尺寸依赖性AIENPs增强了RPA-CRISPR/Cas12a介导的侧向流动分析方法，用于超灵敏检测金黄色葡萄球菌

《Food Chemistry》：Size-dependent AIENPs enhanced RPA-CRISPR/Cas12a mediated lateral flow assay for ultrasensitive detection of Staphylococcus aureus

　　

熊远倩|叶沙玲|郭玉倩|李莉|黄晓琳|熊永华

中国江西省南昌市南昌大学食品科学与资源国家重点实验室，邮编330047

摘要

在本研究中，我们开发了一种侧向流动分析法（LFA），该方法结合了聚集诱导发光纳米颗粒（AIENPs）与重组酶聚合酶扩增（RPA）和CRISPR/Cas12a技术，用于超灵敏地检测金黄色葡萄球菌（S. aureus）。我们系统评估了AIENP颗粒大小（250、350、450和600纳米）对LFA检测性能的影响。值得注意的是，450纳米的AIENPs由于其低背景信号和尺寸依赖性的发光特性显著提高了条带的灵敏度。在最佳条件下，AIENPs-LFA的灵敏度比传统的AuNPs-LFA提高了100倍。结合RPA技术，该方法对金黄色葡萄球菌的检测下限（LOD）低至9.95 CFU/mL，具有宽广的线性检测范围（2.4–2.4 × 10^4 CFU/mL），并且对其他食源性病原体具有高特异性。内部和跨实验验证表明，在添加了金黄色葡萄球菌的牛奶样品中，该方法具有高准确率（回收率83.13%–106.93%）和高精确度（RSD < 14.42%）。

引言

金黄色葡萄球菌（S. aureus）是最普遍且危害最大的食源性病原体之一，在食品安全方面带来了重大挑战（Guo等人，2024；Jiao等人，2023；Ma等人，2024）。除了引起食物中毒外，它还与多种临床感染有关，包括菌血症、感染性心内膜炎以及皮肤和软组织疾病（Bencardino等人，2021；Oniciuc等人，2017；Rubab等人，2018）。传统的培养基检测方法通常需要3至5天才能确定结果，这既耗时又费力，从而阻碍了临床和食品安全监测中对快速检测的需求（Velusamy等人，2010）。尽管基于聚合酶链反应的DNA扩增技术具有高灵敏度和特异性，但它们依赖于设备齐全的实验室和熟练的技术人员，限制了其在基层实验室或资源有限地区进行现场检测的可行性（Frickmann，2022；G. Liu，2025）。因此，开发一种能够准确检测金黄色葡萄球菌的便携式快速检测方法具有重要的实际意义。

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统作为细菌的适应性免疫机制，已成为基因编辑、筛查和分子诊断中的多功能工具（J. S. Chen等人，2018；Duan等人，2024；Han等人，2026）。具体来说，CRISPR/Cas12a系统在crRNA的引导下可以识别目标双链DNA（dsDNA），触发其切割活性以降解单链DNA（ssDNA）报告基因并产生可检测的信号（J. S. Chen等人，2018）。为了促进即时检测（POC），CRISPR/Cas12a已与侧向流动分析法（CRISPR/Cas12a-LFA）相结合，提供了一种简单便携的检测方式（P.-R. Li等人，2024；H. Liu等人，2023）。大多数报道的CRISPR/Cas12a-LFA平台使用金纳米颗粒（AuNPs）作为比色探针，因为它们颜色鲜艳、合成容易且生物相容性良好（Lin等人，2025；Zhou等人，2022）。然而，常用的20–40纳米大小的AuNPs由于摩尔消光系数较低，其比色信号相对较弱，导致检测灵敏度不足（Ding等人，2019；Zhao等人，2025）。与较小的AuNPs相比，较大尺寸的AuNPs（如80纳米）具有更高的摩尔消光系数，有助于提高LFA的灵敏度（Jain等人，2006）。尽管如此，我们之前的研究表明，使用过大的AuNPs作为探针会降低LFA的灵敏度，因为直径过大的AuNPs（>100纳米）会产生显著的光散射（X. Chen等人，2022；J. Li等人，2016）。这一固有缺陷限制了通过增大AuNPs颗粒尺寸来增强信号放大的潜力。

