靶向朗格汉斯细胞的抗体介导的SOSIP HIV-1 Env递送增强体液免疫应答

《eBioMedicine》：Antibody-mediated targeting of SOSIP HIV-1 Env to skin Langerhans cells potentiates humoral responses

　　

摘要 背景 尽管经过数十年的研究和多项IIb/III期临床试验，有效的HIV疫苗仍未问世。一个关键的障碍是需要创新的递送策略，以诱导强效且持久的保护性免疫应答。靶向皮肤中的抗原呈递细胞，特别是朗格汉斯细胞(Langerhans cells, LCs)，通过促进体液免疫系统的早期和高效激活，提供了一种增强疫苗效力的有前景的方法。 方法 研究人员开发了一种抗体介导的靶向疫苗(Antibody-Mediated targeting Vaccine, AMV)平台，通过抗Langerin单链可变片段(scFv)结构域将HIV-1 Env三聚体抗原直接递送至LCs。测试了两种构建体：携带三聚体gp140z Env融合蛋白的LC3.Env3，以及携带特征明确的BG505 SOSIP.664三聚体的LC3.SOSIP。在无佐剂的情况下，在小鼠和兔子中评估了这些构建体的免疫原性，检测了引流淋巴结(draining lymph nodes, dLN)中的生发中心(germinal centre, GC)/滤泡辅助T细胞(Tfh)反应、Env-IgG产生和HIV-1中和能力。 结果 研究表明，与使用抗Langerin单抗融合Env单链相比，通过LC3.Env3将Env3靶向递送至LCs显著增强了Tfh和GC B细胞(BGC)的形成(p < 0.0001)，并扩大了小鼠体内Env特异性BGC细胞的数量(p < 0.05)。与非靶向三聚体Env相比，LC3.Env3增强了Env IgG应答(p < 0.05)。结果通过LC3.SOSIP构建体得到扩展，这些构建体维持了三聚体Env的结构完整性，并且与非靶向Env3和LC3Env3相比，显著促进了呈现所有主要四价依赖的广谱中和抗体(broadly neutralising antibodies, bNAbs)区域的天然构象、融合前闭合(pre-fusion-closed)结构的表达。LC3.SOSIP在兔子中诱导了强效的Env特异性抗体应答，具有跨亚型反应性，包括中和抗体(Neutralising antibodies, NeutAbs)，且未使用佐剂。最后，与非靶向SOSIP相比，LC3.SOSIP诱导了更强的Env IgG应答(p < 0.01)，即使在低抗原剂量下也是如此，并且对Tier-1A以及自体BG505 Tier-2病毒具有中和活性(8只兔子中有2只)。 解读 这些结果验证了LC靶向作为一种有效的、无佐剂的策略，用于诱导针对HIV-1的强效体液免疫应答。AMV平台能够精确地将结构完整的Env三聚体递送至皮肤常驻LCs，促进B细胞的早期激活和成熟。这种方法相对于传统的佐剂亚单位蛋白疫苗具有显著优势，支持其临床转化的潜力。 资助 这项工作得到了Inserm、疫苗研究所(VRI)、法国国家研究机构(ANR-10-LABX-77, ANR-10-INBS-05-02, ANR-10-EURE-0003)和欧盟Horizon 2020(资助号681032)的支持。

论文解读：靶向朗格汉斯细胞的HIV疫苗新策略

研究背景与意义

尽管HIV疫苗研究已持续数十年并进行了多项二期和三期临床试验，但能够有效预防HIV感染的疫苗仍未问世。主要的障碍在于缺乏能够诱导强效且持久保护性免疫应答的创新策略。皮肤作为人体最大的免疫器官，富含抗原呈递细胞，特别是朗格汉斯细胞(Langerhans cells, LCs)，其在启动体液免疫反应中扮演着关键角色。既往研究表明，通过Langerin受体靶向递送抗原至LCs，能够有效促进滤泡辅助T细胞(Tfh)和生发中心(GC) B细胞的反应。然而，如何将结构复杂、易变构的HIV-1包膜糖蛋白(Env)三聚体，尤其是具有天然构象的SOSIP，高效且完整地递送至LCs，并诱导广谱中和抗体(bNAbs)，仍是该领域面临的巨大挑战。为此，研究人员开发了抗体介导的靶向疫苗(Antibody-Mediated targeting Vaccine, AMV)平台，旨在通过精确靶向LCs来增强HIV疫苗的免疫原性，相关成果发表在《eBioMedicine》上。

关键技术方法

本研究采用了多种核心技术手段。首先，研究人员构建了基于抗Langerin单链可变片段(scFv)的单价(LC.Env)和新型三价(LC³.Env³、LC³.SOSIP)靶向疫苗载体，并利用哺乳动物细胞表达系统生产了重组蛋白。其次，利用表面等离子共振(SPR)和生物层干涉技术(BLI)等技术验证了构建体与人和兔Langerin受体的高亲和力结合。在动物实验方面，研究使用了C57BL/6J小鼠和新西兰大白兔作为模型，通过皮内(i.d.)或皮下(s.c.)途径进行免疫，并在无佐剂条件下评估免疫原性。流式细胞术被用于详细分析引流淋巴结(dLN)中的Tfh细胞、GC B细胞及抗原特异性B细胞。此外，通过酶联免疫斑点(ELISpot)检测IFN-γ分泌，利用Luminex技术定量血清Env特异性IgG水平，并通过TZM-bl细胞实验评估了血清对多种HIV假病毒株（包括Tier-1A和Tier-2）的中和活性。免疫荧光(IF)和免疫组化则用于观察淋巴结内的GC结构和FDC网络。

