使用培养的人类肝细胞作为测试系统，来评估细胞增殖这一非遗传毒性致癌作用中的关键事件

《Archives of Toxicology》：The use of cultured human hepatocytes as a test system to evaluate cell proliferation as a key event in nongenotoxic carcinogenesis

　　**摘要**
本研究旨在评估复制DNA合成（RDS）在培养的人类肝细胞中的适用性，作为体外模型来评估非遗传毒性化学物质的致癌性以及物种间的差异。实验使用了39份来自主要为白种人男性及女性的供体的冷冻保存的人类肝细胞样本，这些供体的年龄范围从10个月到80岁不等，研究由两个独立的实验室完成，这两个实验室采用了不同的培养条件和方法来评估这些化学物质对肝细胞RDS的影响。对于所有年龄段的男性及女性肝细胞样本，使用表皮生长因子（EGF）和/或肝细胞生长因子（HGF）处理后均观察到RDS的增强。相比之下，使用组成型雄烷受体（CAR）激活剂苯巴比妥（phenobarbital）和CITCO，以及过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）激活剂WY-14,643处理肝细胞并未导致RDS的增加。这些发现与先前的研究结果一致，即与EGF和HGF不同，非遗传毒性的CAR和PPARα激活剂在啮齿动物肝细胞中具有促有丝分裂作用，但在人类肝细胞中则没有这种效应。尽管在不同供体之间存在一定差异，但EGF和/或HGF对人类肝细胞RDS的诱导作用并不受性别、年龄或种族的影响。这些研究表明，培养的冷冻保存人类肝细胞是一种成熟、可重复且相关的体外检测系统，可用于研究化学物质的非遗传毒性致癌潜力及物种差异，值得根据经合组织（OECD）的原则进行正式验证。

**引言**
多年来，化学物质的致癌风险是通过在实验动物中的长期研究来评估的。目前针对植物保护产品的法规要求在两种物种（通常是大鼠和小鼠）中评估其致癌性，以获取用于人类健康决策的数据（欧盟委员会，2009年）。然而，啮齿动物癌症生物测定对人类的预测性并不总是可靠的，许多研究已经讨论了其潜在的实用性和局限性（Ames等人，1990, 2017, 2024；Berry，2018；Cohen等人，2004, 2010；Cohen等人，2019；Doe等人，2019, 2022；Goodman，2018；Heusinkveld等人，2020；Hilton等人，2023；Luijten等人，2020；Osimitz等人，2013；Smith和Perfetti，2018；Terry等人，2021）。长期以来，人们对慢性啮齿动物生物测定数据对人类的相关性提出了质疑，这既涉及到癌症效应的物种外推，也涉及到剂量外推。长期啮齿动物生物测定通常在最大耐受剂量（MTD）水平上进行，该剂量可能远高于人类的潜在暴露剂量，从而导致非特异性的促有丝分裂作用。虽然某些化学物质在不同供体间存在差异，但EGF和/或HGF对人类肝细胞RDS的诱导作用并不受性别、年龄或种族的影响。这些研究表明，培养的冷冻保存人类肝细胞是一种成熟、可重复且相关的体外检测系统，可用于研究化学物质的非遗传毒性致癌潜力及物种差异，值得根据经合组织（OECD）的原则进行正式验证。

