慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征中免疫功能障碍的表观遗传调控

《PROSTATE》：Epigenetic Regulation of Immune Dysfunction in Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome

**摘要**

**背景**
慢性前列腺炎/慢性盆腔痛综合征（CP/CPPS）是一种常见的且具有破坏性的疾病，其病因尚不明确。越来越多的证据表明免疫调节紊乱与其发病机制有关，但免疫调节受损的分子机制仍不十分清楚。本研究探讨了PBMC群体中的免疫反应改变以及DNA甲基化在CP/CPPS发病机制中的作用。

**方法**
来自CP/CPPS患者和健康对照组的前列腺按摩后尿样本（称为排尿后膀胱3期尿，VB3尿）被用于分析CD4+ T细胞标志物和定义细胞谱系的转录因子。利用靶向甲基化阵列对外周血单核细胞（PBMCs）和纯化的CD4+ T细胞进行了DNA甲基化分析。功能实验评估了在lipopolysaccharide（LPS）刺激下IL10的产生情况，其中部分实验使用了DNA甲基转移酶抑制剂azacitidine（AZA）来逆转甲基化依赖性的基因沉默。通过实验性自身免疫性前列腺炎（EAP）小鼠模型评估了这些发现的临床相关性。

**结果**
CP/CPPS患者的VB3尿样本显示CD4相关转录因子水平升高，包括RORγT的表达增加。DNA甲基化分析发现了IL10、FOXP3、ITGAL和TNF-α等免疫调控基因位点上的甲基化差异。PBMCs在LPS刺激下IL10分泌减少，但这种减少可通过AZA治疗得到恢复。在EAP模型中，重组IL10的给药未能减轻盆腔痛觉过敏，而AZA显著降低了疼痛敏感性。

**结论**
CP/CPPS与免疫调控基因的表观遗传改变有关，这些改变可能影响炎症反应。药理学上的DNA甲基化抑制作用在体外增强了IL10的反应，并在体内减少了疼痛行为，这支持将去甲基化疗法作为治疗慢性前列腺炎症和盆腔痛的潜在策略。

---

**1. 引言**
慢性前列腺炎/慢性盆腔痛综合征（CP/CPPS）是泌尿系慢性盆腔痛综合征（UCPPS）谱系中的一种常见疾病，主要发生在成年男性中[1-3]。尽管其发病率高且对生活质量有影响，但其确切的病因和发病机制仍不清楚。该疾病通常通过排除其他可能性来诊断，其特征是持续性的盆腔疼痛，常伴有下尿路症状和性功能障碍。过去二十年中，提出了多种解释CP/CPPS病理生理学的假说，包括自身免疫、激素失衡和盆底功能障碍[4]。最近的神经影像学研究发现了CP/CPPS患者大脑中神经元密度和功能连接性的变化，但尚不清楚这些变化是主要原因还是身体其他部位病理变化的继发反应[5]。动物模型实验表明，针对前列腺的免疫反应足以引发盆腔疼痛和排尿功能障碍的典型症状[6-11]。尽管具体的免疫触发因素不同（有些涉及IFN-γ驱动的通路[12]，有些则涉及IL17介导的反应[7, 9, 12, 13]），但所有模型中的一个共同特征是适应性免疫的激活，特别是T细胞介导的炎症。在慢性免疫介导的疾病中，越来越多的证据表明表观遗传修饰在塑造免疫易感性方面起着重要作用。表观遗传机制，包括染色质重塑、非编码RNA和DNA甲基化，可以在不改变DNA序列的情况下调控基因表达，并对发育、代谢和环境因素作出响应[14, 15]。其中，DNA甲基化是研究最广泛的机制之一，它涉及CpG岛内胞嘧啶残基的共价修饰，由DNA甲基转移酶（DNMTs）催化，并通过甲基-CpG结合蛋白解读[16-19]。异常的DNA甲基化模式通过破坏免疫耐受或促进炎症基因表达而与多种病理状态相关[20]。全表观基因组关联研究（EWAS）将甲基化变化与环境暴露（如化学毒素和吸烟）以及以慢性炎症为特征的疾病（包括炎症性肠病、阿尔茨海默病、癌症和糖尿病）联系起来[21-24]。在各种慢性疼痛情况下，DNA甲基化被证实是长期维持疼痛的关键调节因子[25]。外周神经损伤和其他持续性疼痛模型显示，在控制神经传导、细胞内信号传导和免疫通路的启动子区域存在协调的甲基化变化，甲基化通常与mRNA表达反向相关，并与疼痛强度相关[26]。重要的是，T细胞甲基化特征与前额叶皮层中的疼痛相关特征有显著重叠，紧凑的T细胞甲基化图谱可以分类神经病理性疼痛并预测机械性超敏反应[26]。这些发现表明外周免疫细胞是了解中枢疼痛生物学的重要窗口，同时也强调了甲基化编码状态作为疾病修饰的可操作目标[25, 26]。基于这些观察，我们假设异常的DNA甲基化导致了CP/CPPS中观察到的免疫失衡。进一步推测，这些变化主要影响免疫调节通路。这一推测基于以下观察：多种不同的促炎机制（包括IL17和IFN-γ）可以在动物模型中诱导盆腔疼痛，这表明调节机制的失败可能是慢性疾病持续存在的共同决定因素。

