膳食中添加粪肠球菌（Enterococcus faecalis HHP003）对轻度腹泻猫的肠道微生物群组成和肠道健康的影响 王秦， 郑彦怡， 黄文瑜， 刘飞彤， 赵玲玲， 薛思远， 曾慧文， 吴毅

《Animals》：The Effects of Dietary Enterococcus faecalis HHP003 Supplementation on Gut Microbiota Composition and Gut Health in Cats with Mild Diarrhea Qin Wang, Yanyi Zheng, Wenyu Huang, Feitong Liu, Lingling Zhao, Siyuan Xue, Huiwen Zeng and Yi Wu

　　**简单总结**：饮食是调节猫肠道健康的关键因素，而益生菌作为宠物食品中的功能性补充剂，对于维持胃肠道稳态具有很大的潜力。目前对粪肠球菌（Enterococcus faecalis，简称E. faecalis）HHP003对患有轻度腹泻的猫的肠道健康影响的研究还较为有限。本研究表明，向猫的饮食中添加E. faecalis HHP003可以通过改变肠道微生物群和血液代谢物来改善猫的肠道健康，为支持猫的胃肠道功能提供了一种有效策略。

**摘要**：
作为一种益生菌乳酸菌，E. faecalis能够调节肠道菌群、增强肠道屏障并提高宿主的免疫力。然而，作为一种从健康猫肠道中分离出的新菌株，E. faecalis HHP003对猫肠道健康的具体影响仍不清楚。本研究选取20只患有轻度腹泻的猫随机分为两组：一组仅喂食常规饮食（MD），另一组则在常规饮食基础上添加E. faecalis HHP003（EF）。同时，另外10只健康的猫作为对照组（CON）。干预42天后，EF组的血清炎症标志物（TNF-α和IL-1β）以及钙蛋白酶抑制剂（calprotectin）和脂多糖（lipopolysaccharide）水平显著低于MD组（p < 0.05）。EF组的肠道微生物多样性也发生了变化，Chao指数和Shannon指数均有所提高（p < 0.05），特别是Bacillota、Bacteroidota和Ruminococcaceae类群在EF组的相对丰度显著高于MD组（p < 0.05）。代谢组学分析发现EF组和MD组之间存在697种差异代谢物和9条KEGG代谢途径（p < 0.05）。此外，研究还发现肠道微生物群与某些血清代谢物之间存在显著关联。总体而言，E. faecalis HHP003的补充有助于减轻猫的血清炎症反应，改善肠道炎症和屏障功能，并调整肠道微生物群及血清代谢物水平。

**1. 引言**：
随着生活水平的提高，宠物已成为许多家庭日常生活中不可或缺的一部分。因此，越来越多的主人开始更加重视宠物的健康。在宠物的各种健康指标中，肠道健康尤为重要，因为它直接影响营养物质的消化、吸收和免疫能力[1]。除了参与营养物质的吸收和食物分解外，哺乳动物的肠道还是体内最大的免疫器官[2]。因此，维持肠道平衡对于维持宿主的整体健康至关重要[3]。然而，这一过程不仅依赖于宿主体壁的完整性，还与复杂的肠道微生物群之间的相互作用密切相关[4]。肠道微生物群通过代谢活动、免疫调节和清除病原体来影响宿主体理机能，常被称为重要的“代谢器官”[5]。
猫肠道微生物群主要由Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes三个门细菌组成，其相对丰度受遗传背景、年龄、饮食习惯、居住环境和生理状态等多种因素影响[6]。由于胃肠道健康直接关系到猫的生长表现、繁殖效率和寿命，微生物生态系统的紊乱已被证实与多种常见消化系统疾病（如腹泻、便秘和猫炎症性肠病（IBD）的发病机制相关[7,8]。例如，一项研究通过荧光原位杂交技术发现，患IBD的猫肠道中双歧杆菌（Bifidobacterium）和拟杆菌（Bacteroides）数量显著减少，而产生硫化物的Desulfovibrio菌种数量显著增加，这些发现进一步证实了IBD与微生物失衡之间的密切联系[9]。另一项关于慢性IBD猫的肠道微生物组成的系统性研究也揭示了疾病与肠道微生物群失调之间的关联[10]。
