伊朗马什哈德地区感染Haemofelis支原体和Haemominutum支原体的猫的一些临床病理变化研究：一项观察性横断面研究

《Veterinary Medicine and Science》：Investigation of Some Clinicopathologic Alterations in Cats Infected With Mycoplasma haemofelis and Candidatus Mycoplasma haemominutum in Mashhad, Iran: An Observational Cross-Sectional Study

摘要

研究背景
在伊朗，关于猫嗜血支原体的数据非常有限。本研究旨在调查伊朗马什哈德地区猫类感染这种病原体的发生率，并评估其与其他临床病理变化之间的关联。

材料与方法
研究人员分析了100只就诊于兽医诊所的猫的血液样本，以检测嗜血支原体（Mycoplasma haemofelis，简称Mhf）和候选嗜血支原体（Candidatus Mycoplasma haemominutum，简称CMhm）。通过显微镜检查和传统的聚合酶链反应（PCR）技术对样本进行了嗜血支原体的筛查。同时，还对样本进行了血液学和生化分析。

研究结果
显微镜检查显示65%的样本中含有嗜血支原体，而PCR检测出的感染率为23%，其中CMhm阳性率为65.21%（n=15），Mhf阳性率为34.78%（n=8）。嗜血支原体DNA的存在与年龄、性别、品种和流浪状态有显著关联（p<0.05）。感染猫的多个血液学参数表现出显著变化（p<0.05），包括红细胞压积（Hct）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、白细胞计数（WBC）、中性粒细胞计数、血清总蛋白（TP）、球蛋白、磷（Pi）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平以及白蛋白/球蛋白比值（AGR）。

结论
本研究揭示了伊朗东北部地区猫嗜血支原体感染的较高发病率，其中CMhm为主要病原体。关键风险因素包括雄性、成年猫、户外活动频繁以及短毛猫品种。尽管感染猫表现出一致的临床病理变化，但Mhf和CMhm感染之间未观察到明显差异。

研究亮点
- 马什哈德地区的嗜血支原体感染率为23%，其中CMhm占比为66.22%。
- 显微镜检查与PCR检测结果一致性较低，PCR在猫嗜血支原体检测中更为可靠。
- 感染与年龄、性别、户外活动及某些临床参数相关。

1. 引言
猫嗜血支原体病是一种从急性到慢性不等的疾病，其特征是红细胞破坏。该病由寄生在红细胞内的细菌病原体引起。这些革兰氏阴性细菌培养条件苛刻，在实验室环境中难以培养。已发现的猫嗜血支原体种类包括嗜血支原体（Mhf）、候选嗜血支原体（CMhm）和图里西亚候选支原体（CMt）（Yasmin等人，2022年）。这些病原体引起的疾病临床表现多样，从无症状感染到急性溶血性贫血都有。在这些种类中，Mhf被认为是最具致病性的，而CMhm虽然最为常见，但通常毒力较低。然而，如果猫同时感染其他病原体、处于应激状态或免疫缺陷时，CMhm引起的疾病严重程度可能会增加（Tasker等人，2010年；Tasker等人，2018年）。传统的诊断方法是通过显微镜检查涂片来检测附着在红细胞上的病原体。但这种方法存在局限性，因为样本储存过程中病原体可能脱落，且难以将嗜血支原体与其他细胞结构区分开来。因此，聚合酶链反应（PCR）已成为首选的诊断工具，因为它能检测到低水平的嗜血支原体DNA并准确鉴定不同种类（Tasker等人，2018年；Hoseinpoor等人，2024年；Messick和Harvey，2023年）。猫嗜血支原体感染已在亚洲多个国家报告，不同地区的发病率各不相同，例如卡塔尔（5.9%）、印度（9.01%）和沙特阿拉伯（13.6%）（Alho等人，2017年；Malangmei等人，2021年；Alanazi等人，2020年）。土耳其作为连接亚洲和欧洲的地区，最近的研究进一步扩展了对该病的流行病学认知，报告显示感染率为9.4%–19.3%，并发现了当地菌株的遗传多样性（Muz等人，2021年；Cetinkaya等人，2016年；Ceylan、Culha等人，2024年；Ceylan、Ma等人，2024年）。尽管伊朗的研究报告的猫嗜血支原体感染率差异较大（显微镜检查为11.67%–53%，PCR为0%–25.96%（Hoseinpoor等人，2024年；Vahedi等人，2014年；Hooshyar等人，2016年；Ranjbar-Bahadori等人，2015年），但相关分子数据仍然有限。最近的全国性PCR调查显示（Hoseinpoor等人，2024年），本研究区域（霍拉桑拉扎维省）的感染率为25.96%，但未进行显微镜评估和疾病表现分析。我们在马什哈德的研究针对这些不足，通过临床病理分析和平行显微镜检查进行了补充。

