优势性、毒性但无致死性：探究不同蓝细菌菌株对生物量、蓝细菌代谢产物以及水蚤的反应

《Journal of Phycology》：Dominance and toxicity without lethality: Exploring biomass, cyanometabolites, and Daphnia responses across Cyanobacterial strains

**摘要**

蓝细菌是全球分布广泛的生物组成部分，具有合成多种生物活性化合物的显著能力，其中一些化合物可能对其他生物体和生态系统产生毒性作用。在本研究中，我们主要从欧洲温带淡水环境中分离出丝状蓝细菌菌株（Aphanizomenon、Chrysosporum、Cuspidothrix、Dolichospermum、Planktothrix、Raphidiopsis），以及少量来自北极水域的菌株（Microcoleus、Phormidesmis），并使用免疫测定法和色谱技术对这些菌株中常见的蓝细菌代谢产物进行了定性分析。我们还评估了培养提取物和滤液对大型溞（Daphnia magna）和柔毛溞（Daphnia pulicaria）存活率的影响。结果表明，所测试的菌株具有产生有毒和生物活性化合物的广泛能力。具体来说，我们检测到了anabaenopeptins、anatoxin-a、cylindrospermopsin、microcystins和saxitoxins等化合物。尽管许多菌株在40天的培养后能够产生多种有毒和生物活性化合物并积累大量生物量，但它们的提取物和滤液对溞的存活率几乎没有负面影响。相比之下，对于那些检测出阴性结果的浮游Limnothrix sp.和冰川Microcoelus autumnalis菌株，以及仅检测到anabaenopeptins的Aphanizomenon klebahnii菌株，观察到了显著的致死性。我们还发现，用于制备蓝细菌提取物的生物量与溞的存活率之间存在正相关关系，这一发现引发了关于菌株生长速率与其毒性之间是否存在权衡的疑问。我们的研究扩展了目前对有毒蓝细菌地理分布的了解，并表明其中一些菌株可能还会产生其他尚未鉴定的有毒化合物。

**缩写**

- APs：anabaenopeptins（anabaenopeptins）
- ATX-a：anatoxin-a（anatoxin-a）
- cyanoHABs：蓝细菌有害藻华（cyanobacterial harmful algal blooms）
- CYN：cylindrospermopsin（cylindrospermopsin）
- ELISA：酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay）
- EPS：胞外聚合物物质（extracellular polymeric substances）
- GLMM：广义线性混合模型（generalized linear mixed model）
- HPLC-DAD：高效液相色谱耦合二极管阵列紫外检测（high performance liquid chromatography coupled with diode array UV detection）
- LC-MS：液相色谱耦合质谱（liquid chromatography coupled with mass spectrometry）
- MCs：microcystins（microcystins）
- NOD：nodularin（nodularin）
- PCR：聚合酶链反应（polymerase chain reaction）
- STXs：saxitoxins（saxitoxins）
- TRFIA：非竞争性时间分辨荧光免疫测定（noncompetitive time resolved fluorescence immunoassay）