粪肠球菌（Enterococcus faecalis，简称E. faecalis）具有极强的环境适应性，自然存在于动物和人类的胃肠道、口腔及生殖系统中，并广泛分布于各种自然生态系统中[11]。由于其兼性厌氧特性，该菌具有有氧和无氧代谢途径，这赋予了它较强的生存能力和抵御环境压力的能力[12]。越来越多的证据表明，E. faecalis不仅具有抗菌作用和益生菌特性，还能提高宿主健康并稳定微生物群落，使其成为维持肠道平衡的关键物种[13,14]。作为乳酸菌的一员，它在食品工业中广泛应用，用于发酵过程、风味开发及细菌素生产[15]。研究发现，将益生菌添加到猫的饮食中可以调节免疫反应、减轻压力、抑制病原体并促进生长[16]。例如，补充E. faecalis的猪仔粪便微生物群的α多样性及物种丰富度显著高于对照组[17]；类似地，也有研究表明E. faecalis能优化肉鸡的饲料转化率并促进其肠道健康[18]。尽管在其他物种中取得了这些效果，但关于E. faecalis对猫肠道健康影响的实验研究仍相对较少。因此，本研究旨在探讨E. faecalis HHP003补充剂对轻度腹泻猫的肠道微生物群组成、炎症反应和肠道屏障的影响。

**2. 材料与方法**
2.1. **动物**
动物处理和饮食方案的实验方案已获得中国农业大学动物护理与使用委员会（批准编号AW41805202-1-1）的批准。本研究共使用了30只年龄在1至7岁之间的成年猫，品种包括拉格多尔猫（Ragdoll）、缅因短毛猫（Maine Coon）、英国短毛猫（British Shorthair）、美国短毛猫（American Shorthair）、金渐层猫（Golden Gradient）和家短毛猫（Domestic Shorthair）。其中20只猫患有轻度腹泻，10只猫健康。轻度腹泻猫的粪便得分在3.5–4.5之间，健康猫的粪便得分在2.5–3.5之间[19]；所有猫的身体状况评分为4–5[20]。这些猫除了腹泻外没有其他临床表现，且无过敏史、免疫介导疾病、寄生虫感染、肝病或肾病，也未在研究前三个月内接受过药物、饮食干预、抗生素或免疫抑制药物治疗，也未进行过手术。排除怀孕或哺乳期的猫，以及无法进食或口服喂养的猫。
实验期间，所有猫被单独饲养在1.5米×1.5米×2.0米的笼子里，保持适宜的温度（23–26°C）和湿度（50–60%）。动物房间每天清洁并定期消毒，确保通风良好。实验期间，猫可以自由获取水和食物，研究人员密切观察其行为、食欲和粪便性状。

2.2. **实验设计及样本收集**
研究对象为20只轻度腹泻的成年猫，根据体重和粪便得分随机分为两组（每组10只，雌雄各半）。具体喂养方法如下：
- **轻度腹泻组（MD）**：仅喂食基础饮食；
- **实验组（EF）**：在基础饮食基础上添加6×10^10 CFU/kg的E. faecalis HHP003。
同时，另10只健康猫作为对照组（CON），也喂食基础饮食。本研究使用的基础饮食配方符合NRC（2006年）推荐的营养标准（表1）。E. faecalis已获得中国农业部颁发的饲料添加剂认证。E. faecalis HHP003（A-A-2）由中国广州H&H集团提供，该菌株从健康猫的粪便中分离，并保存在广东省微生物种质资源库（GDMCC，保藏号62869）。其安全性由第三方检测机构——中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）进行评估，该机构具备CNAS（中国国家合格评定服务认证，认证号L9421）、CMA（中国检验机构认证，认证号240000349907）和ILAC MRA（国际实验室认证合作互认协议）认证。根据GB 31615.2-2025国家标准《食品安全标准：用于食品的微生物起始物安全评估程序》[21]，在SPF ICR小鼠体内进行了标准化急性毒性测试，包括口服和腹腔注射两种途径。实验遵循良好实验室规范（GLP），官方测试报告（编号25-1047-02035.03-04258）作为安全性证据。每周测量所有组的体重和粪便得分（评分标准见附录A表A1），以评估生长情况和粪便特征。粪便评分由未知晓分组情况的评估人员完成。此外，在实验第28天和第42天收集的新鲜粪便样本用于检测钙蛋白酶抑制剂和C反应蛋白（CRP）的酶联免疫吸附测定（ELISA）分析。

2.3. **样本分析**
2.3.1. **细胞因子、肠道炎症和屏障生物标志物的检测**
使用市售ELISA试剂盒根据制造商说明检测血清中的炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）浓度。粪便中的钙蛋白酶抑制剂和CRP水平作为评估肠道炎症的关键生物标志物也通过ELISA测定。脂多糖（LPS）和zonulin的水平同样通过ELISA试剂盒测定。所有使用的商业试剂盒均购自江苏美面实业有限公司（中国盐城）。ELISA试剂盒的详细检测信息见附录A表A2。
