补中益气汤的调节机制通过影响Wnt5a/β-连环蛋白信号通路，减轻自身免疫性甲状腺炎小鼠的甲状腺炎症损伤

《Endocrine Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets》：Mechanism of Buzhong Yiqi Decoction Modulates the Wnt5a/β-catenin Signaling Pathway to Ameliorate Thyroid Inflammatory Damage in Mice with Autoimmune Thyroiditis

郝高|刘子玉|赵卓|李家云|王志敏|曹慧敏|陈一然|陈思|金哲|杨晓
辽宁中医药大学研究生院，沈阳110847，中国

**引言**
本研究旨在探讨补中益气汤通过Wnt5a/β-连环蛋白信号通路改善自身免疫性甲状腺炎（AIT）小鼠炎症损伤的机制。

**方法**
选取60只8周大的NOD.H-2h4 SPF等级小鼠，随机分为6组：对照组、模型组、低剂量、中剂量和高剂量补中益气汤组（分别为4.78、9.56、19.12 g·kg?1）以及西药组（硒酵母片，3.033×10?? g·kg?1），每组10只小鼠。所有AIT模型小鼠均自由饮用0.05%碘化钠溶液8周以建立模型，而对照组则自由饮用蒸馏水。采用ELISA、HE染色、实时PCR和Western Blot技术检测血清抗体、甲状腺病理变化以及Wnt5a、β-连环蛋白、PPAR、GSK-3β、IL-1β和IL-6的表达水平。

**结果**
模型组显示TgAb和TPOAb水平升高（P<0.01），淋巴细胞浸润增多，Wnt5a、β-连环蛋白、PPAR、GSK-3β、IL-1β和IL-6的表达改变（P<0.01）。补中益气汤组和西药组显著降低了这些不良效应，表明甲状腺功能和炎症得到了改善。

**讨论**
补中益气汤调节Wnt5a/β-连环蛋白通路，提示其可能通过减少炎症和恢复甲状腺功能来治疗AIT。

**结论**
补中益气汤能有效改善AIT引起的炎症损伤，其对Wnt/β-连环蛋白信号通路的调节可能是其作用机制之一。

**1. 引言**
自身免疫性甲状腺炎（AIT）是一种常见的器官特异性自身免疫性疾病，由免疫耐受性丧失和免疫系统对甲状腺组织的错误攻击导致[1]，其特征是甲状腺球蛋白抗体（TgAb）和甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）水平升高，以及淋巴浆细胞浸润、纤维化、淋巴滤泡形成和实质萎缩等组织学变化。桥本氏甲状腺炎（HT）是最常见的临床表现[2]。流行病学研究表明，中国成年人群中TPOAb和TgAb的阳性率分别为11.5%和12.6%，且随年龄增长患病率上升[3]。随着疾病进展，AIT患者可能出现甲状腺功能减退，甚至并发多种系统性疾病，如黏液性水肿、甲状腺心肌病和代谢紊乱[4, 5]。该病严重影响患者生活质量，增加了社会医疗资源的需求，近年来受到广泛关注。目前，甲状腺激素对症治疗是公认的AIT疗法，但缺乏针对其发病机制的特异性药物。近期研究表明，中医药在改善甲状腺组织损伤和临床症状方面具有独特优势[6, 7]。基于多年临床经验，研究团队认为AIT的发病机制与脾虚密切相关，而补中益气汤具有补气健脾的作用[8]。此外，先前研究发现补中益气汤可通过多种机制干预AIT的炎症过程，如调节辅助T17细胞（Th17）/调节性T细胞（Treg）的免疫失衡[9-11]，具有显著治疗效果。因此，进一步探索补中益气汤的作用机制和相关靶点具有重大意义。Wnt信号通路在炎症和癌症等多种生理病理过程中起重要作用[12, 13]，被认为是类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的潜在治疗靶点[14]。吴等人发现，在HT的发病机制中，干扰素γ（IFN-γ）等炎症因子可激活糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）信号分子，增加β-连环蛋白降解并抑制Wnt信号通路[15]。傅等人在肺腺癌细胞A549中发现补中益气汤可通过激活GSK-3β介导的Wnt/β-连环蛋白信号通路发挥作用[16]。然而，补中益气汤是否通过激活Wnt/β-连环蛋白通路干预AIT的发展尚未得到证实。因此，在前人研究基础上，本研究以炎症损伤为切入点，探讨补中益气汤通过激活Wnt/β-连环蛋白通路抑制AIT炎症的机制，旨在为其预防和治疗提供理论和实验依据。