2. 材料与方法
2.1 样本采集
本研究为观察性横断面研究，纳入了来自马什哈德兽医诊所的各年龄段、品种和性别的家猫。为了确保样本的代表性并减少选择偏倚，随机选择了部分猫进行检测。选择样本时未考虑临床症状，因为某些猫可能无症状，而有些猫可能出现黄疸和贫血等明显症状，从而避免了对有症状病例的偏好。排除近期（6个月内）接受过输血、嗜血支原体治疗、抗生素治疗、外科手术（除常规绝育手术外≥3个月前）、有记录的肾或肝功能障碍、出血事件或正在使用免疫调节剂/造血补充剂的猫。所有入选样本使用商业快速检测套件（Pet Rapid Test，Quicking Biotech Co. Ltd.，中国）检测FIV/FeLV呈阴性，并定期接种FVRCP（猫病毒性鼻气管炎、杯状病毒和泛白细胞减少症）和狂犬病疫苗。共随机采集了100份颈静脉血样本（每份3–4毫升）。样本来自伊朗东北部马什哈德（纬度36.20°N，经度59.35°E）的私人兽医诊所。一半样本置于含有K3-EDTA的试管（FL medical，意大利）中用于血液学和分子学检测，另一半置于不含抗凝剂的试管（WEGO，中国）中用于生化检测。血清样本在凝固后立即离心分离（1800 g，10分钟，Jouan，C 412，法国）。样本储存在-80°C直到分析。

2.2 染色与显微镜检查
为减少嗜血支原体从红细胞表面的脱落，确保准确检测和鉴定，样本采集后立即制备了血液涂片。这些涂片先风干，然后用 absolute methanol 固定5分钟，再用5%的Giemsa染色液染色。使用过滤后的Giemsa染色液减少了沉淀，避免了嗜血支原体鉴定的干扰，从而保证了诊断的准确性。45分钟后，用蒸馏水冲洗涂片，并在1000倍光学显微镜下仔细检查嗜血支原体（Ceylan、Culha等人，2024年）。每个样本至少检查100个视野，确认为阴性前方可排除感染。根据标准参考文献（Tvedten，2010年）描述的特征形态确认嗜血支原体感染——包括小型圆形形态（球杆菌，<0.8 μm）、杆状形态（最长1.5 μm）和偶尔出现的环状形态——这些病原体附着在红细胞膜上。所有涂片由两位经验丰富的观察者独立评估，以确保诊断的一致性。

2.3 血液学和生化分析
血液学分析在样本采集后立即进行，以确保时间敏感参数的准确性。使用EDTA抗凝的血液检测白细胞计数（WBC）和血小板计数（PLT）、红细胞压积（Hct）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白（MCH）和平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）。这些血液学参数使用自动化兽医血液细胞计数仪（Nihon Kohden MEK6450K系统，日本）进行评估。手动 differential 白细胞计数也在血液涂片上进行，对200个细胞进行分类和计数，以确定每种白细胞的绝对数量。血清生化分析使用Pars Azmoon公司（伊朗）的试剂盒和自动分析仪系统（Biotecnica，BT 1500，意大利）进行。生化检测项目包括总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总球蛋白（通过TP减去ALB计算）、总胆红素（BIT）、葡萄糖（GLU）、白蛋白/球蛋白比值（AGR）、尿素、肌酐（Cr）、钙（Ca）、磷（Pi）、碱性磷酸酶（ALP）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）。这些测量的准确性使用Randox对照血清（Randox，英国）进行监控。

2.4 分子检测
按照制造商的说明，使用DNA分离试剂盒（MBST，伊朗）从全血样本（100 μL）中提取基因组DNA。提取的DNA储存在-80°C以待后续的PCR检测。通过3%琼脂糖凝胶电泳评估DNA的质量。为了通过常规PCR检测和区分嗜血支原体，所有提取的DNA样本均经历了16S rRNA的扩增，使用正向引物（5′-ACGAAAGTCTGATGGAGCAATA-3′）和反向引物（5′-ACGCCCAATAAATCCGRATAAT-3′）（Jensen等人，2001年）。预期的PCR产物大小分别为Mhf约170 bp，CMhm约193 bp。PCR反应体积为20 μL，包含10 μL的2× PCR Mastermix（AMPLIQON，丹麦）、每种引物各1 μM和6 μL的样本DNA，最终体积调整至20 μL，添加2 μL无DNase的水。热循环条件为首次变性94°C 5分钟，然后是45个扩增循环（95°C 2分钟、60°C 1分钟和72°C 30秒），最后在72°C下延伸10分钟，使用TC3000热循环仪（美国）。扩增产物通过含有Green Viewer（10 mg/mL）的3%琼脂糖凝胶进行电泳，并在紫外光下观察。本研究使用的阳性对照嗜血支原体DNA样本来自马什哈德费尔多维西大学兽医教学医院的存档样本，这些样本来自之前检测出嗜血支原体感染的猫，并在适当条件下保存以保持其完整性。

