Posttranslational modifications remodel proteome-wide ligandability

《Nature Chemical Biology》：Posttranslational modifications remodel proteome-wide ligandability

翻译后修饰（Posttranslational modifications, PTMs）极大地扩展了人类蛋白质组的多样性，可动态重塑蛋白质活性、相互作用及定位，以响应环境、药理学及疾病相关信号。然而，PTMs对小分子识别——进而对药物可及性（druggability）——的蛋白质组范围影响在很大程度上仍未得到探索。在此，研究人员提出了一种化学蛋白质组学策略，用于描绘PTM状态如何重塑人类细胞中的蛋白质配体结合能力（ligandability）。利用广谱光亲和探针（broad-spectrum photoaffinity probes），研究人员鉴定了超过400个功能多样的蛋白质，其参与小分子的能力受到磷酸化或N-连接糖基化状态的影响。将结合位点定位与结构分析相结合，揭示了多种依赖于PTM的口袋（pockets）。其中包括，常见致癌KRAS突变体的磷酸化状态影响小分子的作用，包括临床批准的抑制剂。这些发现揭示了一个以前未被充分认识的、由PTM调控的蛋白质组可塑性层，并凸显了开发化学探针以选择性靶向特定修饰状态蛋白质的机会。

论文解读：翻译后修饰重塑蛋白质组范围的配体结合能力

研究背景与立项依据

翻译后修饰（Posttranslational modifications, PTMs）在人类生物学中占据核心地位，通过在蛋白质上添加诸如磷酸基团、糖链等功能基团，动态调控其结构、功能及相互作用。据估计，单个细胞内可产生数十万种不同的蛋白质亚型（proteoforms），而这些复杂性往往无法通过基因组或转录组技术完全捕获。尽管基于质谱（Mass Spectrometry, MS）的方法已广泛应用于绘制PTM的动态图谱，但这些技术通常局限于描述修饰的丰度变化，难以直接揭示PTM如何影响蛋白质的结构、活性及其药理学特性。现有的化学生物学方法，如活性蛋白质谱分析（Activity-Based Protein Profiling, ABPP），虽然能够全局评估酶活性或亲核半胱氨酸的反应性，但往往受限于亲电探针的化学性质，且多在裂解液中进行，破坏了细胞的区室化和蛋白质相互作用，可能掩盖了PTM调控的结合事件或产生人工假象。因此，如何在完整的细胞系统中，不依赖蛋白质的功能类别，全面评估PTM对小分子-蛋白质相互作用（即配体结合能力，ligandability）的影响，成为亟待解决的关键科学问题。

关键技术方法

研究人员采用了一种基于全功能化片段（Fully Functionalized Fragment, FFF）探针库的化学蛋白质组学工作流程。该研究在活细胞（MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞和HEK293T细胞）中分别利用广谱激酶抑制剂星形孢菌素（Staurosporine, STR）和衣霉素（Tunicamycin, Tuni）诱导磷酸化和N-连接糖基化的扰动。随后，细胞与包含对照探针及多个对映异构体探针对的FFF探针共孵育，经紫外线（UV）照射交联后，通过铜催化叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）连接荧光或生物素标签。利用凝胶荧光扫描和串联质量标签（Tandem Mass Tag, TMT）定量蛋白质组学，研究人员在全蛋白质组范围内鉴定了依赖于PTM状态的配体结合事件。此外，结合位点映射、分子对接模拟以及细胞热转移实验（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）等多种生化与细胞生物学手段被用于验证和机制解析。

研究结果

PTM依赖性配体结合能力在细胞中的图谱绘制

研究人员首先建立了磷酸化和N-连接糖基化的细胞模型。通过定量磷酸化蛋白质组学监测，发现低剂量STR处理导致MDA-MB-231细胞中超过29,000个磷酸化位点发生显著改变，而对蛋白质丰度影响极小。利用FFF探针库进行凝胶分析和质谱定量，研究人员在磷酸化扰动下鉴定到235个配体结合能力改变的蛋白质，在糖基化扰动下鉴定到225个。这些靶蛋白广泛分布于酶、离子通道、表观遗传调节因子和转录因子等多种功能类别，表明PTM状态能够重塑不同类别蛋白质的“可配体化”特征。值得注意的是，绝大多数（约78%）的PTM依赖性靶点在当时缺乏注释良好的配体，暗示了其作为新兴药物靶点的潜力。

