并能提供关于全球修饰水平的信息，但它们无法区分完整miRNA标准中的位点特异性甲基化。传统的离子对反相液相色谱（IP-RPLC）技术广泛用于寡核苷酸分析[12]。例如，Kadlecova等人[13]实现了n个和n-1个磷酸硫代（PS）寡核苷酸之间的基线分辨率，而Donegan等人[14]报告在优化的IP-RP条件下分离了25个核苷酸的PS寡核苷酸。最近，Millán-Martín等人[15]展示了基于胺的IP-RPLC-HRMS/MS在化学修饰小RNA治疗药物及其工艺相关杂质表征中的适用性。然而，IP-RPLC方法存在MS兼容性有限、强烈的离子抑制以及使用非挥发性化学物质的问题，这些因素阻碍了高分辨率串联质谱实验的进行[14]。

亲水相互作用液相色谱（HILIC）作为一种有前景的替代方法出现，提供了更好的MS兼容性和对极性分析物（包括核苷酸和碱修饰的寡核苷酸）的选择性[16]。在过去五年中，多项综述[17][18]强调了人们对HILIC的兴趣日益增长，无论是作为独立的LC-MS方法[19]，还是多维工作流程的一部分[20]。特别是，HILIC被描述为离子对反相色谱（IP-RPLC）[20]、弱阴离子交换（WAX）[21]和强阳离子交换（SCX）[22]的补充技术。实际上，HILIC的分析价值在于其对极性寡核苷酸的独特行为和选择性。因此，它已被应用于许多领域，如治疗性寡核苷酸（尤其是磷酸硫代反义寡核苷酸ASO）的表征[23]，以及合成相关杂质的分析[24]。这些研究表明，基于HILIC的方法可以提高结构相似物种的分辨率，这在质量控制环境中尤为重要，因为密切相关的杂质（如短链片段或骨架相关修饰）在分析上仍然具有挑战性。最近，离子对亲水相互作用色谱（IP-HILIC）在区分密切相关的杂质方面表现出了改进的效果，包括脱氨基产物[25]。此外，串联质谱（MS/MS）已成为HILIC基础寡核苷酸分析中不可或缺的补充工具，因为它能够确认序列、定位化学修饰，并区分色谱上可能无法完全分离的密切相关物种[26]。HILIC-MS/MS也被用于检测和量化碱修饰的RNA，特别是含有m6A的RNA。然而，分析要么是在消化步骤之后进行的[25]（如前所述），这意味着样品不再保持完整；要么仅关注核苷酸水平[26]。然而，将其应用于全长产物（FLP）的化学修饰miRNA的研究仍然较少[29]。已报道的研究主要集中在较短的模型序列或核糖修饰上，尚未证明能分离长度超过11个核苷酸的m6A修饰miRNA[30]。

碱基甲基化miRNA的位点定位通常使用傅里叶变换离子回旋共振（FT-ICR）质谱仪进行[29][30]。Glasner等人[32]表明，顶端向下FT-ICR质谱可以在不进行酶消化的情况下定位完整RNA中的多个碱基甲基化。虽然这种策略非常强大且具有超高质量精度，但它依赖于相对纯化的寡核苷酸的直接注入，并且需要根据相对切割产率和fragment-ion比率来识别修饰位点，而这些因素易受分析物浓度和信号强度的影响。在这种基于注入的实验中，样品中的所有物种同时被引入源区。因此，源区竞争、离子抑制以及残留杂质或同位素物种的共碎片化可能会影响观察到的片段模式和最终的修饰位点分配，Glasner等人也明确指出了这一点[32]。此外，FT-ICR仪器价格昂贵，且在常规分析实验室中不易获得，这限制了该方法的可转移性。

在此背景下，本文提出了一种全面且更易于使用的HILIC-HRMS方法，用于分析m6A修饰的miRNA类似物。

**2. 材料与方法**
**2.1. 化学品和试剂**
无RNase的水通过Elga水纯化系统（Veolia water STI，法国Le Plessis Robinson）获得，遵循改编的无RNase协议以生产高纯度水（18.2 MΩ·cm）。LC-MS级别的乙腈（ACN）从Sigma Aldrich（德国Darmstadt）购买，醋酸铵（Amm.Ac，NH4OAc）从Fisher Scientific（英国Loughborough）获得。寡核苷酸（ON）在?KTA OligoPilot 10合成仪（GE Healthcare Bio-Sciences Corp.，美国新泽西州Piscataway）上按照自动化的固相磷酰胺酸合成协议合成[33]（详细信息见补充数据），使用的磷酰胺酸核苷酸单体来自Glen Research（美国弗吉尼亚州Sterling）。本研究中使用的粗批次组成和全长产物（FLP）的序列总结在表1中。