2.5 统计分析
数据使用SPSS软件（版本21）进行分析。kappa系数用于评估分子方法和显微镜方法在诊断猫嗜血支原体感染方面的一致性。使用卡方检验（chi-squared test）调查感染频率与风险因素（包括性别、年龄、品种、流浪状态和临床病理发现）之间的统计关联。数据分布的正态性使用Kolmogorov–Smirnov检验进行评估。由于数据分布非正态，使用Kruskal–Wallis检验和Mann–Whitney U检验比较感染组和未感染组以及Mhf感染组和CMhm感染组之间的血液学和生化参数。p值小于0.05视为具有统计学意义。

3. 结果
3.1 显微镜检查
使用光学显微镜，在65%的染色血液涂片图像中，嗜血支原体被鉴定为粘附在红细胞表面的小而嗜碱性的细胞外体。这些嗜血支原体表现为圆形、单个或成对的点（图1）。

3.2 分子检测
在23%（23/100）的检测样本中检测到嗜血支原体DNA（图2）。其中，8例（34.78%）为Mhf，15例（65.22%）为CMhm。分子方法和显微镜方法在诊断猫嗜血支原体感染方面的一致性较低（Kappa值=0.139，表1）。

3.3 与猫嗜血支原体感染相关的风险因素
嗜血支原体DNA的存在与年龄、性别、品种和流浪状态有显著关联（表2）。这些风险因素被分为两组性别（雄性和雌性）、三个年龄组（<1岁、1–3岁和>3岁）、三个品种组（短毛猫[DSH]、波斯猫和暹罗猫）以及两组流浪状态（流浪猫和家猫）。1至3岁的猫更容易感染嗜血支原体（χ2=7.78，p=0.02）。雄性猫比雌性猫更容易患病（χ2=4.48，p=0.034）。大多数感染发生在短毛猫（χ2=10.45，p=0.005），而暹罗猫未检测到感染。在流浪猫中，阳性率（43.2%；16/37）高于家猫（χ2=13.6，p<0.0001）。变量（n = 100）
未感染的猫
感染的猫
卡方值（X2）
p值

性别
雄性（n = 64）
雌性（n = 36）
45（70.3%）
32（88.9%）
19（29.7%）
4（11.1%）
4.48
0.034

年龄
≤1岁（n = 27）
1–3岁（n = 50）
≥3岁（n = 23）
26（96.3%）
35（70.0%）
16（69.6%）
1（3.7%）
15（30.0%）
7（30.4%）
7.78
0.020

品种
属国家短毛猫（n = 45）
波斯猫（n = 50）
暹罗猫（n = 5）
28（62.20%）
44（88.00%）
5（100%）
17（37.80%）
6（12.00%）
0（0.00%）
10.45
0.005

流浪状态
家养（n = 63）
流浪（n = 37）
55（87.30%）
22（59.45%）
8（12.70%）
15（40.54%）
10.203
0.002

血细胞比容（Hct）
低（n = 17）
正常（n = 83）
4（23.53%）
73（87.95%）
13（76.47%）
10（12.05%
33.06
0.000

血红蛋白（HGB）
低（n = 14）
正常（n = 86）
6（42.86%）
71（82.56%）
8（57.14%）
15（17.44%）
10.71
0.003

红细胞计数（RBC）
低（n = 12）
正常（n = 88）
5（41.66%）
72（81.81%）
7（58.33%）
16（18.18%
9.61
0.005

平均红细胞体积（MCV）
低（n = 17）
正常（n = 83）
15（88.24%）
62（74.70%）
2（11.76%）
21（25.30%）
1.469
0.340

血小板（PLT）
低（n = 88）
正常（n = 12）
69（78.40%）
8（66.67%）
19（21.60%
4（33.33%）
0.822
0.424

白细胞计数（WBC）
低（n = 11）
正常（n = 78；高：n = 11）
6（54.55%）
71（91.02%）
5（45.45%；7（8.98%；11（100%）
48.62
0.000

