SARS-CoV-2病毒解旋酶抑制剂的重定位药物筛选研究

《SLAS Discovery》：Repurposing drug screen for the identification of helicase inhibitors from viruses of pandemic concern

多种病毒家族编码的解旋酶酶在病毒基因组复制和转录中发挥重要作用，包括冠状病毒和黄病毒等具有大流行风险的RNA病毒家族。病毒解旋酶被广泛认为是极具前景的抗病毒靶点，部分DNA病毒解旋酶抑制剂已获临床批准。本研究证实，SARS-CoV-2病毒解旋酶nsp13对病毒复制至关重要。利用先前建立的体外解旋酶双链RNA（dsRNA）解链实验，研究人员筛选了208种已上市小分子对nsp13的抑制活性。其中9种小分子表现出小于10 μM的半最大抑制浓度（IC50）。这些分子进一步接受了体外nsp13 ATP酶活性抑制实验及黄热病毒（YFV）NS3解旋酶（NS3h）活性抑制实验的验证。研究发现，AKT激酶选择性抑制剂FPA-124能够抑制SARS-CoV-2 nsp13和YFV NS3h的解链活性，尽管其仅抑制nsp13的ATP酶活性。分子配体对接实验证实，FPA-124可能结合于nsp13的ATP结合口袋，但不结合YFV NS3h。遗憾的是，FPA-124在培养的肺细胞中表现出较低的选择性指数，其对SARS-CoV-2的半数细胞毒性浓度（CC50）与半数有效浓度（IC50）相近。总体而言，研究人员开发了针对病毒解旋酶的几种高通量筛选实验，并鉴定出若干先导化合物骨架，这些成果可为应对未来大流行及缺乏治疗方案的地方性疾病提供急需的工具。

论文解读：靶向大流行风险病毒解旋酶的广谱抑制剂筛选

研究背景

过去二十年，冠状病毒科（Coronaviridae）多次引发大流行，凸显了对直接作用抗病毒药物（DAA）的需求。病毒复制转录复合体（RTC）中的非结构蛋白是理想靶点，其中RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）抑制剂瑞德西韦已获批临床应用。然而，RTC中的其他组分，特别是解旋酶，同样是关键的治疗靶标。SARS-CoV-2的nsp13属于超家族1B（SF1B）解旋酶，具有ATP酶活性和5′-3′方向的双链核酸解链活性，对病毒复制至关重要。尽管已有针对疱疹病毒的DNA解旋酶抑制剂获批，但针对SARS-CoV-2等RNA病毒解旋酶的抑制剂开发仍显不足。此前针对nsp13的抑制剂筛选数量有限，且多数处于早期阶段。因此，本研究旨在通过重定位策略，筛选针对nsp13及其他病毒解旋酶的广谱抑制剂，以应对未来可能出现的疫情。

技术方法

本研究主要采用以下关键技术：1. 基于荧光共振能量转移（FRET）的体外dsRNA解链实验，用于评估化合物对SARS-CoV-2 nsp13和黄热病毒（YFV）NS3解旋酶（NS3h⁴⁶²）活性的抑制；2. 孔雀石绿磷酸盐检测法（Malachite Green Phosphate Assay）测定nsp13的ATP酶动力学参数及抑制活性；3. 利用SARS-CoV-2复制子系统验证nsp13催化活性对病毒复制的必要性；4. 使用AlphaFold3（AF3）进行分子配体对接模拟，预测化合物与靶点的结合模式；5. 在A549-ACE2^h细胞中开展SARS-CoV-2体外抗病毒实验及细胞毒性评估，计算选择性指数。

研究结果

3.1 SARS-CoV-2 nsp13解旋酶是有效的治疗靶点

研究人员构建了nsp13的两个催化失活突变体（E375A和K345A/K347A），利用分泌型纳米荧光素酶的SARS-CoV-2复制子系统进行测试。结果显示，在Vero、HEK293T及A549等多种细胞系中，突变体均无法产生具有感染性的子代病毒颗粒，其荧光信号与未感染对照组相当。这表明nsp13的催化活性对SARS-CoV-2的复制不可或缺，确证了其作为抗冠状病毒药物靶点的有效性。