**方法**
实验使用了39份来自主要为白种人男性及女性的供体的冷冻保存的人类肝细胞样本，这些供体的年龄范围从10个月到80岁不等，研究由两个独立的实验室完成，这两个实验室采用了不同的培养条件和方法来评估这些化学物质对肝细胞RDS的影响。对于所有年龄段的男性及女性肝细胞样本，使用表皮生长因子（EGF）和/或肝细胞生长因子（HGF）处理后均观察到RDS的增强。相比之下，使用组成型雄烷受体（CAR）激活剂苯巴比妥（phenobarbital）和CITCO，以及过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）激活剂WY-14,643处理肝细胞并未导致RDS的增加。与先前的研究结果一致，与非遗传毒性的CAR和PPARα激活剂不同，EGF和HGF在人类肝细胞中具有促有丝分裂作用。尽管在不同供体间存在一定差异，但EGF和/或HGF对人类肝细胞RDS的诱导作用并不受性别、年龄或种族的影响。这些研究表明，培养的冷冻保存人类肝细胞是一种成熟、可重复且相关的体外检测系统，可用于研究化学物质的非遗传毒性致癌潜力及物种差异，值得根据经合组织（OECD）的原则进行正式验证。非受体介导的作用机制（例如通过细胞毒性触发修复和增殖）以及与CAR和PPARα不同的受体介导效应未在本文中进行评估，也不属于本文的研究范围。

## 材料与方法

### 材料
如下所述，数据收集自两个实验室进行的研究。这些研究中使用了商业来源的冻存人类肝细胞制剂、组织培养试剂及其他试剂，包括二甲基亚砜（DMSO）、BrdU、PB及其钠盐、CITCO、WY-14,643、EGF和HGF。

### 数据收集
数据来源于CropLife Europe（CLE）公司，这些公司在2011年至2020年间为活性物质的注册开展了人类肝细胞研究。共从以下CLE公司中识别出36项此类研究：ADAMA、BASF、Bayer、Gowan、Janssen PMP、Sumitomo Chemical Co Ltd和Syngenta。所有研究中使用的肝细胞制剂详情、检测的化合物浓度范围及其他实验细节均被整理、制表并进行了分析。数据可视化使用的是Spotfire（瑞典哥德堡）版本14.0.5软件。

## 人类肝细胞
### 表1 39种冻存人类肝细胞制剂的供体信息和来源

### 人类肝细胞的培养与处理
本文描述的所有研究均在Concept Life Sciences（前身为CXR Biosciences Ltd；英国邓迪市James Lindsay Place 2号，邮编DD1 5JJ）或Environmental Health Science Laboratory（日本大阪市Konohana-ku，邮编554–8558）进行，分别称为实验室1和实验室2。在典型的实验中，人类肝细胞被不同浓度的测试化合物处理（包括那些具有某些细胞毒性的化合物），并测定其对肝细胞再生和DNA合成（RDS）的影响。所有研究均设置了适当的阴性对照（例如仅含有DMSO的培养基）和阳性对照（例如含有EGF和/或HGF的培养基）。在一些研究中，还进行了额外的检测以确定测试化合物对CYP酶活性和/或mRNA水平的影响。虽然36个单独的人类肝细胞实验的设计存在一些差异（使用了总共39种不同的肝细胞制剂，详见表1），但实验室1（Goettel等人，2024年；Haines等人，2018年；Lake等人，2020年；Wiemann等人，2019年）和实验室2（Kondo等人，2020年；Okuda等人，2017年；Yamada等人，2015年）使用的一些通用条件在下面简要说明。对于实验室1，冻存的人类肝细胞在肝细胞解冻培养基（Life Technologies，英国柴郡Warrington）中解冻，并通过台盼蓝排除法测定其活力。对于RDS研究，人类肝细胞在胶原包被的6孔板中，使用冻存肝细胞恢复培养基（Life Technologies）在湿度为95%的培养箱中于37°C下培养6小时。附着期结束后，将培养基更换为含50 μg/ml L-抗坏血酸的Leibovitz L15培养基（Plant等人，1998年），并在同样湿度条件下继续培养。如有需要，测试化合物以0.1%（v/v）的最终浓度添加到培养基中，DMSO被添加到所有培养基中，包括对照孵育、含有PB、其他测试化合物和EGF的孵育。由于化合物溶解性的问题，实验室1的一些实验使用了0.5%（v/v）浓度的DMSO。随后每隔24小时将培养基更换为含有测试化合物的新鲜培养基，总处理时间为96小时。为了研究肝细胞RDS，在处理的最后72小时向培养基中添加了10 μM BrdU。作为RDS研究的阳性对照，人类肝细胞在处理的最后72小时也接受了EGF处理（正常浓度为25 ng/ml）。处理期结束时，人类肝细胞单层细胞用甲醇固定。