**2. 材料与方法**
2.1. 实验动物
60只8周大的SPF NOD.H-2h4小鼠（雌雄各半），随机分为6组：空白组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组及西药组，每组10只（每组5只雄性和5只雌性）。通过让小鼠自由饮用0.05%碘化钠溶液8周建立AIT模型。模型建立后，各治疗组继续按相应剂量给药8周，空白组和模型组则饮用蒸馏水。小鼠体重为（20 ± 2）克，购自杰克逊实验室（品系号004447，动物证书号2211A01937），并在辽宁中医药大学实验动物中心的SPF实验室饲养。室内温度保持在20–25°C，相对湿度为50% ± 20%，光照和黑暗周期交替。本实验经辽宁中医药大学伦理委员会批准（伦理审查编号21000042021128）。严格遵循国家关于实验动物护理和使用的规定。
2.2. 实验药物
药材：黄芪根（18克）、党参（9克）、甘草炙（9克）、人参（6克）、陈皮（6克）、柴胡根（6克）、当归（3克）。这些中药片由安徽普仁中药饮片有限公司生产，购自辽宁中医药大学附属医院，并经该校 Second Affiliated Hospital 的杨晓教授鉴定。所有药材符合2020版《中华人民共和国药典》标准。制备方法如下：将药材浸泡于8倍体积的蒸馏水中1小时，中火煮沸后加入适量蒸馏水，文火煎煮30分钟，过滤，浓缩至1.0 g/mL。阳性对照药物：硒酵母片（牡丹江灵泰制药有限公司），规格50 μg/片，中药批准号H10940161。使用前将片剂研磨成粉末，配制浓度为1.625 mg/L的悬浮液，冷藏保存备用。
2.3. 主要试剂和仪器
Wnt5a多克隆抗体、β-连环蛋白多克隆抗体、PPARA单克隆抗体、GSK-3β多克隆抗体、IL-1β多克隆抗体、IL-6多克隆抗体和GAPDH单克隆抗体购自武汉三英生物科技有限公司，批号分别为55184-1-AP；51067-2-AP；66826-1-Ig；14850-1-AP；16806-1-AP；21865-1-AP；60004-1-Ig。HiFiScript gDNA去除试剂盒和MagicSYBR混合物PCR扩增试剂盒购自北京康威世纪生物技术有限公司，批号分别为19223和17623。PCR引物由大连宝生物科技有限公司设计合成。SpectraMax i3多功能全波长微孔读数仪购自美谷分子仪器有限公司。THZ-82水浴振荡器、WIX-miniPRO4垂直电泳槽和WIX-miniBLOT转移槽由常州志博锐公司提供。Tanon-5200显影仪购自上海泰昂公司。计算机自动的组织脱水机购自常州郝信林医学仪器有限公司。其他设备包括显微镜（徕卡，德国）、生物显微镜（尼康，日本）、ST16R超速离心机、ABI 7500实时荧光定量PCR仪和超微量紫外分光光度计（Thermo Fisher）。
2.4. AIT模型建立与分组
对照组小鼠饮用蒸馏水，其他组按国际建模标准进行处理[17]，让小鼠自由饮用0.05%碘化钠溶液8周。显微镜检查显示甲状腺组织中有大量淋巴细胞浸润，血清自身免疫抗体水平升高，表明模型建立成功[18]。模型建立后，低剂量、中剂量和高剂量补中益气汤组分别给予4.78 g·kg?1、9.56 g·kg?1和19.12 g·kg?1的补中益气汤，中剂量相当于人体临床用量。西药组给予3.033 × 10?? g·kg?1的剂量。其他组每天饮用相同体积的蒸馏水8周。
2.5. HE染色检测甲状腺组织病理状态
各组小鼠的甲状腺组织用4%甲醛固定，用二甲苯冲洗，通过梯度乙醇系列脱水。然后用hematoxylin染色5分钟，直至细胞核变蓝，再次用梯度乙醇系列脱水，用eosin染色5分钟，最后用中性树胶封片。在光学显微镜下评估各组甲状腺组织中的炎症细胞浸润程度。