**引言**

从系统发育角度来看，蓝细菌是地球上最古老、分布最广且多样性最高的自养生物之一。自前寒武纪以来，它们就一直是塑造环境条件的关键生物之一，引发了水圈和大气中的生物地球化学变化（Demoulin等人，2019）。蓝细菌在地球上已经进化并分化了超过30亿年，成为广泛分布的机会主义物种或生态位狭窄的特化物种。至今，这些原核生物可以在各种生态系统中找到，从海洋和淡水环境到陆地栖息地，从地质热液到冰面。许多蓝细菌物种还具有次全球性的分布范围（Padisák，2003）。由于它们具有多种适应性机制，如产生胞外聚合物物质、耐干燥能力、能够在冻融事件中存活等（Carey等人，2012；Chen等人，2021；Dokulil & Teubner，2000；Kvíderová等人，2019），蓝细菌常常在不同生态系统中占据主导地位（Amarouche-Yala等人，2014；Rybak等人，2024；Vincent，2000）。尽管这些生物在从地质早期到现在的主要生态演替过程中作为初级生产者及早期殖民者发挥了关键作用（Zawierucha，2024），但它们的过度繁殖会对生态系统造成危害。人为引起的富营养化加速和气候变化正在改变水生生态系统的生物地球化学特性，使得这些系统更容易受到蓝细菌藻华的影响（也称为cyanoHABs；Huisman等人，2018；Lürling等人，2017）。虽然蓝细菌藻华最频繁和最强烈的发生在夏季富营养化水域（J?hnk等人，2008），但最近也有越来越多关于蓝细菌在寒冷季节（Babanazarova等人，2013；Coffer等人，2020；Lindholm等人，1989；Wejnerowski等人，2018, 2024）和寡营养水域（Cederwall & Cott，2025；Reinl等人，2021）大规模爆发的报告。蓝细菌藻华会导致水质恶化、缺氧区的形成、生物多样性丧失以及宏观和微观尺度的营养网络中断（Havens，2008；Paerl & Otten，2013；Wilk-Wo?niak，2019）。这种破坏会导致生态系统服务质量的下降，并对人类健康、经济和旅游业产生负面影响（Carmichael & Boyer，2016；Hamilton等人，2013）。鉴于蓝细菌藻华的强度、持续时间和范围的长期趋势（Vieira-Lanero等人，2022；Zong等人，2019）以及气候变化的预测（政府间气候变化专门委员会，2023），预计未来的蓝细菌藻华事件将更加严重，并可能有利于有毒基因型的蓝细菌在群落结构中的优势（Mantzouki等人，2018；Walls等人，2018）。根据先前的估计（Chorus，2001；National Rivers Authority，1990），有毒蓝细菌藻华可能占所有藻华事件的25%至75%。在水体中频繁检测到的蓝藻毒素包括microcystins（MCs）、nodularins（NODs）、anatoxin-a（ATX-a）变体、beta-methylamino-L-alanine、saxitoxins（STXs）和cylindrospermopsin（CYNs）——其中一些毒素的作用机制相似，而另一些则有所不同（Codd等人，2017），所有这些毒素都对生物体具有多样化的毒性作用（Krienitz等人，2003；Svir?ev等人，2016）。蓝细菌的其他生物活性次级代谢产物，虽然不被视为毒素，也可能具有毒性作用或至少具有抑制活性，例如anabaenopeptins（APs；Spoof等人，2016）或脂多糖（G?ga?a-Borowska等人，2022）。迄今为止，对环境中蓝细菌的全球监测表明，来自不同属的许多蓝细菌物种都能产生有害化合物。例如，某些Anabaena、Aphanizomenon、Chrysosporum、Dolichospermum、Lyngbya、Oscillatoria、Raphidiopsis和Umezakia物种可以产生细胞毒性生物碱如CYN；而肝毒素如MCs和NODs则更为普遍（Bernard等人，2017）。然而，目前仍存在知识空白，尤其是关于哪些物种能够产生特定有毒/生物活性代谢产物的识别。大部分研究集中在城市化地区或科学中心附近。相比之下，世界上许多栖息地，尤其是冰冻圈生态系统，对于蓝藻毒素和其他有毒化合物仍然知之甚少。值得注意的是，蓝细菌在嗜热（Krienitz等人，2003）和嗜冷（Chrapusta等人，2015；Jungblut等人，2018；Kleinteich等人，2018）环境中都可能具有毒性。尽管新的蓝细菌物种及其形态类型仍在低纬度和高纬度地区被描述（Ka?tovsky，2024），但它们的毒素谱型通常未知。由于测试的菌株数量较少，一些物种的毒性潜力也可能被低估。一些研究显示蓝细菌可能有能力产生其他未知的代谢产物，这些代谢产物可能是导致各种生物实验中观察到的毒性的原因（Davidovi?等人，2023；Falfushynska等人，2021；Hrouzek等人，2016；Tokodi等人，2018）。极地和高山地区正在经历快速变化，包括冰川退缩，这可能导致冰川表面积累的有毒物质释放增加，从而对依赖冰川融水作为饮用水的人群健康构成威胁（Beard等人，2022）。冰川表面（称为cryoconite holes）和冰川前缘（池塘和湖泊）中的水体可能积累各种污染物（Clason等人，2023）。冰川同时也是有机和无机污染物的来源（Buda等人，2024；Makowska-Zawierucha等人，2022）。蓝细菌在冰川及其周边栖息地中作为生态系统工程师发挥着关键作用（Rozwalak等人，2022；Wejnerowski等人，2023）。对蓝细菌毒性的更全面研究将有助于揭示某些有毒蓝细菌代谢产物的存在与蓝细菌多样性之间的进化联系，以及毒素存在与栖息地质量、生态压力因素和特定蓝细菌代谢产物的生物活性/毒性之间的关系。所有这些都需要对蓝细菌进行更全面的研究。本研究旨在表征来自多种生态系统的丝状蓝细菌中常见的蓝藻毒素和其他生物活性代谢产物，包括来自天然淡水和咸水生态系统以及人工加热湖泊的菌株，以及来自cryoconite holes的冰川底栖、形成垫状的蓝细菌。所研究的菌株包括温带地区的浮游、形成藻华且可能有毒的蓝细菌菌株，代表了本地和广泛分布的类群。我们假设蓝细菌的毒性不仅限于传统上认为有毒的物种，一些基于标准分析方法被分类为无毒的菌株也可能对水生生物产生有害影响。为了验证这一点，我们使用免疫测定法和色谱技术分析了72种蓝细菌菌株中的各种有毒蓝细菌代谢产物的存在。除了检测毒素外，我们还使用Daphnia magna（Straus，1820）和D. pulicaria（Forbes，1893）作为指示物种，通过短期生存生物测定来评估所研究菌株的毒性，以将分析结果与生物体的反应联系起来。具体而言，我们测量了提取物和滤液的毒性，以区分活细胞体外释放的化合物的毒性和总毒性（包括细胞内储存和释放的代谢产物）。我们还量化了收获时的叶绿素a浓度，以测试蓝细菌提取物和滤液中的毒性是否与蓝细菌生物量成正比。基于多方面的毒理学方法，我们的研究提供了关于主要来自欧洲温带栖息地的蓝细菌多样性中有毒蓝细菌代谢产物出现情况的新的详细见解，其中一部分来自北极环境。菌株的培养持续了40天，之后收集了100毫升的样本，并使用GF/C级过滤器（Whatman，Maidstone，英国）进行过滤。提取了叶绿素a，并根据ISO10260:1992标准（国际标准化组织，1992年）测量其浓度。每种菌株剩余的培养液用于水蚤存活测试，该测试评估了蓝藻培养物的提取物和滤液对水蚤存活的影响。提取物的制备包括三次冷冻-解冻和15分钟的超声处理（Sonorex RK156，Banelin electronics，柏林，德国）。随后，使用玻璃真空过滤套件将提取物过滤通过GF/C过滤器。未经超声处理和冷冻处理的蓝藻培养液（100毫升）也通过GF/C过滤器过滤得到滤液。制备好的提取物和滤液在-20°C下保存直至分析。存活测试是在来自含有约150只繁殖雌性的水蚤种群中的幼体水蚤上进行的。每个研究的水蚤克隆的实验设置相同，具体如下：每个克隆的五个重复样本（每个重复样本包含10只随机选择的个体）被暴露于7毫升的蓝藻提取物或滤液中，时间长达48小时。一次测试最多可以同时评估七种蓝藻菌株的提取物和滤液。在每一轮测试中，还设置了对照组，即每个水蚤克隆的五个重复样本暴露于新鲜制备的WC培养基中（该培养基用于培养蓝藻，时间约为24小时）。在每次测试之前，通过充气15分钟使蓝藻提取物和滤液以及对照培养基中的空气充分混合。实验样本在与水蚤种群相同的植物生长箱中培养，测试期间不提供食物。暴露后，使用立体显微镜统计所有小瓶中存活和死亡的水蚤数量。总共使用了15,400只新生水蚤（2个水蚤克隆×2种测试液体×5个重复样本×每个重复样本中的10只个体×72种蓝藻菌株加上10个对照组×5个重复样本×每个重复样本中的10只个体）。根据记录的数据，计算了每个水蚤的存活百分比。