2.3.2. **粪便微生物群分析**
使用Qiagen公司的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（德国Hilden）提取粪便总DNA。使用引物341F（5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）扩增V3–V4区域的16S rRNA。将等量的纯化扩增产物合并后，在Illumina MiSeq平台上进行测序（2×300 bp双端测序）。原始测序数据经过fastp（v0.19.6）质量过滤，随后使用FLASH（v1.2.11）进行读段合并。高质量读段通过UPARSE pipeline（v11）以97%的相似度阈值聚类为操作分类单元（OTUs）。OTU代表的分类归类使用RDP分类器（v2.2）完成，参考Silva 138数据库，置信度阈值为0.7。使用Mothur（v1.30.2）生成群落丰富度和多样性指数。样本间的差异通过β-Curtis指标量化，并通过主坐标分析（PCoA）可视化。不同实验组间的微生物丰度比较采用Kruskal–Wallis H检验。
2.3.3. **非靶向代谢组学分析**
将100 μL血清加入1.5 mL离心管中，然后加入400 μL含有四种内标的提取液（乙腈:甲醇 = 1:1）。涡旋混合30秒后，在5°C和40 KHz条件下进行低温超声提取30分钟，样品在-20°C下保存30分钟。随后以13,000× g离心15分钟，上清液收集后用氮气干燥，用于后续分析。残留物用100 μL的复溶液（乙腈:甲醇 = 1:1，v/v）重新配制，然后在5°C和40KHz下进行低温超声提取5分钟。样品随后在13,000× g和4°C下离心10分钟，得到的上清液小心转移到配备有微量插管的注射瓶中，用于仪器分析。对于非靶向代谢组学分析，使用了ACQUITY HSS T3色谱柱（Waters Corporation，马萨诸塞州米尔福德市）和UHPLC-Orbitrap Exploris 240系统（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆市）。从液相色谱-质谱（LC-MS）获得的原始数据使用Progenesis QI（v2.3）软件（Waters Corporation，马萨诸塞州米尔福德市）进行分析和处理，包括峰值检测、峰值对齐、保留时间校正积分和基线过滤。最终输出的数据矩阵包含质荷比（m/z）、峰值强度和保留时间。同时，二次质谱（MS/MS）和质谱（MS）的光谱信息与Metlin（https://metlin.scripps.edu/）、公共代谢组学数据库HMDB（https://www.hmdb.ca/）和Majorbio内部数据库进行匹配，以获取代谢物信息。数据库搜索的数据矩阵被上传到Majorbio Cloud Platform（cloud.majorbio.com）进行进一步分析。

2.4 统计分析和可视化
我们使用GraphPad Prism 9.0.0（美国加利福尼亚州圣地亚哥）和IBM SPSS Statistics 27.0（美国伊利诺伊州芝加哥）来分析数据。组间差异的统计显著性通过双因素重复测量ANOVA确定，多重比较使用Benjamini–Hochberg（FDR调整后的p < 0.05）方法进行调整。非靶向代谢组学中显著差异代谢物的鉴定基于OPLS-DA模型的VIP > 1和Student’s t检验的p < 0.05。微生物测序数据的可视化使用R软件（v4.0）完成。热图使用R vegan包（v2.6-4）生成，细菌群落条形图使用R ggplot包（v3.3.1）绘制。使用Kruskal–Wallis H检验评估微生物群落的相对丰度。统计显著性设定为p < 0.05，其中0.05 ≤ p < 0.1表示有显著趋势，p < 0.001表示差异高度显著。

3. 结果
3.1 物理特征