2.6. ELISA检测血清中TGAb和TPOAb水平
小鼠用1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉。血液样本室温静置2小时后，以3000 rpm离心10分钟（所有后续离心步骤均使用2.5 cm离心半径）。严格按照ELISA说明书测定血清甲状腺球蛋白抗体（TGAb）和甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）水平。
2.7. RT-qPCR检测NOD.H-2h4小鼠甲状腺中Wnt5a、β-连环蛋白、PPAR、GSK-3β、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平
严格按照Trizol试剂说明书提取动物甲状腺细胞的总RNA，用紫外分光光度计测量260 nm和280 nm处的吸光度（A值），根据A260/A280比值计算RNA纯度。取2 μL总RNA作为模板，使用oligo-dT作为引物进行反转录，反应体积为20 μL，条件为37 °C 15分钟后再加热至85 °C 5秒。实时定量反转录PCR的反应条件为：95 °C 1循环5分钟；95 °C 5秒和60 °C 34秒40循环；最后95 °C 15秒、60 °C 1分钟和95 °C 15秒1循环。为消除样本提取、反转录和PCR过程中的差异，同时检测内参基因β-actin的表达。完成PCR循环后，使用2 ΔΔCT方法计算各组目标基因的相对表达水平（表1）。
表1. 基因引物序列
| 基因 | 引物序列 | bp |
|---------------|----------------|---------|
| Wnt5a | CAACTGGCAGGACTTTCTCAA | 128 |
| β-连环蛋白 | CATCTCCGATGCCGGAACT | 108 |
| PPAR | AGAGCCCCATCTGTCCTCTC | 153 |
| GSK-3β | TGGCAGCAAGGTAACCACAG | 189 |
| IL-1β | GCAACTGTTCCTGAACTCA | 118 |
| β-actin | GGCTGTATTCCCCTCCAT | 154 |
| IL-6 | CCAAGAGGTGAGTGCTTCCC | 118 |
2.8. Western Blot检测AIT小鼠甲状腺中Wnt5a、β-连环蛋白、PPAR、GSK-3β、IL-1β和IL-6蛋白表达
取甲状腺组织用玻璃匀浆器匀浆，加入蛋白裂解液后在冰上孵育30分钟裂解细胞。以12,000 rpm离心5分钟，收集上清液。用紫外分光光度计测量280 nm处的吸光度，绘制标准曲线并计算蛋白质浓度。准备聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）。将样品加入加载缓冲液，沸水加热5分钟使蛋白质完全变性，进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转移到膜上。转移后用TBST洗膜两次。1. 用5%脱脂牛奶封闭膜1小时；封闭后，用TBS冲洗膜三次。添加Wnt5a（1:3000）、β-连环蛋白（1:5000）、PPARγ（1:3000）、GSK-3β（1:3000）、IL-1β（1:2000）和IL-6（1:2000）的一抗，并在4°C下孵育过夜。第二天，用TBST冲洗膜三次。根据说明书准备二抗稀释溶液，使用兔二抗（1:2000）和小鼠二抗（1:5000），并在室温下摇床中孵育1小时。用TBST冲洗膜三次，然后使用ECL底物显色以检测条带。捕捉条带的图像，并使用适当的软件定量分析每个蛋白质条带的灰度值。