叶绿素a的数据被用作培养结束后蓝藻生物量的代理指标。使用广义线性混合模型（GLMMs）来比较水蚤对蓝藻提取物和滤液的存活反应。分别为D. magna和D. pulicaria建立了模型，每个模型都将水蚤存活作为响应变量。两个模型都包括了处理（提取物 vs. 滤液）与蓝藻分类单元的交互作用，以及处理与生物量（使用叶绿素a制备提取物/滤液）的交互作用作为解释项。蓝藻菌株的类型被作为每个模型的随机截距。这种模型参数化允许根据蓝藻分类单元比较提取物和滤液对水蚤存活的影响，并测试生物量（用于制备提取物/滤液的叶绿素a）与处理（提取物 vs. 滤液）对水蚤存活之间的关系。模型使用beta误差分布和logit链接函数进行拟合。为了事后比较提取物和滤液对水蚤存活的影响，使用了Tukey的多重检验调整方法，并通过emmeans ver. 1.10.6 R包（Lenth，2023年）实现了估计的边际均值。由于对照组表现出最小的变异性，因此将其从GLMMs中排除，并进行了额外的补充分析，分别比较每个处理与其匹配的对照组，针对每个水蚤克隆和每个菌株×处理组合。使用单侧精确二项式检验来测试水蚤存活与克隆特异性对照组之间的差异。p值使用Benjamini–Hochberg错误发现率（FDR）程序进行了多重检验调整。所有分析都是使用R软件版本4.2.2（R Core Team，2022年）和RStudio版本2023.12.1（R Studio Team，2024年）进行的。