**表1. 本研究中使用的miR-K11寡核苷酸粗批次组成及FLP序列。甲基化腺苷的位置用粗体表示。**
| 粗批次ID | 粗批次组成 | FLP序列（5’至3’） | FLP的单同位素质量（Da） |
| --- | --- | --- | --- |
| K11-Native | FLP-native及其短链片段（Sy-native） | UUAAUGCUUAGCCUGUGUCCGA | 695 | 2.900 |
| K11-m6A3 | FLP-m6A及其短链片段（Sy-m6A3） | UU[m6A]AUGCUUAGCCUGUGUCCGA | 696 | 6.916 |
| K11-m6A10 | FLP-m6A10及其短链片段（Sy-m6A10） | UUAAUGCUU[m6A]GCCUGUGUCCGA | 698 | 0.931 |
| K11-m6A22 | FLP-m6A22及其短链片段（Sy-m6A22） | UUAAUGCUUAGCCUGUGUCCG | 698 | 0.931 |
| K11-m6A3,22 | FLP-m6A3,22及其短链片段（Sy-m6A3,22） | UU[m6A]AUGCUUAGCCUGUGUCCG[m6A] | 698 | 0.931 |

在这种命名法中，K11-xxx表示粗合成批次，FLP-xxx表示相应的全长产物。Sy-xxx表示相关的短链片段（杂质），y表示短链片段中的碱基数。在所有情况下，xxx表示相应的寡核苷酸，对于甲基化物种，后缀指定了序列中甲基化腺苷的位置。

**2.2. 样品制备**
寡核苷酸储备液在纯化的无RNase水中制备，并储存在-20°C下直至分析。工作溶液在H2O: ACN（1:1，v/v）中稀释至90 μM。准备了三种具有不同甲基化形式的miRNA混合物。混合物1包含浓度分别为90 μM和45 μM的位置异构体K11-m6A3和K11-m6A22。混合物2是通过混合等摩尔量的K11-native、K11-m6A22和K11-m6A10（22）储备液制备的，最终浓度均为60 μM。混合物3是通过混合K11-Native、K11-m6A3和K11-m6A10（22）以不同浓度（60、40和90 μM）制备的。每个天然短链片段（Sy-native）的详细序列信息见补充信息（表S1）。

**2.3. 仪器**
LC-MS分析在Agilent 1290 Infinity II超高效液相色谱（UHPLC）系统（Agilent Technologies，德国Waldbronn）上进行，该系统配备了用于260 nm紫外检测的二极管阵列检测器（DAD）。LC与Agilent 6560 Ion Mobility Q-TOF（Agilent Technologies，美国加利福尼亚州Santa Clara）相连，后者配备了ESI源（Dual Agilent Jet Stream）。质谱仪以负ESI模式运行，m/z范围为100-2000，扫描速率为3 spectra/s。毛细管、碎片化和喷嘴电压分别设定为1750 V、400 V和800 V，源温度固定在150°C。干燥气体和护套气体流量分别为11 L/min。这些条件来自初步优化研究（数据未显示）。

对于MS/MS分析，在同一运行中进行了两次交替实验：（1）仅MS采集，用于前体离子谱型分析；（2）MS/MS采集，采用数据独立采集（DIA）模式，在预定义的m/z窗口内以35 V碰撞能量值对所有离子进行碎片化分析。数据采集和处理使用Agilent MassHunter Qualitative Analysis 10.0软件进行。

**2.4. HILIC柱筛选**
选择HILIC柱是基于其固定相化学性质，以确定最适合分离不同甲基（Me）数量和位置的miR-K11形式的柱子。评估了六种柱子，分别是GTxResolve Premier BEH Amide、Cortecs Si（纯硅）和Acquity BEH（混合硅）（Waters Corporation，美国马萨诸塞州Milford）、Poroshell HILIC OH-5（Agilent Technologies）、Nucleoshell HILIC（两性离子）（Macherey-Nagel，德国Düren）以及DCPack PTZ（聚N-(1H-四唑-5-基)-甲基丙烯酰胺）（Daicel Technologies，美国宾夕法尼亚州West Chester）。柱子的几何结构和颗粒技术见补充数据表S2。GTxResolve BEH Amide是一种生物惰性柱子，在miRNA分析前无需任何钝化处理。其他柱子则通过多次注射DNA标准品进行钝化，直到获得稳定且可重复的峰高[34][35]，以最小化吸附效应。柱子筛选步骤如下：流动相A由50 mM醋酸铵在H2O: ACN（70:30，v/v）组成，流动相B由50 mM醋酸铵在H2O: ACN（30:70，v/v）组成，pH值为6.9。对于GTxResolve Premier BEH Amide、Poroshell HILIC OH-5和DCPack PTZ柱子，梯度设置为10%-55%A；对于Cortecs Si和Acquity BEH柱子，梯度调整为1%-20%A。所有筛选实验的标准化梯度斜率（调整至柱死体积后）均为0.5%。其他操作条件包括流量为600 μL/min，进样体积为0.5 μL。

