现实生活中的纳米塑料会导致原代人内皮细胞出现内皮功能障碍

《Archives of Toxicology》：Real-life nanoplastics induce endothelial dysfunction in primary human endothelial cells

　　摘要
了解纳米塑料（NPLs）暴露如何影响血管内皮对于确定其潜在的心血管风险至关重要。为此，使用了四种具有相似标称尺寸（约200纳米）但环境相关性不同的纳米塑料。它们分别是：（i）球形且单分散的原始聚苯乙烯（PS）；（ii）可生物降解的聚乳酸（PLA）；（iii）中等不规则且多分散的聚四氟乙烯（PTFE）；以及（iv）来自消费后瓶子的高度不规则且多分散的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）。为了评估其危害风险，使用了原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为血管内皮的生理相关模型。结果表明，所有纳米塑料都被HUVECs内吞，尽管不同聚合物的摄取效率和细胞内分布存在差异。在25微克/毫升的浓度下，24小时内没有任何纳米塑料引起细胞毒性或DNA损伤。然而，PTFE和PET纳米塑料引起了与内皮功能障碍一致的功能改变。PET纳米塑料触发了IL-6的分泌和细胞内胆固醇的积累，而PTFE和PET纳米塑料显著抑制了细胞迁移，从而减少了伤口闭合。这些发现揭示了生物影响的明显梯度，其中不规则纳米塑料引起了更强的内皮应激反应。通过将形态学现实性与血管炎症、胆固醇失调和迁移障碍联系起来，本研究强调了使用环境现实主义纳米塑料进行人类健康风险评估框架的相关性。

引言
塑料主要是从石油或其他碳氢化合物来源合成的有机聚合物，其中一些可生物降解的变体是由纤维素或玉米淀粉等可再生资源制成的（Nayanathara Thathsarani Pilapitiya和Ratnayake 2024）。由于其耐用性、轻质、成本效益和出色的阻隔性能，塑料在包括食品工业在内的许多领域得到了广泛应用（Ncube等人2021）。在这些应用中，塑料被用于从饮料瓶和包装薄膜到不粘炊具和可生物降解的餐具等各种产品中。在使用过程中，这些材料可以通过多种物理化学过程降解，如机械磨损、热应力或与食物和饮料的长时间接触，从而导致微塑料（<1毫米）和纳米塑料（<1微米）释放到环境中，统称为微塑料和纳米塑料（MNPLs）。

在环境中，MNPLs进入食物链（Hussain等人2023），已有多种聚合物类型的记录，包括来自一次性食品容器和包装的聚苯乙烯（PS）、来自可生物降解包装和茶包的聚乳酸（PLA）（Banaei等人2023）、来自不粘炊具的聚四氟乙烯（PTFE）（Cole等人2024）以及来自水瓶的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）（Hussain等人2023）。一旦进入食物链，MNPLs主要通过摄入进入人体，穿过肠壁，并通过全身循环分布到各种组织（Rajendran和Chandrasekaran 2023）。对于纳米塑料而言，其纳米级大小使其能够更有效地穿过生物屏障，从而促进其生物分布（Jahedi和Jaafarzadeh Haghighi Fard 2025）。不同MNPLs（如PS、PLA、PTFE和PET）穿过生物屏障的能力已在多个实验模型中得到证实，表明它们有可能进入血液（Alaraby等人2024；Landrigan等人2025）。尽管在复杂的生物基质（如血液）中检测MNPLs存在技术挑战，但Leslie等人（2022）成功地在人类血液样本中识别出了基于PS和PET的MNPLs，提供了系统暴露的直接证据。一旦进入血液循环，MNPLs可以与形成血管内壁的内皮细胞（ECs）相互作用。ECs是血管稳态的关键调节者，控制着通透性、炎症信号传导和血管生成，它们的功能障碍与心血管疾病的发展密切相关（Xue等人2023）。多项研究表明，人类体内存在MNPLs与不良心血管结果之间存在关联，这表明MNPL暴露可能与心血管疾病风险有关（Zhang等人2025；Prattichizzo等人2024）。在这种情况下，MNPLs与内皮细胞之间的相互作用可能是导致这些不良心血管效应的关键因素。

在体外研究中，人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）被广泛用作生理相关模型，因为它们是来自脐静脉的原代人类ECs，能够很好地再现血管内皮的结构和功能特性（Cao等人2017）。使用HUVECs的研究表明，PS纳米塑料可以引起一系列不良效应，这些效应通常受颗粒电荷和大小的影响。报告的影响包括细胞活力降低、活性氧（ROS）生成增加、线粒体功能障碍、自噬受损以及炎症途径激活（Fu等人2022；Lu等人2022；Ahamed和Javed Akhtar 2024；Martín-Pérez等人2024）。遗憾的是，大多数关于NPLs对血管影响的研究都集中在商业上可获得的PS纳米塑料上，主要是因为MNPL测试材料的有限可用性（Drzewinska和Belz 2024）。这些原始的PS纳米塑料是球形、单分散且化学均匀的，有利于实验重复性；然而，它们未能反映环境中MNPLs所具有的形态多样性、胶体行为和表面化学特性（Ma等人2024）。因此，如果不使用更接近实际环境中发现的测试材料，建立MNPL暴露、内皮反应和下游心血管效应之间的联系仍然很困难。为了解决这一差距，本研究比较了四种不同NPL测试材料（PS纳米塑料、PLA纳米塑料、PTFE纳米塑料和PET纳米塑料）的生物效应，这些材料的尺寸大致相同（约200纳米），以尽量减少尺寸相关的变异性。因此，PS纳米塑料和PLA纳米塑料呈规则球形；PTFE纳米塑料显示出中等程度的不规则性；而PET纳米塑料则是从消费后的水瓶中制备的，产生的颗粒不规则且多分散，更类似于环境磨损后的塑料（Villacorta等人2022）。通过研究这四种类型的纳米塑料在HUVECs中的内吞动力学和多种生物效应（包括细胞毒性、凋亡、遗传毒性、炎症、细胞内胆固醇积累和细胞迁移），并在标准化暴露条件下进行比较评估，本研究为了解聚合物化学、颗粒形态和胶体行为如何影响内皮细胞反应提供了新的见解，从而有助于更好地理解与NPL暴露相关的心血管风险。