在研究的72种菌株中，有35种被确定为至少产生了一种有毒/生物活性代谢物。Anabaenopeptins通过ELISA在Aphanizomenon gracile（12种菌株）、A. klebahnii（2种菌株）和Planktothrix agardhii（14种菌株）中被检测到。Anatoxin-a仅在Cuspidothrix issatschenkoi（2种菌株）中被观察到，并通过ELISA、HPLC-DAD和LC-MS得到了确认。色谱方法显示CYN仅存在于A. gracile（5种菌株）中。Microcystins仅在P. agardhii（9种菌株）中被发现，这一结果通过TRFIA、HPLC-DAD和LC-MS分析得到了确认。后两种技术还确定了MC的同系物：dmMC-RR存在于所有MC阳性的P. agardhii菌株中，dmMC-LR仅存在于两种菌株中，而MC-RR仅在一种菌株中得到确认。在其他研究的P. agardhii菌株中未检测到其他MC变体。TRFIA和色谱分析显示，72种菌株中没有一种是NOD阳性的。Saxitoxin通过ELISA在A. gracile（1种菌株）中被检测到。毒理学筛选的详细数据见附录S2。

在40天龄的培养物中测量的叶绿素a浓度范围为10.1至979.6微克·升^-1（图1a）。在15种菌株中检测到超过500微克·升^-1的叶绿素a生物量，这些菌株包括五个物种（Aphanizomenon gracile、A. klebahnii、Cuspidothrix issatschenkoi、Planktothrix agardhii和Raphidiopsis raciborskii）。在生物量超过500微克·升^-1的菌株中，有一些产生了不同的研究代谢物，包括anabaenopeptins、anatoxin-a、CYN和MCs。在任何极地菌株（Microcoleus、Phormidesmis）中均未检测到任何研究代谢物。Microcoleus autumnalis的生物量（叶绿素a为187.2微克·升^-1）高于Phormidesmis priestleyi菌株，后者的叶绿素a浓度范围为17.0至42.9微克·升^-1。

图1显示了40天龄蓝藻培养物中的叶绿素a浓度（a）以及水蚤在暴露于个别蓝藻菌株提取物或滤液48小时后的平均存活率降低情况，相对于同克隆内的对照。检测到有毒/生物活性蓝藻代谢物的菌株用红色标记，未检测到此类代谢物的菌株用蓝色标记。热图单元格表示相对于同克隆内对照的存活率降低情况。黑色点表示提取物或滤液与同克隆内对照相比具有统计学显著效应的处理（精确单样本二项式检验，BH-FDR，调整后的p<0.05），点大小表示效应幅度（3%–10%、10%–30%、30%–50%、≥50%的绝对存活率降低）。APs代表anabaenopeptins；ATX-a代表anatoxin-a；CYN代表cylindrospermopsin；MCs代表microcystins；STXs代表saxitoxins。

