《International Journal of Biological Macromolecules》：From energy sensing to epigenetic activation: The AMPK/TrSnf1-ACE3-MST2 pathway orchestrates cellulase synthesis in Trichoderma reesei
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陈玉萌|高欣|丁杰|邱周远|范行嘉|赵西华|魏东志|王伟中国上海徐汇区梅陇路130号，国家生物反应器工程重点实验室摘要真菌基因表达通常依赖于能量感应激酶Snf1和组蛋白乙酰转移酶，尤其是对于那些高表达或快速调节的基因，如编码纤维素酶的基因。由Trichoderma reesei产
陈玉萌|高欣|丁杰|邱周远|范行嘉|赵西华|魏东志|王伟
中国上海徐汇区梅陇路130号，国家生物反应器工程重点实验室
摘要 真菌基因表达通常依赖于能量感应激酶Snf1和组蛋白乙酰转移酶，尤其是对于那些高表达或快速调节的基因，如编码纤维素酶的基因。由Trichoderma reesei 产生的纤维素酶具有重要的工业意义；然而，大多数关于Snf1功能的研究都集中在酵母上。本研究旨在确定T. reesei 中的Snf1同源物（TrSnf1）对碳源耗尽的快速响应机制以及随后纤维素酶基因转录的激活机制。TrSnf1能够感知葡萄糖的耗尽，从而解除碳代谢产物的抑制（CCR），并最终触发纤维素酶基因的表达。多组学分析确定了组蛋白乙酰转移酶MST2，并强调了其与TrSnf1相互作用在纤维素酶表达中的调控作用。MST2的缺失会损害纤维素酶基因的表达，这表明其与MST2的相互作用对其调控功能至关重要。MST2参与组蛋白H3的乙酰化以及RNA聚合酶与纤维素酶基因启动子的结合。我们认为TrSnf1-MST2-ACE3调控途径协调了纤维素酶的转录激活。本研究填补了T. reesei 中CCR调控网络的一个关键空白，特别是CRE1敲除菌株中观察到的持续CCR现象。我们的研究揭示了一条新的独立于CRE1的CCR信号通路，并为通过基因工程开发高产纤维素酶菌株提供了理论基础。
引言 纤维素酶广泛应用于食品、造纸、纺织和生物燃料行业[1]、[2]。Trichoderma reesei 是一种经典的纤维素分解真菌，也是最重要的工业纤维素酶生产菌[3]。全球约80%的纤维素生物燃料是由T. reesei 生成的纤维素酶制剂生产的，包括Cellic和Accellerase[4]。T. reesei 的纤维素酶表达依赖于两种必需的激活因子ACE3和XYR1，这些因子在碳代谢产物抑制（例如葡萄糖耗尽或纤维素酶诱导底物）的条件下发挥作用[5]。除了直接激活纤维素酶表达外，ACE3还可以通过上调XYR1来间接促进纤维素酶的生产[5]。在葡萄糖充足条件下，碳代谢产物抑制因子CRE1会抑制主要调控因子XYR1和ACE3[6]，这两个因子共同构成了精密调控纤维素酶合成的复杂系统[7]。该系统像一个遗传开关一样，在葡萄糖耗尽时启动纤维素酶转录，在葡萄糖充足时关闭它[8]。这种动态调节使细胞能够通过避免不必要的代谢过程来节省能量。然而，在T. reesei 的CRE1敲除突变体（如Rut-C30[9]）中观察到的持续碳代谢产物抑制（CCR）现象表明存在一条新的独立于CRE1的CCR信号通路。
在真核生物中，AMP激活的蛋白激酶/蔗糖非发酵1（AMPK/Snf1）是一种保守的酶，能够调控代谢、生长和增殖[10]、[11]、[12]。AMPK/Snf1系统维持细胞能量稳态[13]，可以通过调节基因组转录程序、磷酸化以及激活或抑制代谢酶活性来检测碳代谢的变化[14]、[15]。在葡萄糖充足条件下，酵母中的Snf1激酶活性受到抑制，从而抑制与非首选碳源相关的基因表达。相反，在葡萄糖限制（解除抑制的条件下），Snf1被激活以解除CCR，从而促进代谢基因的表达[16]、[17]。酵母中超过400个基因的表达受到Snf1的调控[18]。T. reesei 的基因组编码一种能量感应激酶同源物TrSnf1。鉴于这种真菌中的纤维素酶表达对葡萄糖的可用性非常敏感，我们假设TrSnf1是这一过程的核心调控因子。
Snf1通过直接磷酸化转录因子和调节染色质重塑复合体来调控基因表达[19]、[20]、[21]、[22]。例如，Snf1在CCR通路中通过磷酸化关键抑制因子Mig1[23]和其他转录因子[24]、[25]来发挥其调控作用，从而控制目标基因的表达。Snf1与己糖激酶Hxk2[26]相互作用，并在INO1 启动子上调节组蛋白乙酰化[27]，以及组蛋白乙酰转移酶（HAT）Gcn5的磷酸化水平[14]。在Saccharomyces cerevisiae 中，Snf1还影响HATs的招募[28]。
组蛋白乙酰化是一种表观遗传机制，参与转录激活、基因沉默、DNA复制、应激反应和其他关键生理过程[29]。HATs和去乙酰化酶之间的平衡调节组蛋白乙酰化，从而重塑染色质并改变基因表达[30]、[31]。Xin等人发现，T. reesei 中的HAT TrGcn5对于丝状生长是必需的，并有助于纤维素酶相关基因的表达[32]。Gcn5是一种参与全局代谢调控的保守HAT，如能量代谢和呼吸作用[33]、[34]。因此，TrGcn5对T. reesei 中纤维素酶的影响可能是通过调节生长和呼吸作用间接产生的，而不仅仅是具体的转录调控。考虑到T. reesei 中木质纤维素分解系统的复杂性（包含200个糖苷水解酶基因，其中包括至少16种纤维素酶和11种β-葡萄糖苷酶[35]、[36]），一个基本问题是：是否存在专门用于纤维素酶转录激活的HAT?
