《Drug Discovery Today》：Artificial protein scaffolds for human therapeutics: drug discovery and delivery strategies
编辑推荐：
人工蛋白支架已成为解决单克隆抗体关键局限性（如分子尺寸大、组织穿透性差及生产工艺复杂）的下一代生物制剂。本综述讨论了主要的支架类别，包括抗体衍生型和非抗体平台，并重点介绍了工程策略，如理性设计、文库筛选、AI驱动的优化及多特异性形式。文章审视了其在药物发现中不
人工蛋白支架已成为解决单克隆抗体关键局限性（如分子尺寸大、组织穿透性差及生产工艺复杂）的下一代生物制剂。本综述讨论了主要的支架类别，包括抗体衍生型和非抗体平台，并重点介绍了工程策略，如理性设计、文库筛选、AI驱动的优化及多特异性形式。文章审视了其在药物发现中不断扩展的作用，包括靶点验证、苗头化合物识别、机制研究和伴随诊断，以及在肿瘤学、免疫治疗、感染性疾病、代谢性疾病和中枢神经系统（CNS）疾病中的治疗应用。文章进一步概述了支架赋能的药物递送策略、偶联方法及相关临床进展。同时讨论了关键的转化挑战，如免疫原性、药代动力学和大规模生产，以及整合人工智能和精准医疗以推进支架治疗的未来机遇。
引言
蛋白质在生理活动中扮演着催化化学反应、提供结构支持、促进运动、信号传导、免疫防御及储存分子等多种角色。膜蛋白作为受体、免疫调节因子及物质运输通道（如G蛋白偶联受体[GPCR]、血管紧张素转换酶[ACE]2、受体酪氨酸激酶和主要组织相容性复合体[TCR]复合物），对细胞通讯、免疫系统管理及体内平衡至关重要。随着蛋白质工程、合成生物学和计算设计的快速发展，现代药物发现领域发生了显著变革，推动了具有更高特异性、稳定性和治疗效果的下一代生物制剂的开发。在此背景下，人工蛋白支架作为一种新兴的工程化结合蛋白类别，为解决传统单克隆抗体的局限性提供了可行的替代方案。这些非免疫球蛋白蛋白框架经过理性设计，在保持稳定结构骨架的同时呈现可变的结合表面，从而实现高亲和力和高选择性的分子识别。其相对较小的分子量（通常为5-20 kDa）、稳健的折叠特性、易于基因操作及低成本生产的优势，使其能够有效应对抗体治疗的诸多限制，并作为多功能平台在精准医疗、靶向药物递送及下一代治疗设计中得到广泛探索。
人工蛋白支架的分类
人工蛋白支架主要分为两大类：抗体衍生支架和非抗体支架。抗体衍生支架是一类改良的生物制剂，保留了传统抗体的结构功能基序，但通过去除Fc段和糖基化位点解决了尺寸大、生产复杂等问题。此类支架包括单域抗体（dAbs）、纳米抗体（nanobodies）、单链可变片段（scFvs）、抗原结合片段（Fabs）、微型抗体（minibodies）和双特异性T细胞衔接器（BiTEs）。其分子质量通常在12-50 kDa，约为完整单克隆抗体（150 kDa）的十分之一，这极大地改善了组织扩散能力，并能触及空间位阻较大的表位。相比之下，非抗体蛋白支架则突破了免疫球蛋白的结构限制，基于多种天然存在的非免疫球蛋白蛋白设计而成，如设计锚蛋白重复蛋白（DARPins）、基于葡萄球菌蛋白A的Affibodies、基于脂质运载蛋白的Anticalins、基于纤维连接蛋白III型域的Monobodies/Adnectins、Knottins以及Kunitz结构域抑制剂。这些支架的分子量通常在5-20 kDa，具有极高的热稳定性和蛋白水解稳定性，能够穿透血脑屏障（BBB）等难以逾越的生理屏障，并在微生物系统（如大肠杆菌或酵母）中实现高产量表达，从而降低了生产成本并提高了可扩展性。
工程策略
支架创新依赖于能够实现精确控制结合、稳定性和药代动力学的工程方法。首先是文库构建（Library generation），通过引入功能性序列多样性（主要在α-螺旋环或结合表面），结合噬菌体展示、酵母展示和核糖体展示等高通量筛选（HTS）技术，从庞大的变体库中高效筛选出高亲和力、高选择性的结合剂。其次是理性设计（Rational design），该方法基于对蛋白质结构与功能相互作用的理解，利用计算建模选择性地构建具有最佳稳定性、结合亲和力和特异性的支架分子，通常涉及侧链rotamer库、分子对接和能量最小化等技术。第三是AI驱动优化（AI-driven optimization），深度学习模型（如RosettaFold和AlphaFold）能够以前所未有的准确性预测折叠稳定性和功能性结合，通过约束幻觉（constrained hallucination）和修复（inpainting）等技术，在几乎无限的蛋白质结构空间中探索新的支架构象，同时优化溶解度、稳定性和免疫原性等理化特性。此外，多价性和双特异性（Multivalency and bispecificity）设计通过增加结合结构域的数量，增强了结合亲合力（avidity）和治疗效力，允许同时靶向不同的表位或细胞类型，这对于免疫突触形成和复杂疾病通路调控至关重要。最后，偶联（Conjugation）策略通过位点特异性连接将酶、靶向配体、治疗载荷或成像剂连接到支架上，利用SH2、SH3、PDZ和GBD等适配结构域或生物正交化学反应（如SpyTag-SpyCatcher），实现了多功能蛋白结构的组装，显著提升了代谢通量或治疗效果。