材料与方法
所选纳米塑料的来源和标记
约200纳米的纳米塑料来自不同来源。聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPLs；PP-015-10，标称尺寸0.19微米）作为水悬浮液从Spherotech Inc.（美国伊利诺伊州湖森林）购买。聚乳酸纳米塑料（PLA-NPLs；PRO20-0103-80）由AIMPLAS（西班牙瓦伦西亚）根据先前描述的协议在EU项目PlasticHeal中生产（Alaraby等人2024）。聚四氟乙烯纳米塑料（PTFE-NPLs；430935-5G，标称尺寸1微米）以粉末形式从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买，并分散在Milli-Q水中。聚对苯二甲酸乙二醇酯纳米塑料（PET-NPLs）是在实验室中从商用水瓶中制备的（Villacorta等人2022）。简要来说，商用水瓶中的PET碎片使用金刚石旋转磨头进行机械打磨，以避免金属污染。所得碎片通过筛分（<0.20微米）并在50°C下用三氟乙酸（TFA）中化学分散并持续搅拌。离心后，将颗粒重新悬浮在0.5%十二烷基硫酸钠（SDS）中，并进行超声处理。经过1小时的沉淀以去除较大颗粒后，收集上层液体，用Milli-Q水和乙醇彻底清洗以去除SDS残留物，然后重新悬浮在Milli-Q水中。最后，悬浮液进行超声处理，分装，在液氮中快速冷冻，并储存在-80°C。所有纳米塑料均使用NanoGenotox协议（Jensen等人2009）进行分散。对于内吞实验，使用iDye Poly Pink纺织染料对纳米塑料进行荧光标记（Villacorta等人2024）。标记方法是将1毫升每种纳米塑料悬浮液（5毫克/毫升）与0.01克染料在70°C下孵育2小时。混合物用9毫升Milli-Q水稀释，通过重复离心（Amicon? Ultra-15 Ultracel?-100 K，Merck KGaA，德国达姆施塔特）在3500转/分钟下离心15分钟来去除多余的染料。保留的部分（80–160微升）用Milli-Q水稀释至1毫升，分装，并在4°C下避光保存直至使用。

纳米塑料的表征
对于干态形态，将200微克/毫升的纳米塑料悬浮液滴在涂有碳的铜网上，空气中干燥过夜，然后在JEOL JEM-1400透射电子显微镜（TEM）下观察（操作电压120 kV；JEOL Ltd.，日本东京）。使用Orius SC200D相机（Gatan，Ametek Inc.，美国宾夕法尼亚州贝尔温）获取显微照片，并使用ImageJ v1.8.0_172测量100个单个纳米塑料的Martin直径以确定尺寸分布。对于胶体表征，使用Zetasizer? Ultra（Malvern Panalytical，英国剑桥）测量流体力学尺寸（动态光散射，DLS）和表面电荷（ζ-电位，电泳光散射）。悬浮液（100微克/毫升）分别在Milli-Q水和Endothelial Cell Growth Medium-2（EGM-2；PromoCell，德国海德堡）中制备。所有测量都重复三次。

细胞系和培养条件
使用原代HUVEC（单供体，C-12200；PromoCell，德国海德堡）作为人类血管内皮的模型。细胞在涂有鼠尾胶原蛋白I（5微克/平方厘米；Corning，美国纽约）的培养瓶中，在37°C和5% CO?的湿润环境中维持，培养基每隔一天更换一次。胶原蛋白涂层是通过将胶原蛋白I稀释在20毫摩尔醋酸中孵育1小时，然后用PBS冲洗两次制备的。实验使用的是经过5代传代的细胞。

纳米塑料暴露
除非另有说明，细胞在EGM-2培养基中暴露于25微克/毫升的纳米塑料悬浮液中24小时。在相同条件下培养的未经处理的细胞作为阴性对照。通常，细胞以26,300细胞/平方厘米的密度接种在涂有胶原蛋白I的孔中（5微克/平方厘米），培养48小时，然后更换为处理培养基24小时。

纳米塑料的内吞
使用流式细胞术、共聚焦显微镜和TEM评估HUVECs对不同纳米塑料的内吞情况，提供了互补的定量、定性和超微结构信息。未经处理的细胞作为阴性对照。

流式细胞术
细胞在12.5、25或50微克/毫升的荧光标记纳米塑料中暴露24小时。暴露后，细胞用PBS清洗两次，分离后，在CytoFLEX细胞仪（Beckman Coulter，美国加州帕萨迪纳）上分析，使用561纳米的激发光和585/42纳米的发射光。每种条件收集10,000个事件，并用CytExpert软件进行分析。量化两个参数：（i）内吞阳性的细胞百分比；（ii）每个细胞的平均荧光强度，反映每个浓度下内吞的纳米塑料量。还记录了侧散射（SSC）以评估细胞复杂性的变化。实验重复三次，每个条件都有技术重复样本。