大多数关于Snf1功能的研究都集中在酵母模型上，而Snf1在丝状真菌（如T. reeseiT. reesei 中的能量激酶TrSnf1如何感知葡萄糖耗尽并随后激活纤维素酶基因表达仍不清楚。因此，在本研究中，我们使用共免疫沉淀-质谱（Co-IP-MS）技术表征了TrSnf1的功能，并鉴定出了HAT MST2。我们还研究了TrSnf1、MST2和T. reesei 中纤维素酶转录激活因子之间的潜在相互作用，以建立指导针对性改进的理论基础，以提高纤维素酶的生产。我们的主要目标是阐明TrSnf1如何快速响应碳源耗尽并随后激活纤维素酶基因转录的分子机制。本研究的结果有望填补T. reesei 中CCR调控网络的一个关键空白，即CRE1敲除菌株中观察到的持续CCR现象。此外，我们的发现有望为通过基因工程改造T. reesei 以开发高产纤维素酶菌株提供指导，进而提升其作为强大酶生产平台的潜力。
章节摘录 菌株和生长条件 真菌转化按照先前的协议[37]进行。所有细菌培养物均在标准条件下使用Luria–Bertani培养基维持。野生型菌株QM6a被用作起始菌株[38]。本研究中生成的真菌突变体列于表S1中。成熟的分生孢子从马铃薯葡糖琼脂（PDA）平板上收集[38]。
T. reesei 突变体的构建通过靶向删除起始菌株QM6a中的trsnf1 生成了突变体Δsnf1 。
T. reesei 中的Trsnf1对碳源转换的响应在QM6a基因组中搜索
S. cerevisiae AMPK/Snf1激酶的同源物，从而鉴定出了
T. reesei 的TrSnf1。预测的结构特征来自Pfam数据库（
http://pfam.xfam.org/ ）（图1A）。TrSnf1与
S. cerevisiae Snf1之间的氨基酸序列比对显示它们在N末端具有很强的保守性（图S1C），并且在ScSnf[49]中保守的苏氨酸催化位点（Thr210）在TrSnf1中也存在（Thr175）。磷酸化水平是Snf1活性的一个指标
讨论 AMPK/Snf1作为信号网络的中心调控因子，将营养物质的可用性与菌丝生长和代谢过程联系起来[28]。在本研究中，我们证明了T. reesei 的TrSnf1对分生孢子的产生、营养生长和纤维素酶基因转录的激活至关重要。通过对涉及TrSnf1的蛋白质-蛋白质相互作用和磷酸化信号的研究，我们鉴定出了新的HAT MST2。MST2和TrSnf1在调控生长方面具有相似的作用
CRediT作者贡献声明 陈玉萌： 撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究。高欣： 撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究。丁杰： 研究。邱周远： 研究。范行嘉： 研究。赵西华： 研究。魏东志： 概念设计。王伟： 撰写——审稿与编辑、可视化、验证、项目管理、资金获取、数据分析、概念设计。
资助 本研究得到了中国国家重点研发计划 [项目编号：2022YFA0912300]、国家自然科学基金 [项目编号：32370093, 22578121, 32000050]、上海市自然科学基金 [项目编号：23ZR1414800]以及国家生物反应器工程重点实验室的开放资助项目 [项目编号：2022]的支持。
致谢 我们感谢中国农业大学生物科学学院的何群教授提供的ACE3多克隆抗体。
PDA 马铃薯葡糖琼脂
HAT 组蛋白乙酰转移酶
CCR 碳代谢产物抑制
LB Luria–Bertani培养基
MM 最小培养基
MA Mandels–Andreotti培养基