---

**2. 方法**
2.1 研究人群和样本收集
通过西北大学Feinberg医学院泌尿科的医生推荐、广告以及ClinicalTrials.gov平台（NCT01676857、NCT03167216、NCT05185180），招募了年龄≥18岁、健康或之前被诊断为III型CP/CPPS的男性参与者。CP/CPPS患者的入选标准是在过去6个月内持续存在盆腔疼痛或不适，且国家卫生研究院-慢性前列腺炎症状指数（NIH-CPSI）总分≥12/43。Dr. A. Schaeffer及其同事在伊利诺伊州芝加哥的西北纪念医院泌尿科门诊收集了问卷数据、排尿后膀胱3期尿（VB3尿）和血液样本。西北大学机构审查委员会（Panel D）批准了相关协议（IRB STU00030121、STU00202831和STU00215831），所有参与者均提供了书面知情同意。不同CP/CPPS组和对照组的年龄分布没有统计上的显著差异（表1）。研究中未根据CP/CPPS亚型对参与者进行区分。2025年美国泌尿学会男性慢性盆腔痛（CP/CPPS）指南指出，尽管该疾病传统上分为炎症性（NIH IIIA型）和非炎症性（NIH IIIB型）亚型，但“没有证据表明这两组患者表现出不同的症状或对治疗的反应不同”[27]。因此，本次分析未进行亚型分层。本研究未控制患者的用药情况，因为参与者是在常规临床护理过程中招募的，且治疗暴露情况具有多样性。这些变量可能成为混杂因素，也是本研究的局限性。

**2.2 定量实时PCR (qPCR)**
使用Tritazol试剂（Invitrogen）从VB3尿中提取总RNA，并按照制造商的方案使用qScript cDNA SuperMix（QuantaBio）进行反转录。qRT-PCR反应使用PerfeCTa SYBR Green SuperMix（QuantaBio）进行，并在CFX Connect Real-Time PCR系统（Bio-Rad）上进行。选择了特异性扩增人类CD4（正向序列-CCTCCTGCTTTTCATTGGGCTAG，反向序列-TGAGGACACTGGCAGGTCTTCT Origene）、T-bet、GATA-3、RORγT和FOXP3的引物。GAPDH被用作内参基因进行标准化。相对转录水平通过2?ΔΔCt方法计算，并根据GAPDH表达进行归一化，随后使用GraphPad Prism软件进行数据可视化和统计分析。在VB3尿分析中，选定标志物的表达 également 相对于CD4转录水平进行评估，以估计混合样本中的免疫相关表达。

**2.3 CD4 T细胞提取**
PBMCs在标准冷冻介质中冷冻保存，并存储在液氮中以备后续使用。为了富集CD4+ T细胞，PBMCs被解冻、洗涤并检测细胞活力。根据制造商说明，使用EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit（STEMCELL Technologies）进行富集。根据试剂盒验证数据，预期纯度超过90%；使用对照PBMC样本的初步实验表明纯度范围约为90%–95%。由于样本数量有限，未对每个样本进行常规纯度验证。纯化的细胞在干冰上运输至EpigenDx（马萨诸塞州霍普金顿）进行甲基化分析。