共聚焦显微镜
为了观察细胞内定位，将HUVECs接种在涂有胶原蛋白I的35毫米μ-Dish板上（Ibidi GmbH，德国格拉费尔芬），培养48小时，然后暴露于25微克/毫升的荧光标记纳米塑料24小时。暴露后，细胞用PBS清洗两次，并用含有Hoechst 33,342（1:500；细胞核）和CellMask? Deep Red（1:500；细胞膜）的新鲜培养基孵育。成像使用LSM 980 Airyscan 2和Plan-Apochromat 63×物镜（Carl Zeiss Microscopy GmbH，德国耶拿）进行。激发/发射设置为细胞核348/455纳米，细胞膜659/676纳米，以及iDye Poly Pink标记的纳米塑料577/603纳米。每种条件下拍摄多个随机场。图像处理使用了Fiji/ImageJ软件（Schindelin等人，2012年）。为了进行超微结构确认，将HUVECs细胞接种在涂有I型胶原蛋白的T25培养瓶中，培养48小时后，暴露于25 μg/mL的未标记NPLs中24小时。处理后，用PBS清洗细胞，然后将其从瓶壁上剥离，并在0.1 M cacodylate缓冲液（pH 7.4）中的2.5%戊二醛和2%甲醛溶液中固定。样品用氧化锇进一步固定，在梯度丙酮中脱水，嵌入Eponate 12?树脂（Ted Pella Inc., Redding, CA, USA）中，并在60°C下聚合。使用超薄切片机制作超薄切片，将其安装在铜网上，用醋酸铀和柠檬酸铅进行对比染色，最后通过配备ES1000W Erlangshen CCD相机的JEOL 1400 TEM（JEOL Ltd., Tokyo, Japan）进行观察（Gatan Inc., Pleasanton, CA, USA）。对多个随机区域进行了成像。TEM处理步骤遵循了常规协议（Annangi等人，2015年）。

细胞活力和凋亡
使用Dead Cell Apoptosis Kit以及Annexin V Alexa Fluor 488和Propidium Iodide（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）根据制造商的说明来评估NPLs处理后的细胞活力和凋亡。为了避免丢失脱落的凋亡或死亡细胞，在染色前收集培养上清液，并将其与胰蛋白酶处理的分离液混合。标记后，使用flow cytometry（CytoFLEX, Beckman Coulter, Pasadena, CA, USA）进行分析，激发波长为488 nm，荧光发射波长为525/40 BP和690/50 BP。通过门控技术区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，结果 normalize为100%。作为阳性对照，使用了坎托昔汀（5 μM，24小时）。

DNA损伤诱导
使用彗星实验（comet assay）评估DNA损伤程度，实验中分别加入和不加入formamidopyrimidine DNA glycosylase（FPG）（Collins等人，2023年）。不含FPG的实验量化了DNA单链断裂（基础损伤），而加入FPG的实验则测量了总的DNA损伤，包括单链断裂和氧化的DNA碱基。处理后，用PBS清洗细胞，进行胰蛋白酶处理，离心（300 rcf，8分钟，4°C），然后重新悬浮在1×10^6细胞/mL的冷PBS中。制备1:10的稀释液，置于0.75%低熔点琼脂糖（37°C）中，取7 μL样品置于Gelbond?薄膜（GBF, Lonza Bioscience, Basel, Switzerland）上。在4°C下将细胞裂解2小时（2.5 M NaCl，0.1 M EDTA，0.01 M Tris，0.2 M NaOH，1% Triton X-100，1% N-lauroylsarcosine，10% DMSO；pH 10），然后用酶缓冲液（0.04 M HEPES，0.1 M KCl，0.5 mM EDTA，0.2 mg/mL；pH 8）冲洗两次，最后在同一缓冲液中孵育50分钟。接下来在37°C下进行第二次孵育，加入或不加入激活的FPG，孵育30分钟。在电泳缓冲液（0.3 M NaOH，1 mM EDTA；pH 13.4）中冲洗后，让DNA解旋25分钟，然后进行电泳（20 V，300 mA，20分钟）。Gelbond?薄膜用PBS冲洗，用乙醇固定，并用SYBR Gold（1:2500在TE缓冲液中：10 mM Tris Base，1 mM EDTA；pH 8）染色。使用Olympus BX50显微镜（20×）观察彗星形态，并使用Komet 5.5软件（Kinetic Imaging Ltd, Liverpool, UK）量化彗尾中的DNA百分比。进行了两次独立的生物学实验，每次实验有三个技术重复。甲基甲磺酸盐（MMS，200 μM，40分钟）作为单链断裂的阳性对照，而溴酸钾（KBrO?，5 mM，40分钟）作为FPG修饰实验中总DNA损伤的阳性对照。

IL-6分泌水平
使用商业IL-6 ELISA试剂盒（KHC0061, Invitrogen; Waltham, MA, USA）根据制造商的说明，在暴露于NPLs 24小时后测量培养上清液中的IL-6水平。在450 nm处读取吸光度，并根据四参数逻辑模型生成的标准曲线计算浓度。进行了三次独立的实验，每次实验都有三个技术重复。

细胞内胆固醇水平
将HUVECs细胞接种在μ-Plate 24 Well黑色平板（ibidi, Gr?felfing, Germany）中，在暴露于NPLs 24小时后，通过Filipin III染色评估胆固醇水平。简要来说，采用两步固定方案：首先在37°C下用1:1的EGM-2和4%甲醛（PFA）混合液预固定10分钟，然后在室温下用4% PFA固定10分钟。用PBS清洗后，用1.5 mg/mL的甘氨酸在PBS中淬灭残留的醛基。在含有10% FBS的PBS中配制Filipin III（SAE0087, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany），最终浓度为0.05 mg/mL，在室温下黑暗环境中作用2小时。使用Zeiss LSM 980 Airyscan 2共聚焦显微镜（Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany）和20×物镜（激发波长353 nm，发射波长465 nm）获取图像。对于每个技术重复，量化100个独立细胞的荧光强度，共进行了三次生物学实验，每次实验有两个技术重复。