在整个实验期间，三组之间的体重（BW）没有显著差异（p ≥ 0.05；图1A）。第0天时，MD组和EF组的粪便评分显著高于CON组（p < 0.001；图1B）。然而，在第7、14、21、28、35和42天，三组之间的粪便评分没有显著差异（p ≥ 0.05；图1B）。第0天的粪便评分在MD组和EF组中显著高于其他时间点（p < 0.05；图1B）。图1. E. faecalis HHP003对猫体重和粪便评分的影响。(A) 第0、7、14、21、28、35和42天的体重。(B) 第0、7、14、21、28、35和42天的粪便评分。CON组为健康猫，接受基础饲料；MD组为轻度腹泻猫，接受基础饲料；EF组为轻度腹泻猫，基础饲料中混有6 × 10^10 CFU/kg的E. faecalis HHP003。BW表示体重。数值以平均值±标准误表示，n = 10。条形图上不同的字母表示组间有显著差异（p < 0.05）。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001。
3.2 血清炎症细胞因子
在实验的第42天，与MD组相比，CON组和EF组的血清TNF-α水平显著降低（p < 0.05；图2A）。同时，在第28天和42天，EF组的血清IL-1β水平显著低于MD组（p < 0.05；图2B）。此外，在第42天，EF组的血清IL-1β水平显著低于CON组（p < 0.05；图2B）。相比之下，在第28天或第42天，所有三组之间的血清IL-6浓度没有显著差异（p ≥ 0.05；图2C）。然而，在第21天，所有三组的IL-6水平均显著低于第42天（p < 0.05；图2C）。
3.3 肠道炎症和屏障功能参数
在实验的第28天和42天，与MD组相比，CON组和EF组的粪便钙蛋白酶水平显著降低（p < 0.05；图3A）。然而，CRP水平在不同时间点三组之间没有显著差异（p ≥ 0.05；图3B）。值得注意的是，在第28天，EF组的LPS水平显著低于MD组（p < 0.05；图3C），CON组的zonulin水平也显著低于MD组（p < 0.05；图3D）。然而，在第21天，所有三组的钙蛋白酶水平显著低于第42天（p < 0.05；图3A）。图3. E. faecalis HHP003对猫肠道炎症和屏障功能参数的影响。(A) 粪便钙蛋白酶水平。(B) 粪便C反应蛋白（CRP）水平。(C) 脂多糖（LPS）水平。(D) zonulin水平。CON组为健康猫，接受基础饲料；MD组为轻度腹泻猫，接受基础饲料；EF组为轻度腹泻猫，基础饲料中混有6 × 10^10 CFU/kg的E. faecalis HHP003。数值以平均值±标准误表示，n = 10。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001。
3.4 肠道微生物群的粪便宏基因组分析
基于Shannon（图4A）和Sobs（图4B）指数的稀释曲线显示，随着测序深度的增加，所有曲线逐渐趋于平稳，表明测序深度足以捕捉所有样本中的大部分微生物多样性。基于OTU级别的PCoA数据显示，三个实验组的粪便微生物群落有明显的聚类分离（p < 0.05；图4C）。此外，α多样性分析显示Chao指数在CON组和EF组中显著升高，而Shannon和Sobs指数也相对于MD组有所增加（p < 0.05；图4D–F）。图4. 粪便微生物群的β多样性和α多样性分析。(A,B) 基于Shannon和Sobs指数的稀释曲线。(C) 基于OTU级别组成的主坐标分析（PCoA）。(D–F) 通过Chao、Shannon和Sobs指数评估α多样性。CON组为健康猫，接受基础饲料；MD组为轻度腹泻猫，接受基础饲料；EF组为轻度腹泻猫，基础饲料中混有6 × 10^10 CFU/kg的E. faecalis HHP003。数值以平均值±标准误表示，n = 10。不同的字母表示组间有显著差异（p < 0.05）。根据门和科的分类对粪便微生物丰度进行了分析（图5）。在门水平（图5A），EF组猫粪便中的Bacillota相对丰度显著高于CON组（p < 0.05）。此外，与CON组相比，MD组中Bacteroidota的相对丰度显著降低（p < 0.05），而EF组没有显著变化（p ≥ 0.05）。在科水平（图5B），Lachnospiraceae（CON: 21.47%；MD: 14.86%；EF: 29.16%）、Peptostreptococcaceae（CON: 16.38%；MD: 14.66%；EF: 21.57%）、Coriobacteriaceae（CON: 12.00%；MD: 14.43%；EF: 12.06%）、Enterobacteriaceae（CON: 12.85%；MD: 15.72%；EF: 0.02%）和Ruminococcaceae（CON: 1.65%；MD: 0.09%；EF: 2.01%）是主要的科。