Adhesive Adjuvant Protein for Long-Lasting Immune Response in Vaccination

《Biomaterials》：Adhesive Adjuvant Protein for Long-Lasting Immune Response in Vaccination

　　

尽管mRNA技术近期取得了进展，但亚单位疫苗因其较低的致病性风险、靶向免疫反应和优异的稳定性特征而仍然至关重要。然而，由于其免疫原性较低，需要有效的佐剂来引发与自然感染相当的强劲、持久的免疫力。传统的佐剂，如铝(Alum)，仅提供有限的细胞激活和快速的抗原清除，从而限制了其功效。同样，强效的肽佐剂也受到体内半衰期短的阻碍。生物工程化的贻贝粘附蛋白(MAP)因其独特的水下粘附特性和非免疫原性（归因于其固有的无序结构性质）而引起了广泛关注。在此，研究人员旨在建立一种受贻贝启发的粘合佐剂蛋白(AAP)，该蛋白利用MAP的水下粘附性和佐剂肽的免疫刺激效应。AAP能够形成原位交联的纳米颗粒疫苗，通过创建抗原库来模拟自然感染动力学。体外和体内评估证实，与Alum相比，该制剂显著延长了抗原和佐剂的滞留时间，从而诱导出强劲、持续且平衡的免疫反应。本研究证明了基于粘合佐剂蛋白的纳米颗粒疫苗可以引发有效的免疫反应并精细调节免疫反应，使其成为一种极具前景的疫苗候选物。

论文解读：基于贻贝粘附特性的粘合佐剂蛋白用于长效疫苗接种

研究背景与立项依据

COVID-19大流行凸显了mRNA疫苗的快速开发能力，但亚单位疫苗凭借其降低的致病风险、靶向免疫反应及优越的稳定性，依然是综合疫苗接种策略中不可或缺的一部分。然而，亚单位疫苗的主要局限性在于其固有的低免疫原性，通常无法引发针对自然感染（暴露时间通常为1-2周）所产生的大致持久免疫反应。传统铝基佐剂(Alum)虽安全且具有库效应，但其弱先天激活导致Th2偏向性激活和短期抗原释放，对抗病毒和细胞内细菌感染效果有限。虽然肽类佐剂具有精确的免疫原性和可设计性，但其快速的体内降解和清除限制了有效性。因此，开发能够模拟自然感染动态、实现长效抗原递送并增强免疫激活的新型佐剂系统成为当务之急。

研究内容与主要结论

为了克服上述挑战，研究人员受贻贝粘附蛋白(MAP)独特的水下粘附性能和潜在低免疫原性启发，构建了融合泛HLA-DR结合表位(PADRE)的粘合佐剂蛋白(AAP)。通过将生物工程化MAP与具有广泛MHC II类结合能力的PADRE肽融合，AAP既保留了MAP的强效粘附特性以防止快速清除，又利用了PADRE的强大免疫刺激功能。研究人员进一步利用静电相互作用制备了负载模型抗原卵清蛋白(OVA)的AAP纳米颗粒疫苗(OVA@AAP)。该体系在皮下注射后，经可见光照射触发原位交联，形成由二酪氨酸键、氢键和静电相互作用稳定的稳定疫苗库。这种粘合纳米颗粒疫苗平台旨在实现持续的抗原释放，促进树突状细胞(DCs)的持续吞噬和活化，从而驱动强劲的T细胞活化和B细胞反应，最终产生平衡且持久的免疫反应。该研究证实了AAP基纳米颗粒疫苗在延长抗原滞留时间和增强长效免疫反应方面的潜力，相关成果发表在《Biomaterials》。

关键技术方法概述

本研究主要采用了以下关键技术：首先，利用基因融合技术构建了由MAP和PADRE组成的粘合佐剂蛋白(AAP)；其次，通过静电相互作用自组装制备了负载模型抗原OVA的纳米颗粒疫苗(OVA@AAP)；第三，利用可见光诱导的原位交联技术在注射部位形成稳定的抗原库；第四，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中抗原特异性抗体滴度及亚型以评估体液免疫；第五，利用酶标仪和流式细胞术分析脾细胞增殖及细胞因子分泌情况以评估细胞免疫；最后，通过体内生物发光成像(IVIS)等手段监测抗原和佐剂在体内的滞留与分布。

研究结果详述

粘合佐剂蛋白的设计与表征

研究人员将PADRE肽序列融合至生物工程化MAP的C端，设计了AAP。PADRE作为一种多价佐剂肽，能与大多数MHC II类等位基因结合，而MAP则通过其富含儿茶酚胺的氨基酸组成提供水下粘附力。圆二色谱(CD)分析显示AAP保持了MAP固有的无序结构特征。表面等离子共振(SPR)分析证实AAP保留了与组织成分（如胶原蛋白）的强效粘附能力，表明其适合作为长效疫苗载体。

粘合佐剂蛋白基纳米颗粒疫苗的制备与表征

研究人员通过简单的混合方法，利用AAP与带负电的抗原OVA之间的静电相互作用，成功制备了粒径约200 nm的OVA@AAP纳米颗粒。透射电子显微镜(TEM)观察显示其形态均一。流变学测试表明，在可见光照射下，OVA@AAP悬液可发生凝胶化，其储能模量(G')显著增加，证实了原位交联的可行性。体外释放实验显示，与游离OVA或Alum组相比，OVA@AAP组的抗原释放显著延缓，表现出明显的缓释特征。

体外免疫原性评价

研究人员利用骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)评估了AAP的免疫刺激能力。结果显示，AAP能有效促进DCs的成熟，上调CD80、CD86及MHC II类分子的表达。此外，AAP处理组DCs分泌的细胞因子水平显著升高，表明其能有效激活先天免疫反应，为适应性免疫的启动奠定基础。

体内抗原滞留与分布

通过近红外荧光标记抗原并进行体内成像，研究人员发现AAP组在注射部位显示出显著的抗原滞留。与Alum组相比，AAP组在第14天时仍能在注射部位检测到明显的荧光信号，证明基于AAP的疫苗库能有效抵抗快速清除，实现长效抗原存留。

体内免疫应答评价

在C57BL/6小鼠模型中进行的免疫学评估显示，OVA@AAP组诱导产生了显著高水平的抗原特异性IgG及其亚类(IgG1和IgG2c)抗体，表明其能诱导平衡的Th1/Th2型免疫反应。相比之下，Alum组主要诱导Th2偏向性反应。此外，OVA@AAP组显著促进了脾细胞的增殖，并增加了干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)的分泌，证实了其诱导强劲细胞免疫的能力。

结论与讨论

研究人员得出结论，通过战略性地将MAP与通用T辅助表位PADRE融合，成功构建了受贻贝启发的粘合佐剂。由此开发的原位交联纳米颗粒疫苗平台旨在实现持续的抗原释放，同时放大免疫激活。AAP表现出卓越的适应性，能够将多种抗原或传统疫苗配制成具有增强免疫持久性的制剂。重要的是，AAP基纳米颗粒疫苗不仅延长了抗原半衰期，还通过模拟自然感染过程诱导了强烈且平衡的免疫反应。这项工作为开发下一代长效疫苗佐剂提供了一个有前景的策略，解决了传统亚单位疫苗免疫原性不足和现有佐剂系统无法兼顾长效滞留与强力激活的关键难题。