细胞迁移潜力
使用Culture-Inserts 2 Well（Ibidi GmbH, Gr?felfing, Germany）进行伤口愈合实验来评估细胞迁移潜力。将Inserts放置在涂有胶原蛋白的孔中，每个孔中接种21,000个细胞，并加入含有25 μg/mL NPLs的EGM-2培养基。24小时后（37°C，5% CO?），取出Inserts，清洗孔洞，并加入相同浓度的新鲜培养基。使用Zeiss Axio Observer A1倒置显微镜（10×物镜；Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany）在0小时及以后每2小时拍摄图像，直到8小时。使用ImageJ（v1.8.0_172）中的“Wound Healing Size Tool”插件（Suarez-Arnedo等人，2020）分析伤口闭合情况。计算了两个参数：(i) 表面迁移速度，单位为μm/h，表示为(A0?At)/(2·L·Δt)；(ii) 伤口闭合百分比，表示为(A0?At)/A0×100。其中A0和At分别是0小时和时间t的伤口面积，L是伤口长度，Δ是经过的时间。

统计分析
数据分析使用GraphPad Prism 9软件（GraphPad Software Inc., CA, USA）进行。使用Kolmogorov-Smirnov测试评估数据的正态性。对于正态分布的数据，首先进行单因素方差分析（one-way ANOVA），然后进行Dunnett测试（比较每种NPL与阴性对照，不包括阳性对照），接着进行Tukey测试（NPLs之间的成对比较，不包括阴性对照和阳性对照），最后进行Dunnett测试（比较阳性对照与阴性对照，包括所有组）。对于非参数数据，使用Kruskal-Wallis测试和Dunn的事后检验（post hoc test），依据相同的标准。统计显著性定义为*p ≤ 0.05，**p ≤ 0.01，***p ≤ 0.001。结果表示为平均值±标准误差（mean ± SEM）。

结果与讨论
NPLs的表征
TEM显示所有类型的NPL平均直径约为200 nm（图1A.2–D.2，E）。这表明在后续实验中观察到的生物学效应主要受每种聚合物的固有性质以及形态和胶体行为的差异影响，而不是个别NPLs之间的主要尺寸差异。控制颗粒大小非常重要，因为它是影响NPL与细胞相互作用和生物学反应的关键因素（Lu等人，2022年）。在形态方面（图1A.1–D.1），PS-NPLs和PLA-NPLs表现出均匀的球形，而PTFE-NPLs虽然也是球形但略有不规则。PET-NPLs则显示出最多样化和不规则的形态，这与Villacorta等人（2022年）的观察结果一致。这种从理想化的合成球体到不规则的“实际”碎片的变化提供了一个模型系统，涵盖了从实验室控制的颗粒到更接近环境中的NPLs的颗粒（El Hadri等人，2020年）。尺寸分布也反映了这一趋势，PS-NPLs的尺寸范围最窄（164.9–200.7 nm；标准差7.1 nm），PLA-NPLs和PTFE-NPLs的范围较宽（分别为171.6–353.2 nm和118.3–387.2 nm），而PET-NPLs的分布最广（56.9–587.8 nm；标准差124.2 nm）。

动态光散射（DLS）测量进一步表征了悬浮液中的NPLs（图1E）。在Milli-Q水中的流体动力学直径始终大于TEM测得的直径，这对水合颗粒是预期的（Wilson和Prud’homme，2021年）。所有聚合物在EGM-2介质中的多分散指数（PDI）值均高于在Milli-Q水中的值，这与生物介质中的生物分子吸附（蛋白质冠层形成）和随后的颗粒聚集一致（da Silva等人，2019年；Ferreira等人，2022年）。PS-NPLs和PLA-NPLs的PDI值较低（< 0.3），反映了较高的胶体稳定性，而PTFE-NPLs尤其是PET-NPLs的PDI值显著较高。PET-NPLs的强聚集倾向在其较大的流体动力学直径（在EGM-2中为946.7 nm）和高PDI（0.70）中表现出来，这凸显了其与环境来源NPLs的相似性。在Milli-Q水中的ζ-电位值为负（–18.5至–35.5 mV），表明分散稳定，但在EGM-2中所有NPLs的ζ-电位值趋向于中性（–1.6至–10.7 mV）。PLA-NPLs在EGM-2中的变化最大，接近中性值（–1.55 mV），这与之前关于PLA-NPLs在培养基中电荷中和的报道一致（da Silva等人，2019年）。其他聚合物在EGM-2中的ζ-电位值稳定在–10 mV左右，这与在细胞培养基中分散的NPLs（如PS-NPLs）的报告一致（Martín-Pérez等人，2024年）。这种表面电荷的总体降低可以归因于蛋白质在NPL表面的吸附，这掩盖了原来的电荷，减少了电静力排斥，并促进了细胞培养环境中的聚集（da Silva等人，2019年）；然而，尽管这些依赖于介质的变化与生物介质中的蛋白质冠层形成一致，但本研究并未直接观察或分析细胞内化后的冠层。

总体而言，TEM和DLS分析表明，PS-NPLs和PLA-NPLs表现为相对稳定的、均匀的模型系统，而PTFE-NPLs的稳定性较低，PET-NPLs则表现出强烈的聚集和异质性，使其成为最接近环境来源NPLs的代理。综上所述，这一系列实验提供了一个从理想化的球形参考颗粒（PS）到更不均匀和胶体不稳定的材料（PTFE），再到实际生活中的PLA球形颗粒（由PLA颗粒在体内降解产生），最终到实际生活中的多分散PET片段的环境相关性 Gradation。PET-NPLs的摄取减少可能与它们的胶体不稳定性有关。对EGM-2中PET-NPLs悬浮液的动态光散射分析显示，其多分散性指数最高（0.70），流体动力学尺寸最大（946±217.80纳米），表明这些纳米颗粒发生了广泛聚集。由于网格蛋白和 caveolin 介导的内吞作用通常可以处理最大200纳米的纳米颗粒（Voigt等人，2014年；Sabourian等人，2020年），因此直径接近或超过500纳米的颗粒更依赖于巨胞饮作用或吞噬作用，这两种途径相对较慢且效率较低（Kuhn等人，2014年）。此外，聚合物特有的表面化学性质以及由此产生的蛋白质冠状层可能调节受体相互作用，影响摄取效率（Sousa De等人，2021年；Cao等人，2022年）。平均荧光强度（MFI；相对于对照组的比例，图2B）反映了细胞内的积累情况，支持了这些内吞模式。所有聚合物NPLs都显示出明显的剂量依赖性增加，但PET-NPLs产生的信号始终最低，且与其他聚合物在较高浓度下的差异越大。在12.5微克/毫升的浓度下，PTFE-NPLs的MFI低于PS-NPLs和PLA-NPLs，但在25和50微克/毫升的浓度下则与其相当或更高。摄取百分比与MFI之间的强烈一致性进一步证实了PET-NPLs是最不易被内吞的聚合物，而PS-NPLs、PLA-NPLs和PTFE-NPLs则容易被内吞。基于这些结果，选择25微克/毫升作为后续实验的工作浓度。该浓度能够确保聚合物的稳定摄取，同时不会导致细胞过载，并且仍在环境相关的范围内。