2.9. 统计分析
使用SPSS 23.0软件进行数据统计分析。多个样品组均符合正态性检验和方差同质性检验，采用单因素方差分析。测量数据表示为平均值±标准差（±SD），P < 0.05具有统计学意义。

3. 结果
3.1. 步中益气汤对AIT小鼠血清TGAb和TPOAb水平的影响
与对照组相比，模型组的血清TGAb（图1A）和TPOAb（图1B）水平显著升高（P < 0.01）。与模型组相比，歩中益气汤组和西药组的血清抗体TGAb和TPOAb水平显著降低（P < 0.01）。

3.2. 步中益气汤对AIT小鼠甲状腺病理生物学的影响
对照组的小鼠甲状腺滤泡结构完整，形状规则，呈圆形或椭圆形，大小相似，滤泡间隙内无淋巴细胞浸润。与模型组相比，模型组的甲状腺滤泡大小不一，滤泡上皮细胞排列紊乱，形态异常。大多数滤泡结构被破坏并萎缩，大量的淋巴细胞浸润到滤泡间隙中。与模型组相比，歩中益气汤中剂量组的甲状腺滤泡上皮细胞排列整齐，滤泡腔萎缩，胶质含量减少，出现吸收空泡，淋巴细胞浸润程度显著改善（图2A）。此外，HE图像的半定量分析显示各组之间组织病理变化存在显著差异（图2B）。

3.3. 步中益气汤处理后的AIT小鼠甲状腺组织中Wnt5a、β-连环蛋白、PPAR、GSK-3β、IL-1β和IL-6的mRNA表达
与对照组相比，模型组的Wnt5a、β-连环蛋白和PPAR水平显著降低（P < 0.01），而GSK-3β、IL-1β和IL-6水平显著升高（P < 0.01）。与模型组相比，每个治疗组的Wnt5a、β-连环蛋白和PPAR水平显著升高（P < 0.05, P < 0.01），GSK-3β、IL-1β和IL-6水平显著降低（P < 0.01）（见图3A–3F）。

3.4. 步中益气汤处理后的AIT小鼠甲状腺组织中Wnt5a、β-连环蛋白、PPAR、GSK-3β、IL-1β和IL-6的蛋白质表达
与对照组相比，模型组的Wnt5a、β-连环蛋白和PPAR水平显著降低（P < 0.01），而GSK-3β、IL-1β和IL-6水平显著升高（P < 0.01）。这些变化在图4A-F中进行了可视化表示和统计分析，蛋白质表达见图4G。

4. 讨论
sebagai salah satu penyakit autoimun yang umum, patogenesis AIT masih belum jelas. Diperkirakan penyakit ini erat kaitannya dengan faktor lingkungan, genetik, dan imun. Imunitas dan inflamasi terbukti memainkan peran kunci sepanjang proses AIT. Inflamasi merupakan respons perlindungan tubuh terhadap rangsangan berbahaya seperti cedera dan infeksi. AIT termasuk dalam kategori “penyakit gall” dalam kedokteran tradisional Cina. Berdasarkan pengalaman diagnosis dan pengobatan klinis selama bertahun-tahun oleh tim peneliti, konsep resep dokter kuno dirangkum, dan kekurangan temper (energi vital) merupakan akar penyebab AIT. Limpa merupakan dasar dari sifat yang diperoleh, dan jika limpa kehilangan fungsinya untuk bergerak dan membela tubuh, hal ini secara bertahap menyebabkan ketidakmampuan tubuh untuk bergerak dan mencegah serta mengendalikan patogen internal dan eksternal, menyebabkan stagnasi qi, penumpukan phlegm, dan pembekuan darah di bagian depan leher, yang kemudian mengakibatkan penyakit gall. Oleh karena itu, berdasarkan bukti tersebut, pengobatan harus berfokus pada pengaktifan qi dan penguatan limpa. Resep kuno歩中益气汤 berasal dari Li Dongyuan, salah satu dari empat dokter hebat dinasti Jin dan Yuan. Resep ini terdiri dari berbagai bahan herba yang saling melengkapi, seperti ginseng, licorice yang digoreng, Atractylodes, yang berfungsi untuk mengaktifkan qi dan memperkuat limpa; Angelica untuk menyuburkan darah; dan bahan lainnya yang membantu mengatur qi dan lambung, sehingga semua bahan dapat berfungsi secara efektif tanpa stagnasi. Dosis sedang dari歩中益气汤 secara signifikan memperbaiki kondisi ginjal (图2A). Selain itu, analisis semi-kuantitatif pada gambar histologi (HE images) menunjukkan perbedaan yang signifikan antar kelompok (图2B).