与CON组和MD组（图5C）相比，EF组的Lachnospiraceae丰度呈增长趋势（p = 0.08）；特别是Ruminococcaceae的丰度显著增加（p < 0.001）。图5. 第42天细菌群落在门（A）和科（B）水平的相对丰度。(C) Lachnospiraceae和Ruminococcaceae的丰度。CON组为健康猫，接受基础饲料；MD组为轻度腹泻猫，接受基础饲料；EF组为轻度腹泻猫，基础饲料中混有6 × 10^10 CFU/kg的E. faecalis HHP003。n = 10。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001。还测量了粪便细菌在属水平的相对丰度（图6）。Blautia（CON: 15.89%；MD: 12.71%；EF: 23.26%）、Peptoclostridium（CON: 15.93%；MD: 14.26%；EF: 17.75%）、Collinsella（CON: 12.00%；MD: 14.43%；EF: 12.06%）、Escherichia-Shigella（CON: 12.85%；MD: 15.71%；EF: 0.02%）和Enterococcus（CON: 4.38%；MD: 13.08%；EF: 0.44%）是主要的属。图6. 第42天细菌群落在属水平的相对丰度。CON组为健康猫，接受基础饲料；MD组为轻度腹泻猫，接受基础饲料；EF组为轻度腹泻猫，基础饲料中混有6 × 10^10 CFU/kg的E. faecalis HHP003。n = 10。进一步使用线性判别分析效应大小（LEfSe）算法来分析组间从门到属水平的微生物组成（图7）。与CON组相比，MD组中Arthrobacter和Weissella富集（p < 0.05；图7A）。EF组中Bacillota、Arthrobacter和Acutalibacter富集程度高于CON组（p < 0.05；图7B）。EF组中Lachnospiraceae、Blautia、Bacteroidota和Parabacteroides是主要的富集分类单元，而MD组中Enterococcaceae和Enterococcus富集（p < 0.05；图7C）。图7. 线性判别分析（LDA）结合效应大小测量识别组间丰度显著不同的分类单元。图中仅显示LDA得分高于阈值的top 10个分类单元。(A) MD组和CON组之间差异丰富的细菌。(B) CON组和EF组之间差异丰富的细菌。(C) MD组和EF组之间差异丰富的细菌。CON组为健康猫，接受基础饲料；MD组为轻度腹泻猫，接受基础饲料；EF组为轻度腹泻猫，基础饲料中混有6 × 10^10 CFU/kg的E. faecalis HHP003。n = 10。
3.5 非靶向血清代谢组学分析
正负离子模式下的PLS-DA图显示三组和质量控制样本（QC）组之间的代谢物谱型有显著分离（p < 0.05；图8A,B）。PLS-DA模型的验证结果显示，正负离子模式的R2值均高于相应的Q2值。此外，Q2回归线与垂直Y轴的截距分别为?0.6140和?0.3270，表明模型适用于后续数据分析（图8C,D）。图8. 使用部分最小二乘判别分析（PLS-DA）来可视化组间的代谢差异。PLS-DA模型通过200次排列测试进行验证，以防止过拟合，置信水平为0.95，并使用相似性分析来评估组间差异的显著性。正离子模式（A）和负离子模式（B）的PLS-DA得分图。正离子模式（C）和负离子模式（D）的PLS-DA排列测试图。CON组：健康的猫接受基础饮食；MD组：患有轻度腹泻的猫接受基础饮食；EF组：患有轻度腹泻的猫接受基础饮食，并掺入6×10^10 CFU/kg的E. faecalis HHP003；QC组：质量控制样本。n = 10。不同组之间的差异代谢物显示在图9中。EF组和CON组之间的比较分析显示共有994种代谢物的丰度发生了显著变化，其中295种上调，699种下调。在前六种差异代谢物中，(S)-Nerolidol 3-O-[A-L-Rhamnopyranosyl-(1->2)-B-D-Glucopyranoside]上调（图9A）。EF组和MD组之间共鉴定出697种差异代谢物，其中274种上调，423种下调。上调的代谢物包括1H-Imidazole-4-Carboxamide、2-Methylindoline、4-(1-Amino-2-Carboxyethyl) Benzoic Acid、5-Hydroxymethyluracil、N-Acetylasparagine和Dehydrotumulosic acid（图9B）。