通过共聚焦显微镜观察NPLs的内吞情况，Z堆叠共聚焦成像确认荧光信号来源于细胞质内的NPLs，而不是附着在细胞膜上，这与之前使用该方法的报告一致（Morataya-Reyes等人，2025a，b a）。在25微克/毫升浓度下暴露24小时后，大多数处理组的细胞质中均分布有NPLs相关的荧光（图2B和补充图S3），这与定量流式细胞术数据一致。在PS-NPLs处理的细胞中（图2B.1），荧光在整个细胞质的分布较为均匀，这与流式细胞术检测到的所有NPL阳性HUVECs的比例相符。PLA-NPLs处理的细胞（图2B.2）也显示100%的阳性率，尽管细胞质中的分布不够均匀且数量较少。PTFE-NPLs处理的细胞（图2B.3）与PS-NPLs类似，荧光在所有细胞的细胞质中广泛分布。相比之下，PET-NPLs处理的细胞（图2B.4）显示出有限的摄取，荧光仅局限于大约一半细胞群的离散点状区域，这与流式细胞术测量的约50%的内吞率相符。这些荧光模式表明，NPLs的摄取量和亚细胞分布强烈依赖于聚合物类型，这强调了在评估NPLs与细胞的相互作用及其潜在生物学后果时的重要性。

透射电子显微镜（TEM）的结果证实了共聚焦观察的结果，并提供了含有NPLs的囊泡结构的超微结构信息（图2C和补充图S3）。

**图2**：该图像的替代文本可能是通过人工智能生成的。

**NPLs的内吞作用：**
(A.1–A.2) 在12.5、25和50微克/毫升浓度下暴露24小时后，通过流式细胞术分析NPLs的摄取情况：(A.1) NPL阳性细胞的比例；(A.2) 内吞NPLs的平均荧光强度。(B.1–B.4) 代表25微克/毫升浓度下暴露24小时后NPLs摄取情况的共聚焦图像。NPLs显示为绿色，细胞核显示为蓝色，细胞膜显示为红色。各图分别对应(B.1) PS-NPLs，(B.2) PLA-NPLs，(B.3) PTFE-NPLs，(B.4) PET-NPLs。(C.1–C.4) 浸泡在25微克/毫升NPLs中的HUVECs的代表性TEM图像，暴露时间为24小时。含有NPLs的囊泡用虚线标出。PS (C.1) 形成了许多直径为700–800纳米的囊泡，其中含有大量分布在整个细胞质中的独立NPLs。PLA (C.2) 形成了较少但较大的囊泡，直径约为800纳米，其中含有清晰可见的纳米颗粒（放大图见补充图2 A.1–A.2），偶尔还有直径达2微米的较大囊泡，含有颗粒状内容物（见补充图2 A.3）。PTFE-NPLs (C.3) 在许多直径为700–800纳米的囊泡中积累，每个囊泡都含有清晰可辨的独立纳米颗粒。PET-NPLs (C.4) 诱发了少量但非常大的囊泡，直径可达4微米，内部内容物分布均匀且无明显的NPLs结构。共聚焦和TEM的阴性对照见补充图3。

在PS-NPLs处理的细胞中（图2C.1），许多直径700–800纳米的囊泡中分布着大量独立的电子密集型纳米颗粒，这与之前在RBL-2H3细胞和HUVECs中报道的通过网格蛋白或caveolin介导的内吞作用一致（Liu等人，2021年；Lu等人，2022a）。这些囊泡中存在NPLs的情况与通过网格蛋白或caveolin的受体介导的内吞作用一致（Liu等人，2021年）。高囊泡数量与流式细胞术侧散射（SSC）检测到的复杂性增加相吻合（补充图S1）。与PS-NPLs处理相比（图2C.2），PLA-NPLs处理产生的囊泡数量较少，但偶尔会出现较大的囊泡（直径达2微米），含有颗粒状内容物，这表明有部分涉及巨胞饮作用或类似吞噬作用的内吞过程。它们较低的ζ电位（-1.55 mV，而其他聚合物为-10 mV）支持了形成的独特蛋白质冠状层可能改变受体相互作用并促进替代进入途径（Cao等人，2017年；Sousa De等人，2021年）。PTFE-NPLs（图2C.3）显示出与PS-NPLs相似的模式，含有清晰可见的纳米颗粒的700–800纳米囊泡，但其数量少于PS-NPLs处理的细胞。这种形态与高效的网格蛋白或caveolin介导的内吞作用相兼容，但表明与PS相比囊泡形成的程度略有降低。相比之下，PET-NPLs存在于更大但数量较少的囊泡中（直径达4微米），这与通过巨胞饮作用或类似吞噬作用在非专业吞噬细胞（如HUVECs）中形成的巨胞囊或吞噬体结构一致。这与在EGM-2中通过动态光散射（DLS）测量的PET-NPLs的流体动力学尺寸（约900纳米）相符，该尺寸表明了广泛的聚集，并支持通过这些途径的摄取。由于巨胞饮作用和吞噬作用最终都会进入溶酶体途径，这里观察到的囊泡可能代表吞噬溶酶体。这种机制与Liu等人（2021年）描述的500纳米PS-NPLs的巨胞饮作用介导的内吞作用以及文献中报道的吞噬作用的典型尺寸范围一致（Sousa De等人，2021年）。尽管内吞途径占主导，但不能排除任何测试材料通过被动方式穿越细胞膜的传输，因为疏水性和范德华力可能允许小NPLs的有限扩散（Liu等人，2021年）。然而，聚合物的低电子密度限制了通过TEM直接观察细胞质中单个NPLs的能力（Sawyer等人，2008年）。总体而言，TEM证实聚合物化学性质和胶体行为决定了NPLs在HUVECs中的内吞效率和途径。