Penelitian juga menunjukkan bahwa歩中益气汤 dapat mengurangi berbagai faktor patologis pada jaringan tiroid (图3). Pada tikus model AIT, ukuran dan bentuk folikel tiroid berbeda, sel epitel folikel tidak teratur, dan sebagian besar struktur folikel rusak serta mengalami atrofi, dengan banyak sel limfosit yang menginfiltrasi ke dalam folikel. Dosis sedang dari歩中益气汤 secara signifikan meningkatkan kondisi ini (图2A). Analisis mRNA menunjukkan penurunan ekspresi gen Wnt5a, β-连环蛋白, PPAR, GSK-3β, IL-1β, dan IL-6 (图3A–3F). Selain itu, penelitian protein menunjukkan peningkatan ekspresi protein terkait jalur sinyal Wnt5a/β-連環蛋白 (图4A-F). Penggunaan步中益气汤 juga telah terbukti dapat mengurangi kadar antibodi TGAb dan TPOAb dalam serum tikus AIT (图1), serta memperbaiki kondisi inflamasi dan patologi tiroid (图2).此外，补中益气汤能够上调Wnt5a、β-连环蛋白和PPAR的表达，下调GSK-3β的mRNA和蛋白质表达，减轻自身免疫性甲状腺炎（AIT）的炎症损伤，降低淋巴细胞浸润程度，并通过RT-qPCR和Western Blot技术保护甲状腺功能。我们的研究团队认为，补中益气汤可以降低TGAb和TPOAb的水平，减轻炎症反应，其治疗效果非常显著，在中等剂量时最为明显。这种效应可能与Wnt/β-连环蛋白信号通路的激活有关。然而，本研究对于补中益气汤改善小鼠AIT的分子机制的解析仍然有限。我们仅通过体内实验初步探讨了补中益气汤如何通过这一途径预防和治疗AIT；精确调控AIT相关炎症损伤中的Wnt5a/β-连环蛋白信号通路仍需通过激活剂或其他工具进行严格验证。因此，补中益气汤是否通过选择性调节Wnt5a/β-连环蛋白通路来治疗AIT，以及哪些活性成分起关键作用，将是我们未来工作的重点。

结论

本研究证实，补中益气汤通过潜在地调节Wnt5a/β-连环蛋白信号通路显著减轻AIT中的炎症损伤。我们的发现表明，这种传统中药配方可能成为AIT的一种有前景的治疗选择。我们的研究结果强调了补中益气汤在临床应用中的潜力，需要进一步研究其优化和应用。此外，我们的成果为未来探索该中药的抗炎作用机制奠定了基础。

作者贡献

作者对本文的贡献如下：研究构思与设计：XY；概念化：ZW、YC；数据收集：SC；数据整理：HC；方法学：JL；可视化：ZZ、ZJ；初稿撰写：HG、ZL。所有作者均审阅了研究结果并批准了最终稿件。

伦理审批与参与者同意

本研究中的动物实验获得了辽宁中医药大学伦理委员会的批准（伦理审批编号：21000042021128）。

人类与动物权利

动物实验遵循《实验动物护理和使用指南》进行。本研究符合国际公认的动物研究标准，遵循3R原则（减少动物痛苦、提高动物福利和优化实验设计）。实验报告遵循ARRIVE指南，以促进伦理研究实践。

出版同意

不适用。

数据与材料的可获取性

所有数据和支持信息均包含在文章中。

资助

国家自然科学基金（8227445、82104805）；辽宁省教育厅重点研究项目（JYTZD2023196）；辽宁省科技厅联合基金项目（2023-MSLH-154）；尹远平全国著名老中医传承工作室项目；辽宁中医药大学元志项目（32101A1007）。

利益冲突

作者声明不存在任何财务或其他形式的利益冲突。