中性粒细胞分类
低（n = 7）
正常（n = 65；高：n = 28）
6（85.71%）
55（84.61%；16（57.14%）
1（14.28%；10（15.38%；12（42.85%）
8.66
0.013

中性粒细胞带状细胞
正常（n = 92；高：n = 8）
74（80.43%；3（37.5%）
18（19.56%；5（62.5%）
7.66
0.015

淋巴细胞
低（n = 27；正常：n = 64；高：n = 9）
20（74.07%；51（79.68%；6（66.66%）
7（25.92%；13（20.31%；3（33.33%）
0.934
0.640

总蛋白（TP）
正常（n = 78；高：n = 22）
67（85.89%；11（45.45%；10（14.10%；12（54.54%）
15.848
0.000

白蛋白（Albumin）
正常（n = 75；高：n = 25）
57（77.33%；19（76.00%；17（22.66%；6（24.00%）
0.19
0.544

白蛋白球蛋白（Globulin）
正常（n = 86；高：n = 14）
71（82.55%；6（42.85%；15（17.44%；8（57.14%）
10.715
0.003

血尿素氮（AGR）
低（n = 12；正常：n = 72；高：n = 16）
4（33.33%；58（80.55%；15（93.75%；8（66.66%；14（19.44%；1（6.25%）
15.97
0.001

尿素（Urea）
正常（n = 24；高：n = 76）
19（79.16%；58（76.31%；5（20.83%；18（23.68%）
0.084
0.506

肌酐（Creatinine）
正常（n = 64；高：n = 36）
51（79.68%；26（72.22%；13（20.31%；10（27.77%）
13（20.31%；10（27.77%）
0.725
0.461

葡萄糖（Glucose）
低（n = 12；正常：n = 52；高：n = 36）
8（66.66%；41（78.84%；28（77.77%；4（33.33%；11（21.15%；8（22.22%
0.836
0.658

总胆红素（Total bilirubin）
正常（n = 77；高：n = 23）
68（88.31%；9（39.13%；9（11.69%；14（60.87%
15.99
0.001

苯丙氨酸氨基转移酶（AST）
正常（n = 18；高：n = 18）
66（90.41%；11（40.74%；7（9.59%；16（59.26%
27.45
0.001

谷丙氨酸氨基转移酶（ALT）
正常（n = 85；高：n = 15）
67（78.82%；10（66.66%；18（21.17%；5（33.33%
1.064
0.326

碱性磷酸酶（ALP）
正常（n = 61；高：n = 39）
46（75.41%；31（79.48%；15（24.59%；8（20.51%
0.223
0.637

钙（Calcium）
正常（n = 87；高：n = 13）
68（78.16%；9（69.23%；19（21.83%；4（30.76%
0.509
0.489

磷（Phosphorus）
低（n = 24；正常：n = 68；高：n = 8）
23（95.83%；54（79.41%；1（4.16%；14（20.58%；8（100%
31.81
0.002

缩写说明：AGR：白蛋白球蛋白比率；ALP：碱性磷酸酶；ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天冬氨酸氨基转移酶；DSH：属国家短毛猫；Hct：血细胞比容；HGB：血红蛋白；MCV：平均红细胞体积；PLT：血小板；RBC：红细胞计数；TP：总蛋白；WBC：白细胞计数。粗体数值表示统计学显著性（p < 0.05）。

3.4 血液学和生化发现
发现血嗜温型支原体感染与多种实验室指标之间存在显著关联（p < 0.05）。感染猫的红细胞计数、血红蛋白水平和血细胞比容显著降低（p < 0.05）。相反，感染猫的总白细胞计数、分叶中性粒细胞和带状中性粒细胞计数显著升高（p < 0.05）。感染猫的血清总蛋白、白蛋白球蛋白、碱性磷酸酶活性也显著升高，而血尿素氮水平显著降低（p < 0.05）。进一步检查临床症状显示，47.82%（11/23）的感染猫出现黄疸和贫血。比较两组感染猫的血液学和生化参数，未发现显著差异。详细信息见表3。表3：感染猫与未感染猫的血液学及部分血清生化参数的比较（中位数、第25和第75百分位数）。*表示感染组和未感染组之间存在显著差异；上标字母表示不同组之间存在显著差异。