**细胞毒性和遗传毒性：**
**细胞毒性和凋亡：**
Annexin V/PI试验表明，在25微克/毫升浓度下暴露24小时后，没有任何NPLs处理组影响HUVEC的存活率（图3A）。在所有NPL处理组中，超过80%的细胞保持存活，坏死细胞的比例始终低于15%，凋亡细胞的比例低于5%，这些值与阴性对照组相当。这些结果表明，在测试条件下，不同类型的NPLs不会在原代内皮细胞中引发急性细胞毒性或凋亡。相比之下，凋亡诱导剂喜树碱（5微摩尔，24小时）导致细胞存活率显著下降（<25%），同时坏死细胞和凋亡细胞的比例显著增加（>58%），从而验证了该试验的敏感性（Morris和Geller，1996年）。这些结果与之前的研究一致，这些研究表明在环境相关浓度下，PS-NPLs、PLA-NPLs、PTFE-NPLs和PET-NPLs不会引起急性细胞毒性（Annangi等人，2023年；Banaei等人，2023年；Martín-Pérez等人，2024年；Abass等人，2025年）。

在选定的25微克/毫升浓度下暴露24小时后没有表现出细胞毒性，这验证了这种暴露条件适合作为研究更微妙的环境相关终点的实验窗口，包括遗传毒性、炎症信号传导、代谢紊乱和内皮功能变化，而不会受到细胞死亡的混淆影响。

**遗传毒性：**
尽管在包括HUVECs在内的多种人类细胞模型中已报告了PS-NPLs的遗传毒性（Rubio等人，2020年；Martín-Pérez等人，2024年；Martín-Pérez等人，2024年），但系统性的其他类型NPLs的遗传毒性评估仍然不足。到目前为止，还没有研究检查PLA-NPLs、PTFE-NPLs或PET-NPLs在内皮细胞中的遗传毒性潜力，其他人类细胞系统中的证据也有限。为了填补这一空白，采用了彗星实验来评估所测试的NPLs是否会引起DNA链断裂或氧化DNA损伤。该实验已被广泛验证为评估NPLs遗传毒性的可靠方法（García-Rodríguez等人，2019年）。

在我们的研究中，无论是使用标准碱性版本还是修改了的FPG版本来检测氧化碱基的彗星实验，都显示在25微克/毫升不同NPLs处理24小时的HUVECs中DNA损伤水平没有增加（图3B和补充图S4）。在所有聚合物处理组中，DNA尾部的比例约为6–8%，与阴性对照组相当，没有观察到显著差异。相比之下，阳性对照组FPG实验中的溴酸钾（KBrO?）和碱性实验中的甲磺酸甲酯（MMS）产生了预期的显著增加，证实了该实验的敏感性。因此，在测试条件下，200纳米的NPLs没有在原代内皮细胞中引起可检测的单链断裂或氧化DNA损伤。这些结果扩展了关于NPLs在内皮细胞中引起遗传毒性的有限证据，并表明在这些环境相关条件下，这些NPLs本身不会破坏DNA完整性。然而，解读必须谨慎，因为对NPLs的遗传毒性反应似乎高度依赖于实验背景。例如，在HUVECs中已检测到较小PS NPLs的链断裂（Martín-Pérez等人，2024年）。PLA-NPLs仅在较高剂量和更长时间的暴露下才观察到遗传毒性（García-Rodríguez等人，2024年；Morataya-Reyes等人，2025b），而PTFE-NPLs的影响在Caco-2和HT29-MTX细胞中从50微克/毫升开始观察到（Abass等人，2025年）。对于PET-NPLs，研究结果存在矛盾，THP-1细胞在50微克/毫升浓度下3小时内没有观察到效果（Villacorta等人，2022年），但在A549细胞中从2微克/毫升开始就观察到了明显的剂量依赖性损伤（Alzaben等人，2023年）。综上所述，聚合物化学性质、颗粒大小、暴露剂量和细胞类型共同决定了NPLs的遗传毒性潜力，因此在一种情况下没有损伤并不适用于所有系统。

**炎症反应 – IL-6 ELISA：**
关于HUVECs中的炎症反应，在NPLs（25微克/毫升）暴露24小时后，通过细胞培养上清液量化了IL-6的分泌情况。暴露于PET-NPLs导致IL-6分泌显著增加，相比对照组增加了1.93倍（p≤0.001）。这一效应也显著高于所有其他类型的聚合物（p≤0.01）。相比之下，PS-NPLs、PLA-NPLs和PTFE-NPLs并未引起IL-6水平的显著变化，表明这种促炎反应是PET-NPLs在测试条件下的特有现象。