对照组的水蚤平均存活率为100%，除了在D. pulicaria的第4次试验、D. magna的第8次试验和D. pulicaria的第10次试验中，存活率分别降至98%、98%和96%。比较处理与克隆特异性对照的二项式测试显示，只有少数提取物甚至更少的滤液导致水蚤存活率显著降低（≥30%）（图1b）。对于Limnothrix sp. W3和Aphanizomena klebahnii W1的提取物，以及在D. magna中的Microcoleus autumnalis W104的提取物，观察到存活率降低超过50%。在D. magna中，10种菌株的提取物（包括A. gracile、A. klebahnii、Chrysosporum bergii和Phormidesmis priestleyi）导致30%–50%的存活率降低，而只有一种滤液（M. autumnalis）达到了这一范围。在D. pulicaria中，5种菌株的提取物（包括A. gracile、A. klebahnii、Ch. bergii和M. autumnalis）导致30%–50%的存活率降低，而没有任何滤液达到这一范围。在D. magna中，19种提取物和3种滤液导致10%–30%的存活率降低；在D. pulicaria中，22种提取物和1种滤液导致10%–30%的存活率降低。GLMM显示，处理与蓝藻分类单元的交互作用对两种水蚤的存活有显著影响（表1；模型项：处理 × 蓝藻分类单元）。事后分析显示，D. magna和D. pulicaria暴露于Aphanizomenon gracile、A. klebahnii、Cuspidothrix issatschenkoi、Limnothrix sp.和Planktothrix agardii的过滤提取物后，其存活率低于这些分类单元的滤液（表2，图2）。对于Raphidiophsis raciborskii，与D. magna相比，提取物也导致了更大的存活率降低；对于Chrysosporum bergii和Microcoleus autumnalis，与D. pulicaria相比也是如此。处理与提取物/滤液所来自的蓝藻生物量的交互作用也显著影响了两种水蚤的存活（表1；模型项：处理 × 蓝藻生物量）。观察到水蚤存活与蓝藻提取物中的叶绿素a含量之间存在正相关关系（D. magna的β=0.0020，95%置信区间CI=0.0012–0.0028；D. pulicaria的β=0.0017，95%置信区间CI=0.00112–0.0022；表1，图3）。相比之下，蓝藻滤液中的存活率与叶绿素a浓度之间没有显著关系（D. magna的β=0.0001，95%置信区间=?0.0005–0.0008；D. pulicaria的β=1.09×10^-6，95%置信区间=?0.0004–0.0004；表1，图3）。

表1显示了广义线性混合模型的结果，用于研究不同蓝藻分类单元（Aphanizomenon flos-aquae、A. gracile、A. klebahnii、Aphanizomenon sp.、Chrysosporum bergii、Cuspidothrix issatschenkoi、Dolichospermum planctonicum、Limnothrix sp.、Microcoleus autumnalis、Phormidium priestleyi、Planktothrix agardhii、Raphidiopsis raciborskii）和蓝藻生物量（叶绿素a，微克·升^-1；制备提取物和滤液的生物量）对D. magna和D. pulicaria存活的影响。模型项包括：

Daphnia magna
处理 1 692 61.82 <0.001
蓝藻分类单元 11 692 5.24 <0.001
蓝藻生物量 1 692 11.30 <0.001
处理 × 蓝藻分类单元 11 692 5.16 <0.001
处理 × 蓝藻生物量 1 692 24.49 <0.001

D. pulicaria
处理 1 692 67.20 <0.001
蓝藻分类单元 11 692 10.17 <0.001
蓝藻生物量 1 692 18.64 <0.001
处理 × 蓝藻分类单元 1 692 6.77 <0.001
处理 × 蓝藻生物量 1 692 19.62 <0.001

注：模型使用beta误差分布和logit链接函数进行拟合，并将蓝藻菌株类型作为随机效应。显示了分子自由度（dfnum）、分母自由度（dfdenom）、F统计量和p值。