对于选定的GTx Resolve Premier BEH Amide柱子，进一步进行了优化以提高分离效率。研究的参数包括醋酸铵浓度、柱子温度和标准化梯度斜率值。最后，进样体积对于UV检测固定为0.5 μL，对于MS检测增加到1 μL。

**3. 结果与讨论**
**3.1. HILIC方法开发**
**3.1.1. HILIC固定相化学性质的评估**
评估了多种HILIC固定相，以确定最适合根据甲基化形式分离FLP寡核苷酸的化学性质。这项评估在30°C下进行。评估的柱子涵盖了多种化学性质，包括两性离子、酰胺和其他极性官能团，每种性质都提供了不同的保留机制，如文献中所述[36]。与其他研究[16]报告的那样，HILIC以其根据长度分离短链片段的能力而闻名。在这项研究中，主要观察到OH-5和酰胺柱（图S1）存在这种分离现象。在裸硅和混合硅柱上（图S1a和S1b），较短 fragments与FLP-m6A3,22共同洗脱在一个宽峰内，显示出有限的选择性。在两性离子（图S1e）和PTZ（图S1f）相上也观察到了相同的行为，其中较短片段与FLP-m6A3,22共同洗脱。相比之下，在OH-5柱上实现了S19-m6A3,22（n-3）及更短片段与FLP-m6A3,22的分离（图S1c），但S20-m6A3,22（n-2）和S21-m6A3,22（n-1）仍然与FLP-m6A3,22共同洗脱。所有较短片段在BEH Amide柱上都能被分离（图S1d），这表明在这两种柱子上存在基于长度的选择性，证实了其他作者的发现[19],[37]。由于较短片段的分离已有详细描述[16]，以下部分将重点介绍基于N-6-甲基腺苷修饰的数量和位置来实现FLP分离的最有效条件。

为了比较不同固定相的保留能力，尽管柱子几何形状不同，仍报告了每种分析物洗脱时的流动相组成（Ce, %A）（公式1），而分辨率Rs（公式2）被用作选择最适合分离不同甲基化程度FLP的柱子的标准。（1）Ce=Ci+tr?t0?tdtg*(Cf?Ci)，其中Ci和Cf表示初始和最终的梯度组成，tr是分析物的保留时间，t0、tg和td分别代表死时间、梯度时间和停留时间。（2）Rs=2(tr2?tr1w2+w1)，其中tr1和tr2对应两个相邻峰的保留时间，w1和w2是它们各自的基线宽度。

在测试的柱子中，纯硅和混合硅柱显示出最低的保留能力（图1a），这可能是由于它们的硅相互作用位点主要是简单的亲水分配作用，具有较弱的特异性相互作用。然而，应该注意的是，这些柱子不仅在固定相化学性质上有所不同，还在粒径（亚2μm vs 3 μm）和孔径（90-300 ?）上也有所不同。这些因素也可能影响色谱效率，以及在较小程度上的选择性。在键合相中，两性离子相的保留能力最低，PTZ相稍高，而OH-5和酰胺相的最高。后两种相观察到的更强保留能力可能反映了亲水分配与固定相之间的特定极性相互作用（特别是氢键作用）的更理想平衡。

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图1. 在30°C下六种HILIC固定相的保留能力和分辨率。(a) 样品K11-Native、K11-m6A22和K11-m6A10,22的FLP峰的洗脱组成（%A）。(b) 随着甲基化数量增加的FLP-m6A22/FLP-native和FLP-m6A10,22/FLP-m6A22关键对之间的分辨率。条件：50 mM NH4OAc，30°C，斜率0.5%，260 nm处紫外检测。