在PS-NPLs、PLA-NPLs和PTFE-NPLs暴露后未观察到IL-6的诱导，这与之前的多项研究一致。对于PS-NPLs，Weber等人（2022年）在单核细胞和树突状细胞中使用50–310纳米的单分散球形颗粒时未观察到IL-6的增加，而Arribas Arranz等人（2024年）在全血中100微克/毫升浓度的暴露下也未观察到IL-6反应。对于PLA-NPLs，我们的结果与da Silva等人（2019年）的研究一致，他们在广泛的剂量范围（0.5–100微克/毫升）内暴露于PLA-NPLs的巨噬细胞中没有观察到促炎激活。对于PTFE-NPLs，Abass等人（2025年）在肠道屏障模型中报告称，在24小时暴露后没有观察到IL-8的分泌，进一步支持了PTFE-NPLs不通过主要细胞因子和趋化因子介导途径引发急性促炎反应的观点。这些发现共同表明，像PS-NPLs、PLA-NPLs和PTFE-NPLs这样的球形、单分散聚合物在急性暴露条件下通常表现出有限的促炎活性。实际生活中的PET-NPLs引发的IL-6分泌增加与Weber等人（2022年）的研究结果一致，他们报告称实际存在的、不规则且多分散的NPLs（包括PS-NPLs和PVC-NPLs）能够诱导单核细胞和树突状细胞中的IL-6表达，而单分散的球形NPLs则没有这种效应。这些结果表明，除了聚合物种类本身，颗粒形态和胶体行为可能在调节NPLs的炎症潜力方面起着重要作用。PET-NPLs在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中诱导IL-6的机制具有生物学意义，因为IL-6是血管炎症和内皮功能障碍的中心介质（Kang等人，2020年）。在内皮细胞中，IL-6信号传导会促进炎症细胞的黏附（Suzuki等人，2010年），破坏内皮屏障的完整性从而增加通透性并促进血管渗漏（Kang等人，2020年），并诱导促血栓形成的表型（Cimmino等人，2022年），这些共同作用导致内皮功能障碍和动脉粥样硬化的发生（Zegeye等人，2023年）（图4）。图4。

**图4的替代文本可能是使用AI生成的。**

**HUVECs暴露于NPLs后的IL-6分泌情况。** 在NPLs（25 μg/mL）暴露24小时后，通过ELISA方法定量培养上清液中的IL-6水平。条形图表示相对于阴性对照（CTL，设为1）的倍数变化。数据显示为来自≥3个独立实验的平均值±SEM。统计分析使用单因素ANOVA进行，随后进行Dunnett检验（与对照组的比较）和Tukey检验（NPLs之间的 pairwise 比较）。***p ≤ 0.001 对照组；##p ≤ 0.01 PET与其他NPLs的比较。**

**胆固醇检测**
应用Filipin III染色来可视化HUVECs细胞质中的未酯化胆固醇。荧光显微镜图像（图5B.1–B.5）显示了不同处理组之间的显著差异，其中PET-NPLs处理的细胞（图5B.5）显示出比对照组和其他聚合物（图5B.1–B.4）更强的荧光。对大约600个单个细胞的Filipin III强度进行量化证实了这些观察结果（图5A）。在25 μg/mL浓度下暴露24小时后，只有PET-NPLs显著增加了细胞内的胆固醇，达到阴性对照的1.22倍（p ≤ 0.01）。PTFE-NPLs显示出轻微但无统计学意义的1.09倍增加，而PS-NPLs和PLA-NPLs与对照组相当。 pairwise 比较显示PET-NPLs仅与PLA-NPLs有显著差异（p ≤ 0.05）。

**PET-NPLs的暴露还改变了胆固醇的空间分布。** 虽然对照组、PS-NPLs、PLA-NPLs和PTFE-NPLs主要显示与内质网合成一致的核周荧光（Lyu等人，2017年），但PET-NPLs导致细胞质信号更加分散，并伴有与囊泡积累相符的点状结构。之前的研究已经报道，在更高浓度（100 μg/mL）下暴露于较小尺寸（最多100 nm）的PS-NPLs的HUVECs中细胞内胆固醇增加（Martín-Pérez等人，2025年）。然而，在本研究中PS-NPLs没有引起显著变化，这可能反映了较低的暴露浓度（25 μg/mL）或较大的颗粒尺寸（200 nm），因为较大的尺寸通常与较低的细胞反应性相关（P?uciennik等人，2024年）。

据我们所知，除了PS-NPLs之外，NPLs对胆固醇代谢的影响尚未被研究。因此，本研究首次评估了PLA-NPLs、PTFE-NPLs和PET-NPLs对内皮细胞内胆固醇的影响。只有实际存在的PET-NPLs引起了显著的积累，这可能是由于其物理化学性质有利于形成最大达4 μm的异常大的囊泡。它们在细胞质中的持久存在可能会干扰负责胆固醇输出和重新分布的囊泡转运途径，这一过程之前已被认为与细胞内胆固醇水平升高有关（Litvinov等人，2018年；Martello等人，2020年）。有趣的是，在PET处理的细胞中观察到的胆固醇增加也与上述的促炎反应一致，因为胆固醇生物合成的中间产物可以促进IL-6的诱导（Omoigui，2007年）。胆固醇积累与内皮功能障碍相关（Ziegler等人，2024年），而胆固醇转运的改变会影响膜流动性和细胞迁移能力（Lyu等人，2017年）。在这种背景下，我们将迁移评估为内皮功能的一个关键组成部分。

**图5的替代文本可能是使用AI生成的。**

**NPLs暴露后HUVECs中的胆固醇水平。** 在NPLs（25 μg/mL）暴露24小时后，通过Filipin III染色定量胆固醇水平。条形图表示相对于阴性对照（CTL，设为1）的倍数变化。数据显示为来自≥3个独立实验的平均值±SEM。统计分析使用单因素ANOVA进行，随后进行Dunnett检验（与对照组的比较）和Tukey检验（NPLs之间的 pairwise 比较）。**p ≤ 0.01 对照组；#p ≤ 0.05 PET-NPLs与PLA-NPLs的比较。** （B） 暴露于B.1 CTL、B.2 PS-NPLs、B.3 PLA-NPLs、B.4 PTFE-NPLs和B.5 PET-NPLs的HUVECs中Filipin III染色的代表性共聚焦图像（青色）。图像使用20倍物镜获取。