显示PTM依赖性配体结合能力的蛋白质特征

通过对代表性靶标的正交验证，研究人员证实了多种蛋白质在不同PTM状态下的配体结合差异。例如，酪氨酸激酶JAK1在STR处理后表现出广泛的配体结合能力下降，而V-ATP酶的E1亚基ATP6V1E1则显示出特定的结合能力增强。进一步分析显示，部分蛋白质（如CLN3）的配体结合能力变化并未伴随其已知磷酸化位点的改变，提示存在间接的调控机制。在糖基化依赖性靶标中，内质网驻留蛋白EDEM3和细胞黏附蛋白CDH2等均表现出显著的配体结合变化。特别值得注意的是，研究人员发现了62个“涌现性”（emergent）立体选择性结合事件，即立体选择性结合仅出现在特定的PTM状态下，表明动态蛋白质状态可以产生条件性的立体选择性结合口袋。

PTM依赖性结合位点的图谱绘制

研究人员开发了定量化学蛋白质组学工作流，在细胞中高分辨率地确定了光亲和探针的差异标记位点。分析显示，这些差异标记的位点通常位于相应UniProt注释的PTM位点附近（空间距离小于10 ?），且常邻近于活性位点、离子结合位点或蛋白质-蛋白质相互作用界面。例如，热休克蛋白HSPB1的S82去磷酸化促进了探针(R)-P6的结合，而组织蛋白酶D（CTSD）的S37去磷酸化则降低了结合。在另一个案例中，GABARAPL2的S87/S88突变（阻断磷酸化）导致P2探针结合显著增加。对于蛋白质复合物成员如LAMTOR2，STR处理导致其从Ragulator复合物中解离，从而暴露了新的配体结合口袋。在糖基化方面，NPC2蛋白的N58糖基化缺失导致其胆固醇结合口袋对(R)-P5探针的亲和力下降，证实了糖链直接参与小分子相互作用。

磷酸化状态改变KRAS抑制剂活性

研究中最具转化医学意义的发现集中在致癌蛋白KRAS上。研究人员发现，磷酸化状态显著影响KRAS不同突变体（如G13D, G12C, Q61H）与多种临床期抑制剂（如BI-2865, AMG-510, MRTX-849等）的相互作用。具体来说，KRAS在Y32和Y64位点的酪氨酸磷酸化会阻碍SOS1核苷酸交换因子的结合，从而富集GDP结合的“关闭”状态（OFF state），这恰恰是许多非共价KRAS抑制剂（如BI-2865）所偏好的构象。因此，诱导KRAS去磷酸化（如使用STR或达沙替尼dasatinib）会降低这些抑制剂破坏KRAS-RAF相互作用的能力，并减弱下游pERK信号的抑制。相反，SHP2磷酸酶抑制剂（如SHP099）通过维持KRAS磷酸化水平，增强了抑制剂的功效。这一发现揭示了KRAS信号通路中一个先前被忽视的、由磷酸化精细调控的药物结合层面。

讨论与结论

该研究填补了从PTM高通量检测到功能性药理学解读之间的空白。不同于以往零散的个案报道，这项工作提供了一个系统性的框架，用于在完整细胞环境中评估磷酸化和糖基化如何直接（通过改变口袋可及性）或间接（通过影响蛋白质相互作用或复合物稳定性）重塑蛋白质组的配体结合能力。这不仅揭示了大量“不可成药”靶点在特定PTM状态下的化学可塑性，也为理解临床药物在不同细胞背景下疗效差异提供了分子基础。特别是对于KRAS的研究，明确了其磷酸化状态是调节抑制剂结合与功能的关键变量，提示在联合用药策略中需考虑上游信号对靶蛋白修饰状态的调控。综上所述，该研究为开发能够选择性靶向特定蛋白质修饰亚型（proteoforms）的下一代化学探针和药物奠定了重要的理论基础和技术平台。论文发表于《Nature Chemical Biology》。