3.2 靶向药物筛选鉴定出多种nsp13 dsRNA解链抑制剂

研究人员筛选了208种化合物，包括已知的其他解旋酶抑制剂、计算机模拟预测的nsp13抑制剂及其衍生物。初筛发现115种化合物在100 μM浓度下具有抑制活性，经去垢剂（Tween-20）处理后排除非特异性聚集干扰，最终确定9种化合物的IC₅₀值小于10 μM且在去垢剂存在下仍保持活性。这九种化合物分别为FPA-124、NF-023、PPNDS、安石榴苷（punicalagin）、二苯基蓝、直接蓝、伊文思蓝、番泻叶苷B和苏拉明。

3.3 FPA-124和安石榴苷抑制nsp13 ATP酶活性

动力学分析显示nsp13具有稳健的ATP水解能力（V_max= 2.61 ± 1.86 μM/min，K_m= 39.6 ± 13.8 μM）。在这九种先导化合物中，仅FPA-124（IC₅₀= 0.035 μM）和安石榴苷（IC₅₀= 0.086 μM）表现出显著的ATP酶抑制活性。其余化合物如NF-023和PPNDS虽能有效抑制解链活性，却不抑制ATP酶，提示它们可能作用于ATP结合位点以外的变构位点。

3.4 建立黄病毒YFV NS3h的dsRNA解链与ATP酶动力学实验

为了评估抑制剂的广谱性，研究人员纯化了YFV的NS3解旋酶结构域（NS3h⁴⁶²），并建立了相应的生化实验体系。动力学参数测定显示，NS3h⁴⁶²的ATP酶效率低于nsp13（K_m= 175 ± 56.4 μM），但其dsRNA解链活性可通过提高酶浓度进行检测。

3.5 先导化合物对NS3h⁴⁶²的抑制活性

除番泻叶苷B外，其余八种化合物均能抑制YFV NS3h的解链活性。其中，安石榴苷是唯一同时抑制两种病毒解旋酶ATP酶活性的化合物。这一结果表明，七种重定位化合物具有成为泛病毒解旋酶抑制剂的潜力。

3.6 FPA-124被预测结合于nsp13而非NS3h的NTP口袋

AlphaFold3建模显示，FPA-124倾向于结合在nsp13的ATP结合口袋内，这与它抑制nsp13 ATP酶活性的实验结果一致。相反，模型预测FPA-124不结合NS3h的ATP口袋，解释了其仅抑制NS3h解链活性的机制差异。

3.7 FPA-124在细胞中未显示出抗SARS-CoV-2活性

尽管FPA-124在生化实验中表现优异，但在A549-ACE2^h细胞的病毒感染模型中，即使在高浓度（100 μM）下也仅表现出约40%的抑制率，且其半数细胞毒性浓度（CC₅₀）约为154 μM，导致治疗窗口极低。相比之下，对照组的Akt抑制剂VIII则显示出明确的治疗窗口。

结论与讨论

本研究通过复制子系统验证了SARS-CoV-2 nsp13作为药物靶点的必要性，并通过大规模重定位筛选发现了九种具有纳摩尔至微摩尔级活性的先导化合物。其中，FPA-124和安石榴苷能抑制nsp13的ATP酶活性，而NF-023、PPNDS等化合物则可能通过作用于RNA结合通道或变构位点发挥功能。研究人员还成功建立了YFV NS3h的实验体系，证实了其中七种化合物具有跨病毒家族的抑制活性，这为开发针对冠状病毒和黄病毒等多肽大流行风险病毒的广谱DAA提供了重要的化学工具。尽管FPA-124在体内外实验中表现出细胞毒性限制，但其作为药物化学骨架的价值依然显著。此外，苏拉明及其类似物的发现也为设计非ATP竞争性的泛病毒抑制剂提供了新思路。该研究发表于《SLAS Discovery》，强调了跨解旋酶超家族交叉测试抑制剂以优化广谱抗病毒药物开发的必要性。