**2.4 DNA甲基化研究**
使用定制的下一代亚硫酸盐测序（tNGBS）面板NGS070V3和NGS178（EpigenDx，表2）进行DNA甲基化分析，这些面板用于检测免疫相关基因（包括FOXP3、IL10、IL17、IFNγ和ITGAL）的调控区域。从细胞沉淀中分离的基因组DNA使用M消化缓冲液（最终浓度2×）和5–10 μL蛋白酶K（20 mg/mL）在65°C下孵育≥2小时。然后使用EZ-96 DNA Methylation-Direct Kit（Zymo Research）在46 μL洗脱缓冲液中对其进行亚硫酸盐转化。转化后的DNA使用多重或单程PCR反应扩增，反应条件包括0.5 U HotStarTaq DNA聚合酶（Qiagen）、0.2 μM引物和3 μL模板DNA（20 μL反应体系）。PCR循环条件为：95°C加热15分钟；45个循环，每个循环95°C 30秒、退火温度30秒、68°C 30秒；最后68°C加热5分钟。PCR产物使用QIAxcel Advanced系统进行验证，按样本合并后使用QIAquick PCR纯化柱或板进行纯化。序列文库使用EpigenDx的定制方案制备，用AMPure XP珠纯化，条形码标记并等摩尔混合。模板制备和富集在Ion Chef系统上完成，随后在Ion S5平台上进行测序。

**2.5 细胞培养研究**
PBMCs在37°C的水浴中解冻，并用预温的RPMI 1640培养基稀释。为了富集CD4+ T细胞，PBMCs被解冻、洗涤并检测细胞活力。根据制造商说明，使用EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit进行富集。根据试剂盒验证数据，预期纯度超过90%；使用对照PBMC样本的初步实验表明纯度范围约为90%–95%。由于样本数量有限，未对每个样本进行常规纯度验证。纯化的细胞在干冰上运输至EpigenDx进行甲基化分析。

---

**2.6 定量实时PCR (qPCR)**
从VB3尿中提取总RNA，并使用Tritazol试剂（Invitrogen）和qScript cDNA SuperMix（QuantaBio）进行反转录。qRT-PCR反应使用PerfeCTa SYBR Green SuperMix（QuantaBio）制备，并在CFX Connect Real-Time PCR系统（Bio-Rad）上进行。根据先前发表和验证的引物集选择了特异性扩增人类CD4（正向序列-CCTCCTGCTTTTCATTGGGCTAG，反向序列-TGAGGACACTGGCAGGTCTTCT Origene）、T-bet、GATA-3、RORγT和FOXP3的引物。GAPDH作为内参基因进行归一化。相对转录水平通过2?ΔΔCt方法计算，并使用GraphPad Prism软件进行数据可视化和统计分析。在VB3尿分析中，选定标志物的表达也相对于CD4转录水平进行评估，以估计混合样本中的免疫相关表达。IL10水平是使用Quantikine Human IL10 ELISA Kit（R&D Systems，目录编号D1000B）根据制造商的说明进行量化的。对于体外甲基化抑制研究，将PBMC用1 μM的DNMT抑制剂阿扎胞苷（AZA）处理48或96小时，然后分离总RNA并使用qRT-PCR检测IL10的表达。

2.6 实验性自身免疫性前列腺炎（EAP）中的治疗研究
CP/CPPS是使用患有实验性自身免疫性前列腺炎（EAP）的小鼠模型来模拟的，如先前所述[11]。动物实验程序获得了西北大学动物护理和使用委员会的批准。简而言之，5-7周大的雄性NOD/ShiLtJ小鼠通过皮下注射100 μg的大鼠前列腺抗原（与TiterMax Gold佐剂以1:1的比例混合，GA 30093）在第0天进行免疫，并在28天内发展为自身免疫介导的前列腺炎症。通过von Frey纤维测试在第0天、7天、14天、21天和28天后对 pelvic区域机械性痛觉过敏的变化进行行为评估。为了评估IL10的治疗效果，从第22天到第27天，小鼠每天接受1 μg重组小鼠IL10的腹腔注射，溶于100 μL PBS中，而对照组则接受溶剂注射（无菌PBS）。对于AZA的治疗评估，5-7周大的雄性C57BL/6J小鼠被允许发展成EAP，并在EAP发生后的第28天通过腹腔注射5-AZA（A3666，Sigma）以2.5 mg/kg的剂量开始治疗。注射每天重复进行7天。在EAP开始时以及治疗计划开始和结束时，通过von Frey纤维测试对 pelvic区域机械性痛觉过敏的变化进行行为评估。