随着甲基化数量的增加，FLP峰在纯硅和混合硅柱上的分离分辨率最低（图1b），主要是由于之前提到的保留能力不足，以及对纯硅柱来说，峰宽过大（0.42 分钟）。同样，两性离子相的分辨率也较低，因为峰宽较大（0.46 分钟）。OH-5和PTZ柱提供的峰更锐利（峰宽分别为0.30 分钟和0.26 分钟），因此分辨率处于中等水平。最后，BEH Amide柱一致地表现出最高的甲基选择性，且峰较窄（峰宽0.11 分钟）。对于FLP-m6A22/FLP-native（1Me/0Me）和FLP-m6A10,22/FLP-m6A22（2Me/1Me）关键对，分别获得了0.95和1.20的分辨率值。这些发现与Hsiao等人的研究结果一致[36]，他们之前报告称酰胺HILIC相表现出最高的甲基选择性，优于其他极性化学性质的固定相。

除了甲基化数量之外，还研究了比较分子之间共享甲基化位置的影响。进一步比较了基于甲基化数量的分离是否受到共同甲基化位点存在与否的影响。根据是否存在共同甲基化位点，评估了额外的关键对（图S2）。具有一个甲基化位置（m6A10,22/m6A22和m6A10,22/m6A10）的FLP对与没有共同甲基化位置（m6A3,22/m6A10）的对相比，并没有系统性地显示出更低或更高的分辨率。因此，没有观察到分辨率与是否存在共同甲基化位置之间的明确和系统性的关系。这些结果表明，色谱分离并不总是由共同的或非共同的甲基化模式决定的。总体而言，酰胺固定相为所有调查的对提供了最高的分辨率值。

考虑到当甲基化的腺苷位于RNA序列的不同位置时形成的位置异构体的分离能力，所有固定相提供的分辨率都非常有限（Rs < 0.5）（图S3），表明所测试的色谱维度可能不足以揭示这一特征。

基于以上所有信息，选择了GTxResolve BEH Amide固定相用于后续的方法开发和优化，以进一步增强基于甲基化数量的分离能力。其优越的性能可能反映了固定相化学性质和柱子形态（包括粒径和孔径）的综合效应。

3.1.2. 操作条件的优化

在选择了酰胺相后，优化了操作条件以提高甲基化形式之间的分辨率，同时保持与质谱（MS）的兼容性。采用了一次一个因素的策略来评估：(i) 醋酸铵（Amm Ac）浓度在25-100 mM范围内，(ii) 柱温在30-90°C范围内，以及(iii) 在三个值（0.1%、0.2%和0.5%）下评估的标准化梯度斜率。这些条件范围是基于之前使用酰胺固定相分析寡核苷酸的研究[15],[16]选择的。主要使用无甲基化和单甲基化FLP（1Me/0Me）以及单甲基化和二甲基化FLP（2Me/1Me）之间的分辨率（Rs）来评估这些参数。

将醋酸铵浓度从25 mM增加到100 mM（图S4a）对两种对（1Me/0Me和2Me/1Me）的分辨率略有改善。然而，在这个浓度范围内，选择性几乎保持不变（图S4b），这表明甲基选择性主要不是由离子强度决定的。相反，选择性反映了N6-甲基化对腺嘌呤的影响。正如Pan等人[38]所解释的，NH2基团转化为NHCH3会减少碱的氢键供体能力，并略微降低亲水性。这些变化预计会改变特定的极性相互作用，特别是氢键作用，这可以解释观察到的选择性差异。总体而言，选择50 mM的盐浓度作为可接受分辨率和避免MS分析中离子抑制之间的最佳折中。

温度从30°C升高到90°C，根据固定相的类型，所有FLP峰的洗脱组成增加了2% A（图S5），但对峰宽值（0.11 ± 0.01 分钟）没有显著影响。因此，分辨率随温度升高而提高，这一行为也得到了Hao等人[39]的证实。最后，如预期那样，降低梯度斜率提高了分辨率，当斜率为0.1%并采用紫外检测时，1Me/0Me和2Me/1Me的分辨率分别达到了1.87和1.42（图S6a），同时观察到了最大的峰宽（图S6b）。然而，在这种斜率下，运行时间超过了40分钟。在0.5%斜率下，分辨率较低，紫外检测下的值在1.2到1.5之间。与MS检测联用导致额外的外部方差，从而使峰宽增大。尽管较低的斜率与较低的噪声相关，但在使用0.5%斜率时信噪比约为10（图S6c）。因此，选择了0.5%的标准化斜率以实现快速分析。

