《Cancer Immunology Research》：CLK1 Promotes Myeloid-Derived Suppressor Cell Trafficking and Reprograms the Tumor Microenvironment by Activating Hippo/YAP Signaling in Colorectal Cancer
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结直肠癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，其特征是肿瘤细胞与免疫系统之间存在复杂的相互作用。肿瘤微环境（TME）在结直肠癌进展和治疗反应中发挥关键作用。然而，由于肿瘤细胞的遗传和表型多样性，调节TME组成的机制仍知之甚少。在本研究中，研究人员调查了导致TME形成的肿
结直肠癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，其特征是肿瘤细胞与免疫系统之间存在复杂的相互作用。肿瘤微环境（TME）在结直肠癌进展和治疗反应中发挥关键作用。然而，由于肿瘤细胞的遗传和表型多样性，调节TME组成的机制仍知之甚少。在本研究中，研究人员调查了导致TME形成的肿瘤内在因素，并评估了基于基因型的联合策略以增强结直肠癌免疫治疗的疗效。利用RNA测序、单细胞分析和免疫组织化学（IHC），研究人员鉴定了与低免疫活化相关的促癌蛋白。通过使用体外共培养系统、皮下结直肠癌模型、流式细胞术和IHC的功能研究，揭示了CDC样激酶1（CLK1）在肿瘤进展和免疫抑制性TME重塑中的作用。从机制上讲，CLK1激活导致Hippo信号通路过度活化，促进Yes相关蛋白（YAP）核易位及随后趋化因子CXCL1的转录上调。CLK1表达升高与髓系来源抑制细胞（MDSC）浸润增加和抗肿瘤免疫反应受损相关。敲低（KD）CLK1显著减少MDSC募集并恢复CD8+T细胞活性。此外，联合CLK1 KD和抗PD-1疗法在体内结直肠癌模型中更大程度地增强了瘤内CD8+T细胞浸润并引发了强烈的抗肿瘤反应。总之，这些发现确定了CLK1–Hippo/YAP–CXCL1信号轴是结直肠癌中免疫逃逸和TME重塑的调节因子，并强调了治疗靶向该轴以提高免疫检查点阻断（ICB）疗效的潜力。
结直肠癌在全球范围内属于高发且致死率较高的恶性肿瘤，尽管免疫检查点阻断（ICB）疗法已在多种实体瘤中取得突破，但大多数结直肠癌患者对其反应有限，尤其是微卫星稳定或错配修复功能正常的亚型，这凸显了解析肿瘤内在免疫抵抗机制的迫切性。肿瘤微环境（TME）由遗传多样的癌细胞、免疫浸润细胞和基质成分构成，典型的免疫抑制性TME表现为髓系来源抑制细胞（MDSC）、调节性T细胞（Treg）和肿瘤相关巨噬细胞的富集，同时伴有细胞毒性CD8+T淋巴细胞（CTL）的浸润减少和功能耗竭。MDSC可通过产生精氨酸酶1（Arg1）、活性氧和一氧化氮等途径抑制T细胞活性，并通过分泌CXCR2结合趋化因子（如CXCL1）被招募至肿瘤部位，进而促进免疫逃逸。因此，阐明肿瘤内在信号与这些抑制回路之间的分子联系，对于改善结直肠癌免疫治疗至关重要。既往虽有研究表明CDC样激酶1（CLK1）在多种癌症中异常表达并促进肿瘤进展，但其在调节结直肠癌免疫微环境中的作用尚不明确。在此背景下，研究人员旨在通过整合单细胞RNA测序（scRNA?seq）和批量RNA测序（RNA?seq）数据，探究CLK1在结直肠癌免疫抑制性TME形成中的角色及潜在机制，并尝试寻找增敏ICB治疗的策略。相关研究成果最终发表在《Cancer Immunology Research》期刊上。
为实现上述目标，研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，通过整合公共数据库（包括GSE236581、ICIs?Cell?Atlas及TCGA?COAD/READ）及中山大学第六附属医院临床队列的多组学数据，进行差异表达基因筛选及预后生存分析。其次，利用慢病毒系统在小鼠结直肠癌细胞系（CT26、MC38）中构建CLK1过表达及敲低模型，并结合药理学抑制剂TG003进行处理。第三，采用流式细胞术（FCM）和多重免疫组化（mIHC）对肿瘤浸润免疫细胞亚群进行定性与定量分析。第四，通过转录组测序（RNA?seq）、染色质免疫共沉淀（ChIP）及双荧光素酶报告基因实验解析CLK1调控下游靶基因的分子机制。最后，利用同源小鼠移植瘤模型评估CLK1基因干预联合抗PD?1疗法的体内抗肿瘤疗效。
CLK1是结直肠癌中与免疫活化减弱相关的关键促癌调节因子
研究人员通过整合scRNA?seq、TCGA数据及泛癌ICB反应图谱，筛选出CLK1作为候选主调控因子。分析显示，在免疫治疗反应差的患者中，CLK1表达显著升高，且与免疫抑制性TME特征正相关。生存分析表明，高CLK1表达预示着接受ICB治疗的患者总生存期（OS）较短。进一步的临床样本免疫组化（IHC）及定量PCR验证也证实了CLK1在结直肠癌组织中的蛋白及mRNA水平均显著高于癌旁正常组织，确立了CLK1作为结直肠癌免疫治疗负向预测因子的地位。