2.7 统计分析
统计分析是使用GraphPad Prism（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行的。每个实验中使用的统计测试在图例中标明（在大多数图中，每个点代表单个患者/动物）。除非另有说明，数据以平均值±标准误差的形式呈现。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

3 结果
3.1 在CP/CPPS患者的VB3尿液沉淀物中检测到的与免疫相关的转录特征
为了评估局部适应性免疫反应，我们对CP/CPPS患者（n=24）和健康对照组（n=4；NU IRB STU00030121）的VB3尿液沉淀物中的CD4+ T细胞相关转录本进行了分析。尽管VB3沉淀物中的免疫细胞数量有限，无法使用流式细胞术等分析方法，但qRT-PCR显示CP/CPPS样本中的CD4 mRNA表达显著增加（p=0.0154；图1a），这与VB3沉淀物中CD4相关转录本的丰度增加一致。为了进一步探索与免疫相关的转录特征，我们研究了谱系定义的转录因子——TBET（Th1）、RORγT（Th17）、GATA3（Th2）和FOXP3（Treg）的表达，这些转录因子相对于CD4的表达进行了标准化。在这些因子中，RORγT在患者中显著上调（p=0.0041；图1b-e），而TBET、GATA3和FOXP3在组间没有表现出一致差异。值得注意的是，表达谱显示出个体间的显著异质性。Z分数分析显示，相对于对照组均值，某些患者亚组的RORγT和GATA3表达升高，而FOXP3和TBET表达降低（图1f）。这些发现表明，CP/CPPS患者的VB3沉淀物中可以检测到异质性的与免疫相关的转录特征。

3.2 CP/CPPS患者PBMC中的异常DNA甲基化特征
为了确定CP/CPPS中的系统性免疫失调是否与表观遗传改变有关，我们使用针对调节性免疫基因的靶向甲基化阵列分析了CP/CPPS患者（n=10）和年龄匹配的健康对照组（n=10）的PBMC。多个位点的DNA甲基化在患者和对照组之间显示出显著差异。IL10启动子区域在-387、-385和-355碱基对（bp）处的三个CpG位点发生 hypermethylation（图2）。这与先前研究中观察到的这种抗炎细胞因子的表达减少一致[29]。此外，在PDL2和MYC中也检测到额外的hypermethylation，而CD274（PD-L1）、ITGAL（LFA-1）和TNF-α位点则表现出hypomethylation（图2）。尽管单个CpG位点的甲基化差异较小，但整体模式表明几个免疫相关位点存在一致的甲基化差异。这些数据支持CP/CPPS中存在系统性表观遗传改变，这可能有助于解释报道的促炎免疫表型。

3.3 纯化CD4+ T细胞中的靶向甲基化分析
鉴于CD4+ T细胞在CP/CPPS发病机制中的核心作用[10, 11]，我们接下来检查了在PBMC中观察到的DNA甲基化改变是否与这一细胞亚群有关。使用针对调节性免疫位点的靶向甲基化阵列分析了来自另一组CP/CPPS患者（n=9）和年龄匹配的健康对照组（n=8）的纯化CD4+ T细胞。与之前的PBMC结果一致，CP/CPPS患者的CD4+ T细胞中的IL10启动子甲基化有所增加（图3）。此外，在Foxp3基因的保守非编码序列（CNSs）中观察到启动子超甲基化，这些序列是诱导和稳定Foxp3表达的关键功能增强元件[30]。在CNS1中观察到超甲基化，该区域包含转化生长因子-β（TGF-β）反应元件，这有助于胸腺外Treg细胞的生成和黏膜免疫耐受[31]，以及在CNS2中观察到超甲基化，该区域负责应对T细胞受体（TCR）刺激的Foxp3稳定性[32]。这些FOXP3的变化在批量PBMC中并未显现，表明这些调节性损伤在混合免疫细胞群体中被掩盖了。来自CP/CPPS患者的CD4+ T细胞还在TOLLIP和S100A6基因上表现出增加的甲基化，这些基因参与先天免疫和炎症调节。这些发现表明，CP/CPPS患者的CD4+ T细胞在选定的免疫调节位点上表现出表观遗传差异。