研究结果

1. LC³.Env³疫苗的开发与设计

研究人员设计了将HIV-1 Env gp140z三聚体通过柔性连接子与三个抗Langerin scFv融合的LC³.Env³构建体。质量控制和结合实验证实，该构建体保持了三聚体结构和高纯度，并能以纳摩尔级亲和力与人、鼠、兔的Langerin受体结合，其结合特性与单价LC.Env相当，表明scFv形式并未损害其靶向能力。

2. LC³.Env³免疫诱导引流淋巴结Tfh和B细胞群的改变

在小鼠模型中，与单价LC.Env或非靶向Env三聚体相比，双剂量的LC³.Env³免疫显著增加了引流淋巴结中CXCR5⁺PD-1⁺Tfh细胞和Fas⁺GL-7⁺GC B细胞的比例(p < 0.0001)。同时，总B细胞、抗体分泌细胞(ASCs)和记忆B细胞的数量也显著增加。这表明三价设计能更有效地促进GC反应。

3. LC³.Env³改善了LC靶向效果

进一步的免疫分析显示，LC³.Env³诱导了显著的Env特异性IFN-γ分泌T细胞应答和更高频率的Env特异性GC B细胞。Luminex检测表明，LC³.Env³诱导的Env特异性IgG滴度显著高于对照组，且应答动力学更快。这证实了三价靶向策略在诱导体液免疫方面的优越性。

4. LC³.Env³促进三聚体Env被朗格汉斯细胞摄取、递送至引流淋巴结及早期GC形成

通过荧光标记的抗原追踪实验发现，LC³.Env³能被LCs高效地摄取并迁移至引流淋巴结，其阳性细胞数量显著高于非靶向Env组。组织学分析显示，LC³.Env³免疫后，淋巴结内形成了典型的GC结构，伴有PNA染色阳性和CD35⁺滤泡树突状细胞(FDC)网络的建立。即使在低剂量(250 ng)免疫下，LC³.Env³仍能诱导持久的IgG应答，且效应可持续超过200天。

5. LC³.SOSIP构建体的设计与表征

为了验证平台对更稳定抗原的适用性，研究人员将临床测试过的BG505 SOSIP.664结构整合进AMV平台，设计了LC³.SOSIP(s)和LC³.SOSIP(w)两种构建体。生化分析和电子显微镜证实了其正确的三聚体构象和Propeller-like结构。

6. LC³稳定化增强bNAbs对HIV Env免疫原的识别

利用广谱中和抗体(bNAbs)面板进行的结合实验表明，LC³.SOSIP构建体能够有效呈现CD4结合位点(CD4bs)、V3聚糖、三聚体顶端(Apex)以及gp120/gp41界面等多个关键表位。特别是针对PGT145、PG9和PGT151等依赖于四价结构的bNAbs，LC³.SOSIP(w)表现出比普通SOSIP(w)更强的结合能力，证明了LC³稳定化有助于维持Env的天然构象。

7. 兔体内LC³.Env³和LC³.SOSIP免疫诱导Tier-1A和Tier-2 HIV-1中和抗体

在兔子模型中，无佐剂的LC³.SOSIP免疫诱导了高水平的Env特异性IgG，且这些抗体能交叉识别异源支系的Env抗原。中和实验结果显示，LC³.SOSIP(s)和LC³.SOSIP(w)免疫的兔子血清能有效中和Tier-1A病毒(MW965.26, SF162.NW)。尤为重要的是，在低剂量(4 μg)免疫条件下，LC³.SOSIP(w)在2/5的兔子中诱导了对自体BG505 Tier-2病毒的中和活性，而对照组则未观察到此现象。相比之下，传统的非靶向SOSIP即使在高剂量或联合佐剂(MPLA)下，其诱导的中和抗体滴度和广度也显著低于LC靶向组。

讨论与结论

本研究确立了LC靶向作为一种多功能且具有前景的HIV疫苗开发平台。通过将稳定的HIV-1 Env三聚体（包括gp140z和SOSIP）与三价抗Langerin scFv载体融合，研究人员实现了抗原向皮肤朗格汉斯细胞的高效、精确递送。这种策略不仅促进了抗原向引流淋巴结的转运，还显著增强了GC反应和Tfh细胞的辅助功能，从而在无需佐剂的情况下诱导了强效、持久且具有中和活性的Env特异性IgG抗体。

研究结论指出，LC³.SOSIP构建体成功克服了传统亚单位疫苗在诱导GC反应和广谱中和抗体方面的局限性。该AMV平台通过维持Env三聚体的天然构象和关键表位（如PGT145/PG9识别的Apex区域），为诱导针对Tier-2病毒的bnAbs提供了新的途径。此外，该策略在低抗原剂量下的高效性，预示着其在降低生产成本和临床转化方面的巨大潜力。综上所述，靶向朗格汉斯细胞的抗体介导疫苗策略代表了下一代HIV疫苗设计的一个重要方向。