《Journal of Extracellular Biology》：The Proteo-Transcriptome of Extracellular Vesicles and Particles Is Largely Preserved After Cryopreservation
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细胞外囊泡与颗粒（Extracellular vesicles and particles, EVPs）是含有蛋白质、脂质和核酸的小脂质双分子层膜结构，在肿瘤发生、转移和免疫调节中发挥关键作用。冷冻组织能在多大程度上忠实反映新鲜组织的生物学特性仍不清楚。为了解
细胞外囊泡与颗粒（Extracellular vesicles and particles, EVPs）是含有蛋白质、脂质和核酸的小脂质双分子层膜结构，在肿瘤发生、转移和免疫调节中发挥关键作用。冷冻组织能在多大程度上忠实反映新鲜组织的生物学特性仍不清楚。为了解决这一问题，研究人员分析了人类组织中EVP货物的蛋白质转录组学差异。首先，研究人员结合超滤（Ultrafiltration, UF）和尺寸排阻色谱（Size-exclusion chromatography, SEC）从癌症患者的肿瘤及癌旁正常组织中提取了EVPs。随后，利用光谱学方法分析了蛋白质和RNA含量。此外，研究人员利用Olink平台和混合效应模型研究了新鲜与冷冻样本间蛋白质含量的差异。结果显示，冷冻保存对EVPs的蛋白质浓度、粒径及蛋白质转录组学特征影响甚微。这些发现支持了利用冷冻标本进行EVPs研究的可行性，这有望扩大对储存冷冻标本的大型生物样本库（Biobanks）的利用，减少对新鲜组织样本的过度依赖，从而克服人类研究中的一个主要障碍。
该研究针对组织来源的细胞外囊泡与颗粒（EVPs）在冷冻保存后的分子完整性这一核心科学问题展开了深入探讨。研究背景源于获取新鲜临床组织样本在癌症研究中面临巨大挑战，尤其是单细胞测序等技术对样本处理时效性要求极高，通常迫使样本必须冷冻保存。尽管已有研究关注生物流体（如血浆、血清）来源的EVPs在冻融过程中的稳定性，但对于组织源性EVPs，冷冻保存是否会影响其货物组成（Cargo composition）及下游分析结果，此前缺乏系统性数据支持。此外，现有组织EVP分离方法多依赖于新鲜组织，且鲜有直接比较新鲜与冷冻组织来源EVPs在下游应用中货物特征的平行研究。因此，明确样本存储条件对EVP cargo的影响，对于利用大型生物样本库资源推动转化医学研究至关重要。为此，研究人员设计了平行对照实验，旨在阐明冷冻保存对组织源性EVPs蛋白质与RNA谱系的真实影响，验证利用存档冷冻样本进行EVP研究的可行性。
该研究的关键技术方法主要包括：样本队列来源于经病理确诊的肺癌、前列腺癌和肾癌患者的手术切除标本，共纳入9名患者，收集了11份肿瘤组织和8份癌旁正常组织样本。样本分为新鲜处理组、快速冻融组（frozen-fast）和慢速冻融组（frozen-slow）。EVP分离采用超滤（UF）结合尺寸排阻色谱（SEC）的两步法策略。表征手段包括利用动态光散射（DLS）检测粒径分布，Western blotting检测标志物（CD9、TSG101作为EVP阳性标记，Calnexin作为阴性标记），以及通过Olink平台进行免疫肿瘤学蛋白质组学分析和下一代RNA测序（RNA-seq）。数据分析采用混合线性模型（Mixed linear model）校正临床与技术变量，并通过方差分析评估协变量影响。
研究结果部分详细展示了实验数据与结论：
在“蛋白质和RNA通过超滤富集，尺寸排阻色谱后确认双峰”部分，研究人员通过UF浓缩样本后，经SEC分离得到不同组分。结果显示，所有样本在SEC分离后的第3-4组分（F3-4）和第8-10组分（F8-10）均呈现出明显的蛋白质和RNA浓度双峰分布。重要的是，在UF前后，新鲜组、快速冻融组和慢速冻融组之间的蛋白质或RNA浓度均无统计学显著差异（P > 0.05）。
在“利用动态光散射和Western blotting进行分子表征区分细胞外囊泡（EVs）与细胞外颗粒（EPs）”部分，通过DLS分析发现，F3-4主要包含直径约100 nm的颗粒，而F8-10则主要为直径小于50 nm的颗粒。Western blotting结果符合MiSEV2025指南推荐，证实CD9和TSG101主要富集于F1-4（归类为EVs），而Calnexin主要存在于F5-10（归类为EPs），从而确立了将F1-4定义为EVs、F5-10定义为EPs的分析基础。
在“新鲜与冷冻样本间EVs和EPs的蛋白质或RNA浓度比较”部分，研究进一步量化了不同存储条件下的差异。数据显示，无论是EV还是EP组分，新鲜样本与冷冻样本（包括快速和慢速解冻）在颗粒大小上均无显著差异。同时，各SEC分离组分的蛋白质和RNA浓度在新鲜与两种冷冻方案之间表现出高度相关性（Spearman's rank correlation coefficient），表明冷冻过程并未显著改变EVP的货物载量。
在“EVs和EPs携带独特的RNA谱，EV相关RNA短于200个核苷酸”部分，研究人员通过毛细管电泳和RNA测序深入解析了核酸特征。结果表明，EV和EP组分携带截然不同的RNA谱。EV组分中的RNA主要为短链非编码RNA，长度分布在25至200个核苷酸之间，其中RNY1等Y RNA家族成员表达显著。PCA分析显示EV和EP的转录组完全分离。值得注意的是，尽管冷冻保存导致EV组分中总RNA浓度略有下降，但其RNA的大小分布和完整性在不同存储协议间保持一致。
综上所述，该研究的讨论与结论部分明确指出：本研究首次系统评估了新鲜与冷冻（含快速与慢速解冻）人体组织源性EVPs的蛋白质转录组学特征。研究证实，除了少数标记物外，冷冻保存对组织源性EVPs的蛋白质组学谱影响甚微。具体而言，冷冻保存未显著改变EVP的蛋白质浓度、粒径分布及关键的RNA cargo特征。这一结论通过严格的实验设计，包括使用Olink蛋白panel和RNA-seq技术，并结合混合效应模型分析得到了验证。该研究的重要科学意义在于，它为利用大型生物样本库中广泛存在的冷冻存档组织进行EVP研究提供了坚实的方法学依据和数据支持，证实了冷冻样本可作为新鲜样本的有效替代或补充，从而极大地拓展了EVP相关研究的样本来源，降低了因依赖新鲜组织而产生的 logistical 壁垒，为基于EVP的液体活检和生物标志物发现研究铺平了道路。论文最终发表于《Journal of Extracellular Biology》。