参数 组别
-------------------------
-------------------------
属国家短毛猫（n = 77） 感染猫（n = 23）
-------------------------
血细胞比容（%） 32（28–36）a 23（19–37）b 23（18–32）b 23（19–32）*
红细胞计数（×10^6/μL） 8.41（7.36–9.19）a 6.20（4.17–9.23）b 5.49（4.56–7.20）b 5.73（4.59–7.29）*
血红蛋白（g/dL） 11.80（10.30–13.40）a 8.80（7.00–13.45）b 9.35（6.82–10.52）b 8.80（6.90–10.60）*
白细胞计数（×10^3/μL） 8.55（7.47–11.85）b 16.85（6.80–32.42）ab 18.400（6.60–37.10）a 16.60（5.30–28.00）*
分叶中性粒细胞（×10^3/μL） 5.14（2.98–9.44）b 11.40（3.84–27.65）ab 13.77（5.21–23.00）a 12.45（3.94–3.17）*
带状中性粒细胞（×10^3/μL） 0.00（0.00–0.00）b 0.16（0.00–0.40）a 0.16（0.00–0.85）a
总蛋白（g/dL） 64（60–68） 78（62–98）ab 88（70–97）b 93（62–100）*
白蛋白球蛋白（g/dL） 35（30–38） 50（28–68）ab 53（40–65）b 54（32–72）*
血尿素氮（AGR） 0.84（0.78–1.06） 0.56（0.44–1.25）ab 0.62（0.46–0.77）b 0.59（0.35–0.90）*
总胆红素（μmol/L） 1.03（0.34–1.37）a 4.79（4.62–23.6）b 8.21（4.28–40.53）b 5.47（4.62–30.78）*
苯丙氨酸氨基转移酶（AST） 28（23–44）a 37（23–105）ab 69（37–107）b 48（25–118）*
磷（mmol/L） 1.84（1.25–2.08）a 3（1.54–3.32）ab 2.19（1.93–2.93）b 2.1（1.4–3.0）*

注：上标字母表示未感染猫与感染Mycoplasma haemofelis（Mhf）或Candidatus Mycoplasma haemominutum（CMhm）的猫之间存在显著差异。显微镜检测与PCR确认结果之间的显著差异凸显了显微镜检测的局限性，尤其是由于假阳性导致的误差，这强烈建议采用基于PCR的监测方法，尤其是在无症状携带者中。我们发现雄性性别、接触户外环境以及DSH品种是重要的风险因素。尽管在所有感染的猫中观察到了某些血液学和生化指标的变化，但在Mhf和CMhm之间并未发现临床表现上的物种间差异。

5.1 我们研究的局限性

- 未控制的变量：这些猫是随机选择的，对其临床状况和营养状况没有限制。
- 疾病阶段不明确：感染的临床阶段（急性、慢性或亚临床）未被确定，这可能会影响血液学和生化检测的结果。
- 样本量有限：虽然对于初步分析有一定的参考价值，但更大规模的研究将有助于更深入地了解病原体的传播病学和致病机制。
- 诊断范围有限：PCR检测仅限于检测两种物种（CMhm和Mhf）。

作者贡献：
Gholam Reza Razmi：方法学设计、研究实施、资源协调、概念构思、项目管理和监督。
Elham Valavi：撰写初稿、参与研究。
Esmaeel Shahtahmasbi：方法学设计、参与研究、撰写初稿。
Mahdieh Zaeemi：资金筹集、撰写初稿、审稿和编辑、验证、方法学设计、软件应用、监督、资源协调、研究实施、概念构思、项目管理。

致谢：
我们感谢马什哈德费尔多西大学的研究部门对我们的支持。

资金来源：
本研究得到了伊朗马什哈德费尔多西大学兽医医学研究和技术副总裁办公室（Grant 3/45128）的资助。

伦理声明：
所有动物实验均严格遵循马什哈德费尔多西大学动物伦理委员会批准的指导原则（IR.UM.REC.1400.216）进行。

知情同意：
所有参与研究的猫的主人均已签署知情同意书。

利益冲突：
作者声明不存在任何利益冲突。

数据可用性：
本研究期间生成或分析的数据集可应要求向相应作者获取。

同行评审：
为了保证透明度，与本文相关的同行评审文档可在以下链接查看：https://doi.org/10.1002/vms3.70987

第三轮评审：
2026/03/13

第二轮评审：
2025/12/07

审稿人1的报告：
2025/11/06

第一轮评审：
2025/05/16

编辑决策函（附件1）：
2025/05/16

编辑决策函（附件2）：
2025/05/16

审稿人2的报告：
2025/05/08

审稿人2报告（附件1）：
2025/05/08

审稿人1的报告：
2025/04/24

审稿人1报告（附件1）：
2025/04/24