表2显示了事后测试的结果，比较了不同蓝藻分类单元下D. magna和D. pulicaria的处理（提取物 vs. 滤液）之间的存活率。

表2显示了D. magna和D. pulicaria在不同处理（提取物 vs. 滤液）之间的存活率比较结果：

Aphanizomenon flos-aquae 0.94 (0.87–0.97) 0.97 (0.93–0.99) ?1.66 0.09 0.96 (0.93–0.98) 0.95 (0.92–0.97) 0.46 0.644
Aphanizomenon gracile 0.90 (0.87–0.92) 0.96 (0.95–0.97) ?7.07 <0.001 0.93 (0.91–0.94) 0.96 (0.95–0.97) ?3.87 <0.001
Aphanizomenon klebahnii 0.89 (0.85–0.92) 0.96 (0.94–0.97) ?5.12 <0.001 0.91 (0.89–0.93) 0.96 (0.95–0.97) ?4.29 <0.001
Aphanizomenon sp. 0.98 (0.91–0.99) 0.97 (0.89–0.99) 0.38 0.706 0.97 (0.92–0.99) 0.95 (0.89–0.98) 0.64
Chrysosporum bergii 0.91 (0.80–0.96) 0.95 (0.87–0.98) ?1.15 0.250 0.68 (0.52–0.80) 0.95 (0.90–0.97) ?4.57 <0.001
Cuspidothrix issatschenkoi 0.88 (0.78–0.93) 0.96 (0.92–0.98) ?3.39 <0.001 0.83 (0.75–0.89) 0.96 (0.93–0.97) ?4.36 <0.001
Dolichospermum planctonicum 0.94 (0.90–0.97) 0.97 (0.94–0.98) ?1.78 0.075 0.96 (0.93–0.97) 0.96 (0.94–0.97) ?0.30 0.765
Limnothrix sp. 0.03 (0.009–0.12) 0.88 (0.67–0.97) ?8.04 <0.001 0.17 (0.08–0.35) 0.96 (0.91–0.99) ?7.10 <0.001
Microcoleus autumnalis 0.51 (0.23–0.79) 0.60 (0.29–0.84) ?0.54 0.589 0.28 (0.13–0.50) 0.83 (0.66–0.93) ?3.80 <0.001
Phormidesmis priestleyi 0.97 (0.92–0.99) 0.96 (0.92–0.98) 0.29 0.775 0.96 (0.93–0.98) 0.95 (0.92–0.97) 0.40 0.685
Planktothrix agardhii 0.90 (0.86–0.93) 0.96 (0.95–0.98) ?5.43 <0.001 0.93 (0.90–0.94) 0.96 (0.94–0.97) ?3.14 0.001
Raphidiopsis raciborskii 0.9我们的研究结果大体上证实了现有文献的报道，即：（1）Aphanizomenon gracile能够产生APs、CYN和STXs；（2）Cuspidothrix issatschenkoi具有产生ATX-a的潜力；（3）Planktothrix agardhii能够产生APs和MCs（见表3）。然而，我们也观察到A. klebahnii能够产生APs，据我们所知，这一特性此前在该物种中尚未被发现。迄今为止，这一能力仅在该属的其他物种中被记录到（见表3）。在受到半咸水入侵的水体中，也能发现能够产生APs的Aphanizomenon（Overling?等人，2024年）。与此模式一致的是，我们从波兰北部的Wicko、Kopań和Sarbsko沿海湖泊中分离出了三种AP阳性的A. gracile菌株（W15、W16、W22），这些湖泊都具有半咸水的特征（Woszczyk和Schubert，2021年）。表3总结了使用ELISA（APs、ATX-a、STXs）、TRFIA（MCs/NOD）和HPLC-DAD/LC-MS（ATX-a、CYN、MCs、NOD）方法检测出特定蓝藻代谢产物的菌株数量。

| 税株分类 | 检测到蓝藻代谢产物的菌株数量 |
|---------|------------------|
| Aphanizomenon flos-aquae | 3株 |
| Aphanizomenon gracile | 21株 |
| A. klebahnii | 14株 |
| Aphanizomenon sp. | 1株 |
| Chrysosporum bergii | 2株 |
| Cuspidothrix issatschenkoi | 4株 |
| Dolichospermum planctonicum | 5株 |
| Limnothrix sp. | 1株 |
| Microcoelus autumnalis | 1株 |
| Phormidesmus priestleyi | 3株 |
| Planktothrix agardhii | 14株 |