CON组与MD组之间的比较中检测到555种差异代谢物，其中331种水平显著升高，224种水平降低。这些上调的代谢物包括Alanylleucine、9-Oxo-Nonanoic Acid、Trans-4-Hydroxycyclohexanecarboxylic Acid、5,6-Dihydroxytetradecanedioic Acid和(5S,6Z,8E,10E,14Z)-5,12-Dihydroxyicosa-6,8,10,14-Tetraenoic Acid（图9C）。图9：使用非配对Student’s t检验（双尾）比较了不同处理组之间的血清代谢物谱。差异代谢物火山图：EF vs. CON（A）、EF vs. MD（B）和CON vs. MD（C）。CON组：健康的猫接受基础饮食；MD组：患有轻度腹泻的猫接受基础饮食；EF组：患有轻度腹泻的猫接受基础饮食，并掺入6×10^10 CFU/kg的E. faecalis HHP003。表达值以平均值±SEM表示，n = 10。基于高质量的KEGG通路进行了通路拓扑分析（图10）。EF组与CON组相比，共有12条通路显示出显著差异（p < 0.05），分别是谷胱甘肽代谢、半乳糖代谢、色氨酸代谢、嘧啶代谢、油菜甾醇生物合成、α-亚麻酸代谢、核苷酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、类固醇激素生物合成、花生四烯酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成和脂肪酸生物合成（图10A）。另有9条通路在EF组与MD组之间显示出显著差异（p < 0.05；图10B），包括谷胱甘肽代谢、咖啡因代谢、色氨酸代谢、嘧啶代谢、核苷酸代谢、初级胆汁酸生物合成、类固醇激素生物合成、多种植物次级代谢物的生物合成和花生四烯酸代谢。此外，还有13条通路在CON组与MD组之间显示出显著差异（p < 0.05），如葡萄糖苷生物合成、花生四烯酸代谢、牛磺酸和低牛磺酸代谢、α-亚麻酸代谢、抗坏血酸和醛酸代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、丁酸代谢、类固醇激素生物合成、D-氨基酸代谢、苯丙烷酸生物合成以及各种其他次级代谢物的生物合成（图10C）。图10：通过KEGG拓扑分析和Benjamini–Hochberg多重检验校正，识别出差异代谢通路。（A）EF vs. CON；（B）EF vs. MD；（C）CON vs. MD。CON组：健康的猫接受基础饮食；MD组：患有轻度腹泻的猫接受基础饮食；EF组：患有轻度腹泻的猫接受基础饮食，并掺入6×10^10 CFU/kg的E. faecalis HHP003。表达值以平均值±SEM表示，n = 10。3.6. 基因组水平的肠道微生物群与差异代谢物之间的相关性使用Spearman相关性分析进行了评估（图11）。4-Hydroxyproline与Peptoniphilus和Bifidobacterium呈正相关（p < 0.05）。代谢物5-Hydroxy-L-Tryptophan与Blautia呈负相关（p < 0.05）。N-Formyltryptophan代谢物与Escherichia-Shigella呈负相关，而与Blautia、Extibacter和[Ruminococcus]_gauvreauii_group呈正相关（p < 0.05）。代谢物Dihydroferulic Acid 4-O-Sulfate与Escherichia-Shigella及Bacteroides呈显著正相关（p < 0.05）。图11：筛选出的血清代谢物与粪便微生物群的基因组组成之间的关系。CON组：健康的猫接受基础饮食；MD组：患有轻度腹泻的猫接受基础饮食；EF组：患有轻度腹泻的猫接受基础饮食，并掺入6×10^10 CFU/kg的E. faecalis HHP003。n = 10。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001。4. 讨论肠道微生物群在维持猫的健康和预防疾病中起着关键作用，它是增强屏障完整性、提高免疫功能和抵抗肠道病原体的重要因素，对于维持肠道稳态至关重要[22,23]。猫的肠道疾病通常与肠道菌群失调和功能下降有关，表现为微生物多样性和数量的减少，以及微生物群组成和代谢谱的变化[4,24]。