**迁移测定**
伤口愈合测定揭示了聚合物对内皮迁移的特定效应（图6）。闭合速度测量（图6A）显示PS-NPLs和PLA-NPLs在任何时间点都没有显著改变HUVEC的迁移，而PTFE-NPLs和PET-NPLs显著抑制了闭合动力学。PET-NPLs始终表现出最强的抑制作用，在8小时时迁移速度相比对照组减少了约25%。从2小时开始这种减少就变得显著，并在整个测定过程中持续存在。PTFE-NPLs产生的效应较为温和，8小时时闭合速度减少了约15%，尽管从2小时时间点开始这种减少就已经很显著。 pairwise 分析确认PET-NPLs从4小时开始与PS-NPLs和PLA-NPLs有显著差异，而在6–8小时时也与PTFE-NPLs有显著差异。此外，从4小时开始PET-NPLs与PS-NPLs和PLA-NPLs也有显著差异，除了与PLA-NPLs在8小时的比较中未检测到显著差异（补充表S1）。8小时时的代表性相位对比图像显示，与对照组、PS-NPLs和PLA-NPLs的有效闭合相比，PET-NPLs和PTFE-NPLs处理的细胞的伤口闭合受损（图6B）。这些发现得到了伤口闭合百分比这一补充指标的证实（补充图S5）。两个读数之间的一致性强调了观察到的损伤的稳健性。我们关于PTFE-NPLs和PET-NPLs的结果与大多数现有研究一致，这些研究表明MNPL暴露在各种条件下会降低细胞迁移。体外研究一致报告称，在暴露于30至500 nm的PS-NPLs后，HUVECs和人滋养层的迁移都减少了（Lee等人，2021年；Hu等人，2022年；Lv等人，2024年；Wan等人，2024年）。在体内也观察到了类似的效果，淡水水蛭Hirudo verbana暴露于聚丙烯MNPLs（100 nm–5 μm）会延迟伤口修复（Bon等人，2025年）。

PTFE-NPLs和PET-NPLs对迁移的抑制作用可能与细胞内胆固醇水平的改变有关，因为HUVECs中胆固醇升高已被证明与迁移能力下降相关（Lyu等人，2017年）。这种解释与我们的观察结果一致，因为PET-NPLs不仅诱导了最高的细胞内胆固醇积累，还导致了最显著的迁移减少。内皮迁移对于血管修复、血管生成和屏障完整性至关重要。如PET-NPLs此处所观察到的，这种过程的损伤会损害血管生成并延迟血管修复，从而加剧如动脉粥样硬化等病理状况（Zhang等人，2020年）。综合来看，我们的发现表明迁移是内皮细胞中NPL毒性的一个敏感且功能相关的终点，实际存在的聚合物表现出最强的抑制效应。

**图6的替代文本可能是使用AI生成的。**

**NPLs对HUVEC迁移的影响。** 在伤口愈合测定期间，HUVECs暴露于NPLs（25 μg/mL）24小时后的闭合速度，表示为相对于阴性对照（CTL，设为1）的倍数变化。数据对应于划痕后2、4、6和8小时的时间点。条形图表示来自≥4个独立实验的平均值±SEM。统计分析使用单因素ANOVA进行，随后进行Dunnett检验（与对照组的比较）和Tukey检验（NPLs之间的比较）。*p ≤ 0.05，**p ≤ 0.01，***p ≤ 0.001。每个时间点的 pairwise 比较的完整结果见补充表1。**B** 划痕后8小时伤口区域的代表性相位对比图像：B.1 CTL，B.2 PS-NPLs，B.3 PLA-NPLs，B.4 PTFE-NPLs，B.5 PET-NPLs。彩色线条标记用于量化的伤口边缘。

**结论**
本研究系统地比较了环境相关性逐渐增加的NPLs，从模型球形PS到来自消费后塑料瓶的不规则、多分散PET，以及它们对原代人内皮细胞的影响。通过标准化颗粒大小和暴露条件，我们能够评估颗粒形态、尺寸异质性和胶体行为等环境因素如何影响内皮细胞的反应。所有NPLs都被HUVECs有效内吞，尽管它们的细胞内分布有所不同，这表明根据其物理化学特性涉及不同的摄取途径。在25 μg/mL暴露24小时后，没有任何NPLs引起细胞毒性或基因毒性。然而，功能测定揭示了与NPL特性相关的明显差异。球形和单分散的PS-NPLs和PLA-NPLs仅引起微不足道的改变，而不规则、异质性和多分散的PTFE-NPLs和PET-NPLs引发了与内皮应激相关的功能变化。具体来说，PET-NPLs促进了IL-6的分泌和细胞内胆固醇的积累，而PTFE-NPLs和PET-NPLs显著降低了细胞迁移，损害了内皮单层的伤口愈合能力。观察到的生物反应梯度支持了颗粒形状、异质性和胶体行为是NPL生物活性的关键决定因素的观点。总的来说，我们的发现建立了实际存在的NPLs与通过炎症、胆固醇失调和迁移抑制导致的早期血管损伤之间的潜在联系。这些发现还强调了仅依赖理想化的单分散NPLs进行风险评估的局限性。将环境真实的NPLs纳入毒理学测试对于预测真实的人类健康风险以及设计能够捕捉塑料污染真实复杂性的监管框架至关重要。为了扩展这项工作，未来的研究应包括具有更广泛形状的NPLs（如纤维或碎片），并采用更先进的实验系统，特别是内皮屏障和微流控组织工程血管模型，以更好地再现生理条件。除了这些受控制的体外设置外，要解决超出短期静态HUVEC培养范围的更复杂的动脉粥样硬化相关结果（例如斑块形成和狭窄相关过程），最终需要进行体内研究和人类生物监测方法，以捕捉系统性的、长期的和流动依赖的机制。这样的方法可能会完善我们对NPL引起的血管功能障碍及其潜在心血管影响的理解。