总之，操作条件确定如下：50 mM醋酸铵（Amm Ac），柱温90°C，标准化斜率为0.5%，如果需要更高的分辨率，可以降至0.1%。这些选定的条件与MS联用完全兼容，并且与最近关于寡核苷酸样本的HILIC研究[29]一致。

3.2. miR-K11的表征

3.2.1. 用于杂质分析的HILIC-MS

固相RNA合成的偶联反应本质上是不完全的，导致96-98%的偶联产率。这会产生含有多个截短片段（n-1, n-2…）的粗产品，这些片段被认为是治疗性RNA的关键质量属性，在生物环境中生成的miRNA短片段中也广泛存在[40]。因此，在研究和工业质量控制中都需要将这些片段与全长n-mer分离。基于这一背景，选择了未纯化的含有所有序列短片段的miRNA样本进行分析。如图2所示，对FLP-native序列合成得到的粗样本进行分析后，可以在不到20分钟内实现miRNA短片段的长度基分离。对于每对连续的短片段（S04-S21），计算了分辨率值，并在图S7中总结。大多数对的分离质量很高，分辨率通常超过5，有些甚至达到了15。只有少数超过17片段的对接近基线分离的较低阈值。这种行为与之前在IP-RPLC和HILIC中的研究报告一致[38],[39]，其中较长序列的分离通常更加困难。尽管如此，FLP峰与其n-1合成杂质S21-native的基线分离是可辨别的，分辨率为1.63，符合质量控制要求。此外，该方法对FLP-native及其短片段显示出良好的重复性，相对标准偏差（RSD）约为0.22%（n=3）。

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图2. K11-native的色谱图显示了在HILIC GTxResolve柱上短片段（Sy，y表示核苷酸数量）与FLP（22-mer）的分离情况，unk对应于除短片段外的未知杂质。条件：GTxResolve BEH Amide，50 mM NH4OAc，10-50%A，90°C，斜率0.5%，260 nm处紫外检测。

MS分析证实了基于UV的鉴定结果，每个短片段都检测到了预期的m/z值。短片段检测到了少量加合物，而对于FLP，发现了两种电荷状态和至少两种钠加合物。保留时间、m/z值和电荷值以及序列信息详见表S1。

3.2.2. 用于甲基化miRNA分离的HILIC-MS

虽然已有文献报道了基于序列长度的分离，但很少有研究关注仅在一个或两个碱基上差异一个甲基化的相同序列的分离。Lobue等人[30]使用基于二醇的HILIC柱实现了不含离子对的支持分离，包括含有单个甲基化碱基（如3-甲基尿苷（m3U）和m6A）的短修饰寡核苷酸及其未修饰的对应物。然而，他们的分离仅限于11-mer序列长度。

为了研究HILIC分离较长、含有m6A修饰的miRNA序列的能力，评估了不同长度序列的分离情况，这些序列仅在一个或多个碱基上有所不同甲基化。根据是否存在共同甲基化位置评估了额外的关键对（图S2）。具有一个甲基化位置（m6A10,22/m6A22和m6A10,22/m6A10）的FLP对与没有共同甲基化位置（m6A3,22/m6A10）的对相比，并没有系统性地显示出更低或更高的分辨率。因此，没有观察到分辨率与是否存在共同甲基化位置之间的明确和系统性的关系。这些结果表明，色谱区分并不总是由是否存在共同或非共同的甲基化模式决定的。总体而言，酰胺固定相为所有研究的对提供了最高的分辨率值。

考虑到当甲基化的腺苷位于RNA序列的不同位置时形成的位置异构体的分离能力，所有固定相提供的分辨率都非常有限（Rs < 0.5）（图S3），表明所测试的色谱维度可能不足以揭示这一特征。

基于以上所有信息，选择了GTxResolve BEH Amide固定相用于后续的方法开发和优化，以进一步增强基于甲基化数量的分离能力。其卓越的性能可能反映了固定相化学性质和柱子形态（包括粒径和孔径）的综合效应。

3.1.2. 操作条件的优化

在选择了酰胺相后，优化了操作条件以提高甲基化形式之间的分辨率，同时保持与质谱的兼容性。采用了一次一个因素的策略来评估：(i) 醋酸铵（Amm Ac）浓度在25-100 mM范围内，(ii) 柱温在30-90°C范围内，以及(iii) 在三个值（0.1%、0.2%和0.5%）下评估的标准化梯度斜率。这些条件范围是基于之前使用酰胺固定相分析寡核苷酸的研究[15],[16]选择的。主要使用无甲基化和单甲基化FLP（1Me/0Me）以及单甲基化和二甲基化FLP（2Me/1Me）之间的分辨率（Rs）来评估这些参数。