在药物发现中的作用
人工蛋白支架因其独特的性质，在药物发现流程中扮演着核心角色。作为靶点验证工具（Target validation tools），它们能够针对难以成药的靶点（如突变型KRAS）进行生化扰动，其功能类似于药物，但具有更高的模块化和更低的脱靶活性。相较于小分子，基因编码的支架可在活体动物中进行时空可控的功能验证，极大提高了靶点临床价值的预测性。在苗头化合物识别（Hit identification）和先导优化（Lead optimization）阶段，通过展示技术筛选大型支架变体文库，获得中等亲和力的初始结合剂，随后利用易错PCR、定点诱变和DNA改组等定向进化手段，结合晶体学和冷冻电镜的结构解析，对结合界面进行精细打磨，优化其亲和力、特异性、溶解度和药代动力学特征。此外，支架在诊断和个性化医疗中也显示出巨大潜力，其高结合特异性和结构稳定性使其成为分子成像（如PET、SPECT）和生物传感器开发的理想工具，能够根据患者特定的分子特征实现分层治疗。
治疗应用
在治疗领域，人工蛋白支架已广泛应用于多种疾病模型。在肿瘤学（Oncology）中，Affibodies和DARPins等能够高效穿透实体瘤，并通过受体介导的内吞作用实现细胞内递送，甚至通过TOM/TIM复合物进入线粒体释放药物。其与细胞毒性药物（如美登素衍生物）或放射性核素的偶联物在临床试验中显示出比传统抗体药物偶联物（ADCs）更好的肿瘤穿透性和更快的系统清除率。在免疫治疗（Immunotherapy）中，基于支架的双特异性构建体（如MP0310、MP0317）能够同时结合T细胞和肿瘤抗原，或作为共刺激受体（如4-1BB、CD40）的激动剂/拮抗剂，有效调节肿瘤微环境中的免疫反应。在感染性疾病（Infectious diseases）方面，支架能够快速中和病毒（如SARS-CoV-2）和细菌病原体，且易于在大流行期间通过微生物系统进行规模化生产。对于代谢和遗传疾病（Metabolic and genetic disorders），支架可用于组装多酶复合物，通过底物通道效应显著提高代谢途径的效率（如甲羟戊酸产量提升77倍）。而在中枢神经系统（CNS）疾病中，支架的小尺寸使其能够跨越BBB，用于治疗阿尔茨海默病和帕金森病中的蛋白聚集，或作为神经再生支架（如聚己内酯[PCL]水凝胶）支持干细胞移植和轴突再生。
递送策略
人工蛋白支架作为药物递送载体具有高度适应性。主要的递送策略包括：1）受体介导的靶向，利用支架对疾病相关表面生物标志物（如HER2、EGFR）的高亲和力，通过网格蛋白或小窝蛋白介导的内吞作用进入细胞；2）支架-药物偶联物，类似于ADCs，但利用更小的尺寸实现更好的肿瘤渗透，通常采用pH敏感、酶切或谷胱甘肽响应的连接子以实现细胞内控释；3）半衰期延长，通过聚乙二醇化（PEGylation）、融合Fc段或白蛋白结合域来抵消小分子量带来的快速肾清除；4）与纳米技术的整合，将支架与脂质体、聚合物纳米颗粒和外泌体结合，发挥协同效应；5）细胞内递送，通过融合细胞穿膜肽（CPPs）、内体逃逸结构域或pH响应聚合物，实现对胞浆或核内靶点的干预；6）刺激响应性递送，设计对肿瘤微环境（TME）中酸性pH、缺氧、活性氧（ROS）或蛋白酶（如基质金属蛋白酶[MMPs]）敏感的支架，以提高治疗的精准度。
临床开发
人工蛋白支架已从概念迅速转化为临床候选药物。目前，多种支架（如DARPins、Affibodies、Anticalins和Nanobodies）正处于肿瘤学、免疫治疗和感染性疾病的临床试验阶段。例如，基于Kunitz结构域的Ecallantide（Kalbitor?）已获FDA批准用于治疗遗传性血管性水肿。DARPins的代表性药物Abicipar pegol（抗VEGF）在治疗年龄相关性黄斑变性（AMD）中显示出长效性。Affibody分子ABY-025已成功用于HER2阳性肿瘤的PET显像。尽管在临床转化过程中仍面临免疫原性评估、特定组织（如CNS或实体瘤）的给药优化以及监管审批等挑战，但随着重组表达技术的成熟和AI辅助设计工具的进步，人工蛋白支架的生产成本正在降低，候选药物的筛选效率不断提高。未来，通过整合先进的生物材料、精准靶向技术和AI驱动的设计，人工蛋白支架有望成为下一代生物制剂的核心组成部分，推动个性化医疗的发展。