注：含数字的单元格表示在本研究中检测到了相应的代谢产物。灰色框中的小写字母表示先前文献中已报道过该物种具有代谢产物产生能力的分类单元。
来源：a Murakami等人（2000年），b Falfushynska等人（2021年），c Monteiro等人（2021年），d Rapala等人（1993年），e Ballot、Fastner、Lentz和Wiedner（2010年），f Park等人（1993年），g Sivonen等人（1989年），h Preu?el等人（2006年），i Fastner等人（2007年），j Kokociński等人（2013年），k Schembri等人（2001年），l Adamski等人（2020年），m Mohamed和Bakr（2018年），n Hawkins等人（1985年），o Akcaalan等人（2006年），p Ballot、Fastner和Wiedner（2010年），r Nogueira等人（2004年），s Lagos等人（1999年），t Bernard等人（2017年）。虽然大多数测试的物种已经被确认为能产生这些毒素/代谢产物（见表3），但其中许多物种在研究区域内尚未被观察到（附录S1）。重要的是，这些发现证明了Cuspidothrix issatschenkoi存在产生ATX-a的菌株，以及Aphanizomenon gracile存在产生STX的菌株。我们还在四个新的湖泊中发现了能够产生CYN的A. gracile菌株，进一步证实了该物种产生这种毒素的潜力。总体而言，这些数据支持了中欧低地水域中存在产毒蓝藻的观点。根据本研究测定的叶绿素a浓度，大多数菌株在模拟实验室暴发中的生物量超过了世界卫生组织（2024年）定义的警戒水平2（12 μg·L^-1），以及联合研究中心技术报告（Sanseverino等人，2023年）中规定的娱乐用水中蓝藻监测和管理的警戒水平。考虑到40天培养物中的叶绿素a浓度和蓝藻代谢产物的检测结果，很难质疑之前的估计（Chorus，2001年；国家河流管理局，1990年），即有毒蓝藻可能构成大量水华的一部分。在培养期间生物量最高的菌株中，检测到了APs（Aphanizomenon gracile、Planktothrix agardhii）、ATX-a（Cuspidothrix issatschenkoi）、CYN（A. gracile）和MCs（Planktothrix agardhii）。与潜在无毒基因型相比，有毒基因型的生长潜力更高（Davis等人，2009年，特别是球形蓝藻Microcystis）。有毒蓝藻比不产生毒素的竞争菌株生长更快，这一点令人担忧。尽管产生大量生物量和有毒代谢产物的菌株数量相对较多，但在大多数蓝藻提取物和过滤液中，水蚤的平均存活率仍超过70%。只有三种蓝藻菌株对水蚤有显著的负面影响：浮游的Limnothrix sp. W3和Aphanizomenon klebahnii W1的提取物显著降低了两种水蚤的存活率；而冰川蓝藻Microcoleus autumnalis W104的提取物则降低了Daphnia pulicaria的存活率。在Daphnia magna的情况下，无论是提取物还是过滤液均显著降低了其存活率，且这一结果的置信区间非常宽泛。出乎意料的是，Limnothrix sp.和Microcoleus autumnalis不含研究的代谢产物，而A. klebahnii仅产生了APs——这些化合物也存在于其他对水蚤无害的菌株中。这些结果表明它们可能合成其他对水蚤有害的未知化合物。Limnothrix sp.和Microcoleus autumnalis的研究结果支持了这样一种假设，即蓝藻的毒性可能超出了传统认定的有毒物种范围。这表明，即使通过标准检测被归类为无毒的菌株，也可能对水生生物造成伤害，尤其是在冰冻圈生态系统中，这类影响至今研究较少。因此，仅根据目标代谢产物的存在与否将菌株分类为“有毒”或“潜在无毒”可能过于简化。Limnothrix sp.和Microcoleus autumnalis的共同特征是形成了过量的胞外聚合物（EPSs；图4），前者在底部形成不规则的胶状聚集体，后者在培养容器底部和壁上形成地毯状垫层（附录S1）。EPS的存在对蓝藻生长可能非常有利（Deng等人，2025年）。尽管EPS本身通常无毒（More等人，2014年），但它们可以与有毒蓝藻代谢产物相互作用（Gan等人，2012年）并从水中吸收这些毒素（Mohamed等人，2023年）。在提取物制备过程中对生物体进行超声处理可能是导致这些菌株产生的未知蓝藻毒素释放的原因。Limnothrix sp.的例子为此假设提供了有力支持，因为仅该菌株的提取物就导致了Daphnia magna和Daphnia pulicaria的严重死亡。