3.4 IL10启动子甲基化增加的功能相关性
为了确定IL10表达是否受到表观遗传调控，我们用DNMT抑制剂AZA处理了来自健康捐赠者的PBMC。AZA处理导致IL10 mRNA表达的时间依赖性增加，表明IL10表达可能受到DNA甲基化药理抑制的影响（图4a）。因为IL10通常是由促炎刺激诱导的，用于抑制正在进行的免疫反应，我们接下来评估了CP/CPPS患者中观察到的IL10启动子甲基化增加的功能影响。健康对照组的PBMC对脂多糖（LPS）刺激产生强烈的IL10反应，而CP/CPPS患者的PBMC则表现出明显的IL10反应减弱（图4b）。这些发现表明，在CP/CPPS患者的混合PBMC群体中，诱导IL10表达的能力存在潜在差异。

3.5 在EAP模型中验证表观遗传疗法的体内效果
为了确定通过去甲基化恢复调节功能是否可以减轻体内盆腔疼痛，我们在雄性NOD/ShiLtJ小鼠的EAP模型中进行了验证，这是一个公认的CP/CPPS的小鼠模型。小鼠被注射前列腺抗原并发展为慢性盆腔疼痛，通过von Frey测试量化。从疾病第22天开始给予重组IL10治疗并未改变疼痛反应频率（图5a），表明一旦建立了调节缺陷，单独的细胞因子补充是不够的。在使用C57BL6/J小鼠的单独实验中，我们重现了EAP模型，并证明了从EAP后第28天开始用DNMT抑制剂AZA治疗可以在一周内显著减轻盆腔痛觉过敏（图5b）。这些数据提供了概念验证的证据，表明药理抑制DNA甲基化可能减少EAP模型中的盆腔疼痛行为，并表明表观遗传修饰可能影响炎症疼痛反应。