将醋酸铵浓度从25 mM增加到100 mM（图S4a）对两种对（1Me/0Me和2Me/1Me）的分辨率略有改善。然而，在这个浓度范围内，选择性基本保持不变（图S4b），这表明甲基选择性主要不受离子强度的控制。相反，选择性反映了N6-甲基化对腺嘌呤的影响。正如Pan等人[38]所解释的，NH2基团转化为NHCH3会降低碱的氢键供应能力并略微降低亲水性。这些变化预计会改变特定的极性相互作用，特别是氢键作用，这可以解释观察到的选择性差异。总体而言，选择了50 mM的盐浓度作为在可接受分辨率和适合避免MS分析中离子抑制的条件之间的最佳折中。

温度从30°C升高到90°C，根据固定相的类型，所有FLP峰的洗脱组成增加了2% A（图S5），但对峰宽值（0.11 ± 0.01 分钟）没有显著影响。因此，分辨率随温度升高而提高，这一行为 juga 由Hao等人[39]所证实。最后，如预期，降低梯度斜率提高了分辨率，在0.1%斜率下，1Me/0Me和2Me/1Me的分辨率分别达到了1.87和1.42（图S6a），此时观察到了最大的峰宽（图S6b）。然而，在这种斜率下，运行时间超过了40分钟。在0.5%斜率下，分辨率降低，紫外检测下的值在1.2到1.5之间。与MS检测联用导致额外的外部方差，因此峰宽增大。分辨率分别降到了1.05和1.09。尽管较低的斜率与较低的噪声相关，但在使用0.5%斜率时信噪比约为10（图S6c）。因此，选择了0.5%的标准化斜率以提供快速的分析。

总之，操作条件确定为：50 mM醋酸铵（Amm Ac），柱温90°C，以及标准化斜率0.5%，如果需要更高分辨率，则可以降至0.1%。这些选定的条件与MS联用完全兼容，并且与最近的寡核苷酸样本HILIC研究[29]一致。

3.2. miR-K11的表征

3.2.1. 用于杂质分析的HILIC-MS

固相RNA合成的偶联反应本质上是不完全的，导致96-98%的偶联产率。这会产生一种含有多个截短片段（n-1, n-2…）的粗产品，这些片段在治疗性RNA中被视为关键的质量属性，并且在生物环境中生成的miRNA短片段中也很常见[40]。因此，在研究和工业质量控制中都需要将这些片段与全长n-mer分离。基于此背景，选择了未纯化的miRNA样本进行分析。如图2所示，对FLP-native序列合成得到的粗样本进行分析后，可在不到20分钟内实现miRNA短片段基于长度的分离。对于每对连续的短片段（S04-S21），计算了分辨率值，并在图S7中总结了这些值。大多数对的分离质量很高，分辨率通常超过5，有些甚至达到了15。只有少数超过17-mer的对接近基线分离的较低阈值。这种行为与之前的IP-RPLC和HILIC研究结果一致[38],[39]，其中较长序列的分离通常更加困难。尽管如此，FLP峰与其n-1合成杂质S21-native的基线分离是可辨别的，分辨率为1.63，满足质量控制要求。此外，该方法对FLP-native及其短片段显示出良好的重复性，相对标准偏差（RSD）约为0.22%（n=3）。

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图2. K11-native的色谱图显示了在HILIC GTxResolve柱上短片段（Sy，y表示核苷酸数量）与FLP（22-mer）的分离情况，unk表示除短片段外的未知杂质。条件：GTxResolve BEH Amide，50 mM NH4OAc，10-50%A，90°C，斜率0.5%，260 nm处紫外检测。

MS分析证实了基于UV的鉴定结果，每个短片段都在预期的m/z值处被检测到。短片段检测到了少量加合物，而对于FLP，则检测到了两种电荷状态和至少两种钠加合物。保留时间、m/z值和电荷值以及序列信息详见表S1。