图4显示了Limnothrix sp. W3菌株在用Alcian blue染色前（左上显微图）和染色后（右上显微图）的菌落片段，EPS以蓝色层的形式出现在菌毛周围。底部显微图显示了菌落中的菌毛放大后的情况。白色虚线框表示底部面板中放大的区域。Wejnerowski等人（2023年）证明了Microcoleus autumnalis W104菌株中含有EPS。我们的结果未发现这些冰川蓝藻中含有已知的毒素。然而，Microcoleus autumnalis提取物和过滤液以及Phormidesmus单株提取物对水蚤存活率的显著降低表明，需要进一步评估其他冰川蓝藻对水质安全的影响，特别是鉴于此前在极地样本中也检测到了蓝藻毒素（Chrapusta等人，2015年；Jungblut等人，2018年；Kleinteich等人，2018年）。蓝藻生物量的增加可能会提高毒素的浓度（Visser等人，2016年），并可能产生更明显的中毒效应。尽管大多数高生物量菌株能够产生已知的毒素或生物活性化合物，但它们的提取物并未显著降低水蚤的存活率。考虑到在相同的初始营养条件下菌株间（和菌株内）的生物量差异较大，我们的发现可能反映了由自然环境塑造的固有生命史策略。具体来说，我们的发现表明生长速率与有毒代谢产物的投入之间可能存在权衡——这些化合物可以抑制消费者，但生产成本较高（Lei等人，2024年）。从概念上讲，这一模式与植物生态学中的生长-防御框架一致（例如Coley的资源可用性假说；Coley等人，1985年），该假说认为来自资源受限环境的物种生长较慢，但防御投入较高；而来自资源丰富环境的物种生长较快，防御投入较低。我们注意到，大多数研究菌株来自富营养化温带水域，并且在相同的营养丰富培养基中培养。此外，培养监测未显示任何老化迹象（如培养物变黄或变白，或气味变化），也没有pH值变化或营养限制等物理化学指标（附录S3）。此外，生物量最高的培养物通常含有相对较低的phaeophytin，这是叶绿素a的降解产物。因此，我们怀疑Coley框架预测的分配模式也可能适用于蓝藻，即使在没有实验性资源限制的情况下也是如此。Limnothrix sp.和Microcoleus autumnalis的共同特点是形成了过量的胞外聚合物（EPSs），前者在底部形成不规则的胶状聚集体，后者在培养容器底部和壁上形成地毯状垫层（附录S1）。EPS的存在对蓝藻生长可能非常有利（Deng等人，2025年）。尽管EPS本身通常无毒（More等人，2014年），但它们可以与有毒蓝藻代谢产物相互作用（Gan等人，2012年）并从水中吸收这些毒素（Mohamed等人，2023年）。在提取物制备过程中对生物体进行超声处理可能导致EPS中吸附的有毒化合物释放，从而揭示了这些菌株对水蚤的毒性。Limnothrix sp.的例子为此假设提供了有力支持，因为仅该菌株的提取物就导致了Daphnia magna和Daphnia pulicaria的严重死亡。致谢

我们感谢Sandra Wejnerowska在样本运输组织方面提供的技术支持，以及她在亚当·密茨凯维奇大学（Adam Mickiewicz University）妥善保管蓝藻培养物的工作；感谢S?awek Cerbin提供的Daphnia magna克隆株和微藻接种物；感谢Piotr Dawidowicz提供的Daphnia pulicaria克隆株；同时感谢Adrianna Wojtal-Frankiewicz允许我们使用来自Sulejów水库的水样，从而分离出一种蓝藻菌株。蓝藻代谢产物的检测工作得到了波兰国家学术交流机构（拨款编号：PPN/BEK/2020/1/00241，授予?.W.）的资助。菌株的分子鉴定工作则由波兰国家科学中心（拨款编号：UMO-2020/39/D/NZ8/02436，授予?.W.）提供支持。关于冰川蓝藻生长机制的研究得到了2021-2022年度Biodiversa+ COFUND项目的支持，该项目隶属于欧洲生物多样性伙伴关系计划（项目编号：101052342），资金由波兰国家科学中心（拨款编号：2022/04/Y/NZ8/00092，授予K.Z.）提供。Sultana Akter的研究工作还得到了诺和诺德基金会（Novo Nordisk Fonden）的资助（项目编号：NNF21OC0071323）。

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