4 讨论
emerging证据表明，表观遗传机制，特别是DNA甲基化，对CP/CPPS的发病机制有贡献。先前的研究确定了与雌二醇水平升高[33]、精子DNA片段化和精胺比例改变[34]以及CP/CPPS队列中差异性神经炎症基因表达[35]相关的雌激素受体基因（ESR1/ESR2）的hypermethylation。然而，免疫细胞内表观遗传变化的功能意义仍需进一步探索。我们的研究通过识别与CP/CPPS相关的IL10和FOXP3的免疫相关甲基化改变来探讨这一问题。我们的发现显示，在前列腺按摩后的尿液中CD4+表达增加以及RORγT升高，这与先前研究中认为IL17参与CP/CPPS发病机制的研究结果一致[9]。我们确定了IL10启动子多个CpG位点的甲基化增加，这可能影响这种关键抗炎细胞因子的表达。这一发现得到了先前研究的支持，即CP/CPPS患者中产生IL10的基因型频率较低（30.6% vs 12.1%，p=0.007），这与炎症和治疗反应相关[29]。ITGAL启动子的hypomethylation表明白细胞粘附能力增加，而PDL2、TNF-α和MYC的甲基化改变表明更广泛的炎症激活谱型。有趣的是，在PBMC中没有检测到FOXP3的甲基化变化；然而，纯化的CD4+ T细胞在CNS1和CNS2显示出超甲基化——这些区域对FOXP3表达和Treg稳定性至关重要。我们还在TOLLIP和S100A6基因中观察到一致的甲基化变化，这些基因与先天免疫和炎症有关。这些模式表明不同的免疫细胞亚群对CP/CPPS的病理生理学有贡献。比较PBMC和CD4+ T细胞突显了细胞类型分辨率的重要性，因为一些炎症基因的甲基化变化似乎是非CD4+细胞群体所特有的。免疫调节位点的超甲基化和hypomethylation都可能反映免疫调节的改变，而不仅仅是单向抑制。AZA处理后IL10表达增加，表明DNA甲基化可能影响其表达。此外，在LPS刺激后，CP/CPPS患者的IL10诱导减弱。在体内，重组IL10未能逆转小鼠模型中的盆腔疼痛，而AZA显著改善了疼痛敏感性，这表明针对甲基化的治疗可能比补充细胞因子具有潜在的治疗益处。这些发现应被视为关联性的，因为在AZA治疗前后没有直接测量同一样本的甲基化状态。这些发现与其他自身免疫性疾病的研究结果一致。IL10启动子的高甲基化与多种自身免疫性疾病（包括SLE和RA）中细胞因子表达减少有关[36]。同样，FOXP3在TSDR（Treg特异性去甲基化区域）的高甲基化会损害RA及其他免疫和非免疫疾病中的Treg功能[37, 38]。我们的发现支持这样一个观点：CPPS具有与其他慢性炎症性疾病相同的免疫表观遗传特征，可能反映了全身性的调节紊乱，而不仅仅局限于盆腔区域。最近的研究，包括MAPP研究网络，强调了“广泛性”的概念，表明一部分UCPS患者会经历多部位疼痛，并与其他慢性疼痛和自身免疫性疾病（如纤维肌痛、肠易激综合症和慢性疲劳综合症）有重叠[39-42]。我们识别的表观遗传改变，尤其是在IL10和FOXP3等调控基因中的改变，可能定义了一组具有更广泛免疫功能障碍的患者。先前的研究表明，这些患者通常有较高的全身炎症水平和更多的盆腔外症状[43, 44]。未来的研究应评估这些表观遗传特征是否在伴有自身免疫疾病的UCPS患者中更为明显，这将有助于阐明免疫失调、表观遗传调控与UCPS中广泛出现的临床表现之间的联系。这些研究将有助于揭示潜在机制，并根据作用机制来指导UCPS的未来临床试验设计[45]。在解释这些研究结果时，应考虑几个局限性：患者群体具有异质性，VB3沉淀物和PBMC制备物中含有多种细胞类型，因此转录本和甲基化谱可能反映了综合的免疫特征，而不是特定细胞类型的调节；此外，未在同一细胞群体中评估甲基化状态与功能基因表达之间的直接相关性；最后，动物研究是在炎症性疼痛模型中进行的，可能无法完全反映人类CPPS的复杂性。未来需要在更大、特征明确的患者群体中进行更多研究，并结合补充的机制模型，以更精确地定义表观遗传调控在CPPS发病机制中的作用。

作者贡献：
Praveen Thumbikat：负责研究设计、数据分析及手稿撰写。
Goutham Pattabiraman：参与研究并分析数据。
Farzaneh Sharifzad：参与研究并分析数据。
Catherine V. Osborn：参与研究并分析数据。
Stephen F. Murphy：参与研究并分析数据。
Yongyong Yang：参与研究并分析数据。
Zhiqiang Liu：参与研究并分析数据。
Qi Cao：参与研究并审阅手稿。
Anthony J. Schaeffer：参与研究并审阅手稿。

致谢：
本项工作得到了美国国立糖尿病、消化系统疾病和肾脏疾病研究所（NIDDK）的资助，项目编号为R01DK108127和R01DK124460（资助对象为Praveen Thumbikat）。资助方对研究设计、数据收集与分析、发表决定以及手稿准备没有参与。

伦理声明：
西北大学机构审查委员会（Panel D）批准了相关方案（IRB STU00030121、STU00202831和STU00215831）。所有动物实验程序均得到了西北大学动物护理和使用委员会的批准。

知情同意：
所有参与者均提供了书面知情同意书。

利益冲突：
作者声明无利益冲突。

数据可用性声明：
本研究期间生成的数据可应要求提供。临床数据在提供时将遵循西北大学IRB制定的协议指南。