3.2.2. 用于甲基化miRNA分离的HILIC-MS

虽然一些出版物报道了基于序列长度的分离，但很少有研究关注仅在某个或两个碱为了应对这一挑战，评估了串联质谱（MS/MS）技术。3.2.3. 用于异构体区分的HILIC-MS/MS技术得益于明确定义的序列合成（表1）以及已知短链分子之间能够相互分离的事实，通过对每个未纯化的合成批次进行HILIC-MS/MS分析，建立了一个实验性碎片数据库。根据McLuckey的命名法[43]确定了预期的MS2碎片（见图S8），并使用Mongo Oligo Mass计算器生成了它们的理论m/z值。提取的离子色谱图（EIC）证实了这些碎片在相应的保留时间处的存在，如图S9所示。为了增强这些特定碎片的检测效果，优化了MS条件。首先评估了碰撞能量以产生尽可能多的碎片（见图S10）。对于FLP-native来说，当碰撞能量为35 V和75 V时，获得了最多的预期碎片。在50 V至110 V的高能量范围内，也观察到了大量非特异性或次级碎片，这增加了光谱解析的复杂性。因此，选择35 V作为最佳碰撞能量，因为它可以在最小化不需要的离子的同时获得目标碎片。这些观察结果与之前关于寡核苷酸MS/MS的研究一致，例如Galwig等人[44]的研究强调了碰撞能量对碎片化行为的显著影响。然而，需要注意的是，碰撞能量取决于具体的仪器和碰撞细胞，因此这里报告的值不能直接与其他作者的结果进行比较。

然后，根据m6A在序列中的位置以及三天分析过程中这些碎片的可重复检测性，为每个ON异构体选择了特定的碎片。结果，建立了一个包含超过3个特定碎片的数据库（表S3），这些片段的甲基化位于FLP序列的5’端或3’端附近，分别是FLP-m6A3、FLP-m6A22和FLP-m6A3,22。检测到的碎片主要是a-B、d-H2O、y和w类型，这些类型在寡核苷酸CID碎片化中最为常见[24]、[42]。然而，高能量促进的CID碎片化途径会导致靠近序列末端的骨架断裂，因此无法观察到序列内部的碎片。这使得FLP-m6A10和FLP-m6A10,22缺乏位置特异性的碎片（见图S11）。为了克服这一限制，使用决策树流程区分了miR-K11的异构体。图4展示了1Me异构体的决策树。虽然miR-K11理论上可以在四个潜在位置发生甲基化（A3、A4、A10和A22），但这里只考虑了A3、A10和A22异构体。首先，通过检查前体离子的保留时间和m/z值确认miR-K11异构体含有一个m6A。然后，使用EIC检查a4-B、a6-B和d6-H2O碎片（参见图S8中的命名法）。这些离子中的甲基化表明m6A位于序列的5’区域，因此对应于K11-m6A3。为了进一步确认这一分配，进行了额外的验证，其中碎片w3证实了序列3’端没有甲基化。

如果甲基化不位于序列的5’区域，下一步就是寻找K11-m6A22的特异碎片。这些片段的检测确认了甲基化发生在3’末端（A22）。在没有这些片段的情况下，继续搜索相同的碎片离子（a4-B、a6-B和d6-H2O、w3等），但以它们未被修饰的天然形式，从而确认这些位置没有甲基化。结合含有m6A10的a14-B片段的检测结果，这一模式识别出了异构体K11-m6A10。对于在22位点有甲基化但在3位或10位点有额外m6A的2Me miR-K11异构体，也设计了相同的决策流程（见图S12）。

在分析混合物中的位置异构体时，可能会遇到分析方法的行为问题，这种情况在生物系统中可能发生。通过分析K11-m6A3和K11-m6A22的混合物（Mix 1）模拟了这种情况。正如预期的那样，FLP以17.02分钟的单一峰形式共洗脱，这对应于一个甲基化的存在，前体离子也证实了这一点。然而，跨越共享保留窗口平均的DIA光谱揭示了两组诊断离子，明确指出了每个甲基化位置（见图5）。m/z为360.0711（W1）、625.1522（Y2）和1010.1580（W3）的离子定义了m6A22的存在，而其他三个离子是m6A3特有的。

尽管发生了共洗脱和浓度差异（含有A22的异构体浓度是另一种的两倍），但没有观察到主要离子的抑制，碎片化行为未受影响，因此识别结果没有歧义。实际上，即使在共碎片化的情况下，位置识别仍然稳定，这是Glasner等人[32]报告的其他工作中的一个主要问题。综上所述，这些MS、MS/MS和保留时间数据的结合表明，所开发的HILIC-HRMS方法可以应用于完整的miR-K11样本的分析，即使是在混合物中也能根据甲基化状态和位置进行明确的区分。