益生菌作为一种安全有效的干预措施，可以调节肠道微生物群并维持肠道微生态系统的平衡[25]。基于E. faecalis的益生菌已被证实是有效的膳食补充剂，可以通过增强肠道免疫功能和调节肠道微生物群组成而对人类和动物产生有益效果[11]。然而，E. faecalis HHP003对猫的血清炎症状态、肠道屏障完整性和微生物组组成的影响尚未得到研究。细胞因子是一类主要由免疫细胞产生的内源性肽，它们调节多种生理功能，在调节各种免疫反应中发挥不可或缺的作用。维持促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间的平衡对于维持正常的免疫稳态和生理功能至关重要[26]。其中，TNF-α和IL-1β是公认的促炎介质[27]。TNF-α在肠道炎症中起关键作用，能够促进包括巨噬细胞和肠黏膜固有层的树突状细胞在内的免疫细胞分泌IL-1β[28]。研究发现，当猪仔暴露于LPS并喂食含有E. faecalis的饮食后，其体内的TNF-α和IL-1β水平显著低于对照组[17]。此外，益生菌菌株E. faecalis AG5可以缓解小鼠的肥胖，并降低肝脏样本中的TNF-α表达[29]。先前的研究表明，由E. faecalis M157发酵的低脂乳清显著抑制了Porphyromonas gingivalis脂多糖在RAW 264.7细胞中诱导的IL-1β[30]。值得注意的是，我们的研究发现，在患有轻度腹泻的猫中补充E. faecalis HHP003可以显著降低血清中的促炎细胞因子TNF-α和IL-1β水平。肠道通过调节稳态平衡、诱导免疫耐受性和防止 pathological免疫反应来影响和调节宿主的炎症状态。Calprotectin是一种36 kDa的S100家族蛋白，主要来自中性粒细胞颗粒，其水平可作为炎症严重程度的可靠指标，随着炎症活动的增加而增加[31]。本研究显示，将E. faecalis HHP003添加到饮食中可显著降低EF组粪便中的calprotectin浓度，相对于MD组而言。与先前的研究结果一致，多菌株益生菌补充可以显著降低健康家猫粪便中的calprotectin水平[32]。更有趣的是，多种益生菌已被用于控制肠道菌群失调和炎症反应，益生菌给药后，患有特应性皮炎的小鼠粪便中的calprotectin水平显著降低[33]。LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁的特定成分，可以刺激宿主免疫细胞产生炎症细胞因子[34]。当肠道屏障受损时，肠道腔内的LPS可以进入外周循环系统，引发或加剧全身炎症反应[35]。本研究中，EF组的LPS水平显著低于MD组。这些发现表明E. faecalis HHP003可能有助于保护肠道屏障的完整性并支持猫的胃肠道健康。猫的肠道微生物谱与多种胃肠道疾病密切相关，包括慢性肠炎和腹泻[4]。益生菌已被用作促进人类和动物健康的营养策略，并调节肠道微生物群[36]。先前的研究表明，Bacillota和Bacteroidota是猫肠道微生物群中的主要门类[6]。一项研究调查了Bacillus licheniformis发酵产物作为益生菌对慢性腹泻猫的肠道微生物群和临床表现的影响，发现益生菌补充与腹泻猫中Bacillota和Bacteroidota的增加有关[37]。本研究发现在42天的干预后，EF组猫的Bacillota水平显著高于CON组和MD组。尽管CON组的Bacteroidota水平显著高于MD组和EF组，但EF组的Bacteroidota水平仍高于MD组。支持我们的结果的是，益生菌补充后，肠道炎症犬的Lachnospiraceae和Ruminococcaceae的丰度增加[38]。作为肠道微生物群的核心组成部分，Lachnospiraceae从出生就开始在肠道中定植，终生存在于宿主体内，并能利用阿拉伯木聚糖、菊粉和淀粉等膳食多糖产生短链脂肪酸（SCFAs）[39,40]。Ruminococcaceae中的某些物种可以分解复杂的碳水化合物（如纤维素），产生的SCFAs不仅为肠上皮细胞提供能量，还能调节肠道免疫系统并减少炎症反应[41]。此外，作为Lachnospiraceae家族的一个属，Blautia由于其缓解炎症和代谢疾病的能力以及对抗特定微生物的抗菌活性而受到广泛关注[39]。与我们的结果一致，16S rRNA基因扩增子序列分析显示，给予E. faecalis 14天的小鼠肠道微生物群中Ruminococcaceae和Blautia的相对丰度增加[42]。