近年来，聚集诱导发光（AIE）材料因其独特的光物理性质而受到广泛关注（Shen等人，2024；Zhang等人，2025）。与传统荧光染料不同，AIE分子在分散状态下荧光较弱，但在聚集状态下会发出强烈的荧光（Y. Chen等人，2017）。通过物理嵌入或化学偶联将AIE分子封装在纳米材料中，形成聚集诱导发光荧光纳米颗粒（AIENPs），可以稳定其聚集状态，最大化AIE效应并显著提高荧光强度（FI）（Z. Li等人，2025；S. Liu等人，2025；Wang等人，2025）。理论上，增大AIENPs的颗粒尺寸可以装载更多的AIE分子，从而提高每个纳米颗粒的荧光强度。我们假设这种尺寸依赖性的荧光增强可以显著提高侧向流动条带的灵敏度，为解决AuNPs-LFA的灵敏度限制提供了一种策略性解决方案。

在本研究中，我们系统地研究了AIENP大小对CRISPR/Cas12a-AIENPs-LFA灵敏度的影响。通过结合重组酶聚合酶扩增（RPA），我们实现了对经过巴氏杀菌的牛奶中金黄色葡萄球菌的快速和超灵敏检测。如图1所示，提取的基因组DNA首先通过RPA扩增，然后被CRISPR/Cas12a系统识别，后者无选择性地切割单链DNA报告基因（5’-Digoxin-ssDNA-Biotin-3′）。在没有目标双链DNA的情况下，完整的单链DNA报告基因连接到抗地高辛单克隆抗体标记的AIENPs（AIENP@mAbs）上，并进一步被测试线（T）上的链霉亲和素（SA）捕获，产生强烈的荧光信号。相反，在目标双链DNA存在的情况下，单链DNA报告基因被切割，阻止了AIENP@mAb的捕获，导致信号减弱。在最佳条件下，所开发的AIENPs-LFA对金黄色葡萄球菌的检测限（LOD）为9.95 CFU/mL，比传统的AuNPs-LFA灵敏度高约100倍。通过对人工污染的巴氏杀菌牛奶样品进行内部和跨实验验证，进一步证明了CRISPR/Cas12a-AIENPs-LFA的优异准确性和重复性。总体而言，该平台提供了一种快速、灵敏且用户友好的方法，可用于现场检测金黄色葡萄球菌，为资源受限地区的食品安全监测提供了重要潜力。

章节片段

材料和设备

所有寡核苷酸，包括用于RPA的目标特异性引物、目标双链DNA、crRNA、Digoxin-ssDNA-Biotin报告基因和ssDNA-FQ报告基因（5’-FAM-ssDNA-BHQ1–3′）（表S1），均由Sangon Biotech（上海）有限公司（中国上海）合成。RPA试剂盒来自Amplification Future有限公司（中国常州），LbCas12a购自New England Biolabs（美国马萨诸塞州伊普斯威奇）。DNA提取试剂盒来自山东SparkJade生物技术有限公司。

AIENP颗粒大小对条带灵敏度的影响

使用透射电子显微镜（TEM）对四种不同尺寸的AIENPs进行了形貌分析。如图1a-d所示，所有颗粒均呈现均匀的球形形态、均匀的尺寸分布和良好的分散性。动态光散射分析进一步确认了这四种AIENPs的流体动力学直径分别为250、350、450和600纳米（图1e-h），这与TEM观察结果一致。

结论

总结来说，我们成功开发了一种创新的RPA-CRISPR/Cas12a AIENPs-LFA平台，用于快速和超灵敏地检测金黄色葡萄球菌。得益于450纳米AIENPs优异的发光性能和较低的背景信号，AIENPs-LFA的灵敏度比传统的AuNPs-LFA高约100倍。结合RPA–CRISPR/Cas12a系统，该AIENPs-LFA平台对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度非常高。

CRediT作者贡献声明

熊远倩：撰写 – 原草稿，数据管理，概念构思。叶沙玲：验证，正式分析，数据管理。郭玉倩：正式分析，概念构思。李莉：数据管理。黄晓琳：方法学研究，调查，概念构思。熊永华：撰写 – 审稿和编辑，监督，项目管理，资金筹措，概念构思。

伦理声明

本研究未涉及人类参与者、动物或感官评估。所有实验均使用商业购买的牛奶样品和实验室细菌菌株进行。因此，无需伦理批准。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了 中国国家重点研发计划（2025YFD2100500）、国家自然科学基金（22574072, 32160599）、江西省重点研发计划（20232BBG70030, 20232BCD44004, 20243BBH81007）、江西省地方科学技术发展指导基金（20252ZDD020002）以及南昌食品科学与技术学院“Food+”跨学科培养项目的支持。