3.3. 含有多种甲基化数量的寡核苷酸混合物为了验证所提出方法的多功能性，将该识别策略应用于粗测miRNA批次的混合物。第一个案例报道了含有0到2个甲基化的4聚体到22聚体序列的等摩尔混合物的分离（Mix 2），而后者案例分析了K11-m6A10、K11-m6A3和K11-native的混合物，其中K11-m6A3和K11-native被过载，以引入浓度偏差（Mix 3）。对含有零个、一个或两个修饰的等摩尔混合物（Mix 2）的分析显示，每种甲基化状态都对应一个明显的色谱峰（见图6），证实了可以通过色谱保留时间区分甲基化数量和序列长度。36个短链分子和三个主要峰（FLP）的保留时间在混合物中与单独注射时相同，相对标准偏差（RSD）值分别为FLP-native为0.04%、FLP-m6A22为0.08%、FLP-m6A10,22为0.08%。所有短链分子的分辨率都超过了1，除了单个m6A甲基化增量，1Me和0Me miR-K11之间的分辨率为1.2，2Me和1Me全长度序列之间的分辨率为1.4。峰的分配再次通过MS数据得到确认。电荷z = 5-时的EIC（见图S13）也证实了FLP-native序列（0Me，tR 17.30分钟）展示了一个钠加合物[M – 6H + Na] 5-，其m/z与两个甲基化FLP（2Me，tR 16.60分钟）的主要离子相同，这说明了色谱保留数据对于明确识别的绝对必要性。

在Mix 2上应用决策树流程后，能够准确识别每种甲基化状态的异构体，即K11-m6A10,22为两个甲基化的ON，K11-m6A22为一个甲基化的ON。这些分配得到了在长度和m6A修饰数量不同的miRNA等摩尔混合物中观察到足够强度的特异片段的支持。引入浓度偏差后，如预期，由于分子对色谱柱吸附位的竞争，过载峰出现了前置现象。2Me过载序列的峰顶位置移动了0.43分钟，峰宽从0.12分钟增加到0.35分钟，并且出现了拖尾现象和峰对称性的显著恶化（美国药典（USP）10%不对称性从1.97增加到3.16）。1Me和0Me序列也略有影响，保留时间分别移动了0.11分钟，峰宽从0.12分钟增加到0.17分钟，而USP 10%的值分别从1.36减少到0.99和从1.30略微增加到1.40。通过决策树进行的位置分配没有受到浓度差异的影响，与片段强度比不同。一个甲基化的FLP-m6A3是通过含有位置3的甲基的特定片段a6-B识别出来的，而两个甲基化的FLP-m6A10,22是通过存在的甲基化Y2片段识别出来的（见图S14）。还观察到，EIC中的甲基化片段Y2仅在16.14分钟处显示一个峰，这是两个甲基化序列的保留时间，而在16.90分钟处没有峰，这证实了后者在5’端没有甲基化。同样，a6-B片段也是特定的，它在位置3有甲基化，但在16.14分钟处没有出现峰，证实了两个甲基化序列在位置3没有甲基化。

4. 结论在这项研究中，开发了一种基于HILIC-HRMS/MS的方法来表征甲基化的miRNA，使用病毒miR-K11序列进行分析。该色谱方法能够基于序列长度和m6A修饰的总数量（最多22个核苷酸）实现高分辨率的分离。此外，HILIC提供了适合MS的条件，可以直接对复杂混合物进行MS/MS分析。因此，通过优化的CID碎片化和基于特定片段的决策树工作流程，可以自信地区分m6A修饰的miR-K11的位置异构体，建立了一种自上而下的分析方法，不需要预先消化、离子配对试剂或依赖片段强度比策略。该方法在复杂条件下表现出良好的稳定性，例如非等摩尔混合物和共洗脱的异构体。总体而言，HILIC-MS/MS工作流程提出了一种稳健的方法，可以在不到20分钟的时间内同时评估序列完整性、杂质和位置特异性的碱基修饰。总之，这种集成的HILIC-MS/MS策略展示了HILIC应用于miRNA全面表征的分析能力，并为其在生物样品（如血浆和血清）中的应用开辟了新的前景。

未引用的参考文献[27]、[28]、[31]、[41]、[45]

CRediT作者贡献声明：
Sébastien Pfeffer：撰写 - 审稿与编辑、验证、资金获取。
Karine Faure：撰写 - 审稿与编辑、项目管理、方法学、资金获取、概念化。
Khaoula Adouairi：撰写 - 初稿写作、可视化、验证、研究、数据管理。
Carole Chaix：撰写 - 审稿与编辑、监督、资金获取。
Carole Farre：验证、资源支持。