值得注意的是，Escherichia-Shigella是一种典型的有害细菌，能够破坏肠道结构[43]。在本研究中，补充E. faecalis HHP003的患有轻度腹泻的猫中，Escherichia-Shigella的丰度降低，从而有助于缓解肠道疾病。先前的研究发现，在受Escherichia coli病原体挑战的肉鸡中补充E. faecalis可以减少Escherichia-Shigella的丰度，可能有助于减轻鸡的肠道紊乱[44]。简而言之，我们的研究发现E. faecalis HHP003调节了患有轻度腹泻的猫的肠道微生物群组成。有趣的是，尽管补充了E. faecalis HHP003，EF组中Enterococcus的相对丰度仍低于CON组和MD组。这可能是由于16S rRNA测序无法区分E. faecalis与其他肠球菌[45]，以及益生菌肠球菌菌株可能通过产生细菌素抑制其他肠球菌物种[46]。我们也意识到缺乏基线微生物群数据限制了我们的解释；因此，未来的研究需要包含基线采样和绝对定量来验证这一发现。作为代谢途径的中间产物和最终产物，代谢物在生物体的整体健康和代谢过程中起着重要作用[47]。KEGG通路拓扑分析显示CON组、MD组和EF组之间存在显著的差异代谢途径。其中，花生四烯酸代谢和类固醇激素生物合成在所有组别间的成对比较中都是共同的显著差异途径。花生四烯酸代谢是调节肠道炎症反应的核心途径，其代谢物是促炎和抗炎信号的关键介质[48]。同时，类固醇激素生物合成与免疫调节和肠道黏膜修复密切相关[49]。值得注意的是，E. faecalis HHP003可能逆转由轻度腹泻引起的脂质和类固醇激素代谢紊乱，从而减轻肠道炎症并维持黏膜稳态。这一发现与血清炎症因子结果一致：EF组的TNF-α和IL-1β水平显著低于MD组。此外，EF组和CON组的比较还揭示了α-亚麻酸代谢和谷胱甘肽代谢等差异途径。谷胱甘肽代谢是体内的主要抗氧化防御途径[50]，EF组中的变化表明E. faecalis HHP003可能通过调节猫的抗氧化能力来减轻轻度腹泻引起的氧化应激。作为重要的多不饱和脂肪酸代谢途径，α-亚麻酸的代谢进一步增强了E. faecalis HHP003对脂质代谢和抗炎反应的调节作用[51]。EF组和MD组之间的比较还揭示了初级胆汁酸生物合成方面的显著差异，这一途径与肠道微生物群结构和营养吸收密切相关[52]，这表明E. faecalis HHP003可能通过重塑肠道微生物群来调节胆汁酸代谢，从而改善肠道对营养的利用和屏障功能。这一发现得到了粪便钙卫蛋白结果的支持，结果显示EF组的肠道炎症有所减轻。然而，本研究基于非靶向代谢组学的KEGG通路分析得出的结论仍处于初步阶段，需要进一步验证。未来的研究可以结合使用其他组学方法来阐明这些途径背后的精确调控机制。通过评估血清中差异丰富的代谢物与肠道微生物属水平之间的Spearman相关性，进一步证实了E. faecalis HHP003引起的微生物变化与系统代谢变化之间的功能关联。4-羟脯氨酸是胶原蛋白和弹性蛋白的特征氨基酸，是衡量肠道黏膜完整性、胶原蛋白代谢和黏膜修复的关键生物标志物[53]。作为猫肠道中的典型共生细菌，双歧杆菌已被报道与肠道抗炎作用和稳态有关[54]。这种正相关关系紧密关联了肠道微生物群、氨基酸代谢和肠道黏膜健康。此外，与色氨酸相关的代谢物（5-羟基-L-色氨酸和N-甲酰色氨酸）与多个核心微生物属存在显著相关性。N-甲酰色氨酸与有益细菌呈正相关，与机会性病原体呈负相关，表明它可能作为肠道健康的代谢标志物。E. faecalis HHP003对N-甲酰色氨酸的调节可能代表了一种抑制病原菌和丰富有益菌群的重要机制。同时，5-羟基-L-色氨酸作为血清素合成的关键中间体，与Blautia属呈负相关。血清素是一种调节肠道蠕动和屏障功能的重要神经递质，其代谢紊乱与腹泻和肠道功能障碍密切相关[55]。因此，E. faecalis HHP003可能通过Blautia调节色氨酸-血清素代谢轴，从而影响肠道蠕动和炎症状态。尽管排除了有寄生虫感染史或出现贾第虫病临床症状的猫，但未进行特异性PCR检测或粪便寄生虫镜检以确认贾第虫感染。未来的研究应该包括对贾第虫的主动筛查，以完全排除益生菌补充可能产生的相互作用。综上所述，与MD组相比，EF组的猫在血清炎症反应、肠道炎症和屏障标志物、肠道微生物群结构以及代谢稳态方面均表现出显著改善。这些结果强调了E. faecalis HHP003在改善猫肠道健康方面的积极作用，表明该菌株具有应用于宠物食品中以提高猫健康状况的潜力。