CLK1降低CD8+T细胞浸润并损害结直肠癌TME内的活性
体内实验显示，敲低CLK1可显著抑制CT26和MC38细胞的皮下成瘤，而CLK1过表达则加速肿瘤生长。通过流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞，发现CLK1敲低组中CD45+免疫细胞总数及CD8+T细胞比例显著增加，同时效应分子IFNγ、TNFα和穿孔素1（PRF1）的表达水平升高，增殖标志物Ki67阳性细胞增多，而耗竭标志物Eomesodermin（EOMES）和PD?1的表达降低。相反，CLK1过表达则呈现相反趋势。重要的是，清除CD8+T细胞后，CLK1敲低的抑瘤效应被消除，证实其作用依赖于CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。空间转录组学分析进一步揭示，CLK1高表达区域与CD8A、PRF1及颗粒酶A（GZMA）等细胞毒性标志物呈空间互斥分布，证实了CLK1诱导的CD8+T细胞排斥现象。
CLK1诱导的CD8+T细胞活性受损依赖于MDSC的累积
为探究CLK1影响T细胞功能的机制，研究人员进行了体外共培养实验。结果显示，CLK1敲低的肿瘤细胞或其上清液对CD8+T细胞功能无直接影响，且不影响抗原呈递。然而，免疫分型分析表明，CLK1敲低显著降低了肿瘤内MDSC的比例，而CLK1过表达则增加了MDSC丰度。功能上，来自CLK1敲低肿瘤的MDSC对CD8+T细胞的抑制能力减弱，且该过程可被ARG1抑制剂CB?1158逆转。清除MDSC（使用抗Ly6G抗体）可有效抵消CLK1过表达带来的促瘤效应。多重免疫组化结果也直观展示了CLK1敲低肿瘤中MDSC减少及IFNγ+CD8+T细胞增加的共定位变化。
CLK1诱导的CXCL1表达促进MDSC浸润
机制探索方面，RNA?seq及基因集富集分析（GSEA）显示，抑制CLK1显著下调了细胞因子?细胞因子受体相互作用通路，其中趋化因子CXCL1的表达变化最为显著。qPCR及ELISA验证表明，CLK1敲低或抑制可减少CXCL1的mRNA转录及蛋白分泌，而过表达CLK1则增强其表达。Transwell迁移实验证实，CLK1过表达细胞的条件培养基能显著促进MDSC迁移，而CLK1敲低则抑制迁移，且该效应可被外源性重组CXCL1蛋白回补。体内实验也显示，敲低CXCL1可抵消CLK1过表达引起的肿瘤生长加速，确立了CXCL1作为CLK1下游招募MDSC的关键效应分子。
CLK1激活Hippo/YAP信号以驱动CXCL1转录
研究人员进一步解析了CLK1调控CXCL1的上游机制。GSEA显示高CLK1表达与Hippo信号通路及YAP下游靶点激活相关。STRING蛋白互作网络分析提示CLK1与YAP/TEAD1模块及CXCL1存在关联。实验证实，CLK1过表达降低了YAP在Ser127位点的磷酸化（pYAP），促进了YAP的核易位及转录活性。免疫共沉淀（Co?IP）显示CLK1与Hippo通路上游支架蛋白WWC2存在直接相互作用。通过shRNA干扰实验进行的遗传学上位性分析表明，WWC2敲低可抵消CLK1缺失导致的YAP磷酸化增加及抑瘤表型。ChIP及双荧光素酶报告基因实验证明，CLK1?WWC2复合物通过解除对YAP?TEAD1的抑制，促进后者结合至CXCL1启动子区域，从而转录激活CXCL1的表达。
靶向CLK1增强结直肠癌中抗PD?1疗法的疗效
鉴于CLK1通过招募MDSC营造免疫抑制微环境，研究人员评估了CLK1抑制联合ICB的疗效。在CT26同源移植瘤模型中，单独使用CLK1敲低或抗PD?1单抗均可抑制肿瘤生长，而两者联合则表现出最强的协同抗肿瘤效应。联合治疗组不仅肿瘤体积最小，且瘤内MDSC比例最低，活化的CD8+T细胞（PRF1+或IFNγ+）浸润最多。临床样本分析也显示，低CLK1表达的免疫治疗应答者具有更高的CD8+T细胞浸润和更低的MDSC水平。
讨论与结论
本研究阐明了CLK1在结直肠癌中作为肿瘤内在免疫逃逸驱动因子的关键作用。通过整合多组学分析及体内外功能实验，研究人员揭示了CLK1?WWC2?Hippo/YAP?CXCL1轴的分子机制：CLK1通过与WWC2相互作用，抑制YAP磷酸化，促进其核易位，进而增强转录因子TEAD1对趋化因子CXCL1的转录激活；高表达的CXCL1进而招募MDSC至肿瘤微环境，抑制CD8+T细胞功能，最终导致免疫治疗耐药。该研究不仅拓展了对结直肠癌免疫抑制微环境形成机制的理解，更重要的是，提出了CLK1作为一个有前景的治疗靶点，通过联合CLK1抑制剂与抗PD?1疗法，可有效重编程TME，逆转免疫抑制状态，为克服结直肠癌免疫治疗抵抗提供了新的策略和理论依据。