对于实验室2，冻存的人类肝细胞根据供应商的说明解冻，并悬浮在含有2 mM L-谷氨酰胺、0.1 μM牛胰岛素、1 μM地塞米松、10 mM烟酰胺、0.2 mM L-抗坏血酸、0.5 ng/ml EGF和10%（v/v）胎牛血清的Williams’培养基E中。活力通过台盼蓝排除法测定。人类肝细胞以每孔3.5 × 10^4个活细胞的密度接种在胶原包被的96孔板中，在湿度为95%的培养箱中于37°C下培养18或24小时。然后通过将培养基更换为不含血清的Williams’培养基E（含有上述添加物）开始处理。如有需要，测试化合物以0.1%（v/v）的最终浓度添加到培养基中，DMSO被添加到所有培养基中，包括对照孵育、含有PB、其他测试化合物和EGF的孵育。随后每隔24小时将培养基更换为含有测试化合物的新鲜培养基，总处理时间为48小时。为了研究肝细胞RDS，在处理的最后24小时向培养基中添加了10 μM BrdU。作为RDS研究的阳性对照，人类肝细胞在处理的最后48小时也接受了EGF处理（浓度范围为0.5–100 ng/ml）和/或HGF（浓度范围为1–100 ng/ml）。处理期结束后，从人类肝细胞单层细胞中移除培养基，然后按下文所述进行干燥处理。

### 人类肝细胞RDS的测定
对于实验室1，用甲醇固定的人类肝细胞单层细胞进行BrdU免疫细胞化学检测，每种处理（对照、每种测试化合物浓度和EGF）检测5个重复孔。肝细胞RDS通过标记指数（即发生RDS的肝细胞核的百分比）来测定。对于实验室2，使用Cell Proliferation ELISA BrdU（化学发光）试剂盒（Roche，德国曼海姆）测定测试化合物对人类肝细胞RDS的影响。空气干燥后的肝细胞单层细胞按试剂盒制造商的说明进行固定和处理，每种处理检测4、8或12个重复孔（即对照、每种测试化合物浓度、EGF和HGF）。样品的发光强度用发光计测量，肝细胞RDS计算为处理样本的发光强度与未处理对照的百分比。为了考虑实验室1和实验室2使用的不同方法，在整体数据集中，人类肝细胞RDS值表示为与同时期对照值的倍数变化。

### 额外检测
对于实验室1，使用CellTitre-Glo发光检测盒（Promega，英国南安普顿）通过测量ATP水平来确定测试化合物对培养的人类肝细胞的潜在细胞毒性。在实验室2进行的研究中，使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑ium溴化物（MTT）检测试剂或（2-[2-甲氧基-4-硝基苯]-3-[4-硝基苯]-5-[2,4-二硫苯]-2H-四唑ium单钠盐（WST-8）检测试剂（Dojindo Laboratories，日本熊本）来确定测试化合物对培养的人类肝细胞的潜在细胞毒性。在实验室1进行的一些研究中，还测定了对某些CYP酶（包括7-戊氧基雷索芦芬O-脱戊基酶（PROD）、7-苄氧基雷索芦芬O-脱苄基酶（BROD）和7-苄氧基喹诺酮O-脱苄基酶（BQ）活性的影响，以及CYP2B6和CYP3A4 mRNA水平的影响。实验室2进行的额外研究还包括对CYP2B6和CYP4A11 mRNA水平的影响。

## 人类供体人口统计信息
表1显示了实验室1和/或实验室2在CLE公司研究中使用的39种冻存人类肝细胞制剂的供体详细信息。在所检测的39种肝细胞制剂中，17种来自男性供体，22种来自女性供体。大多数供体为高加索人种（36/39），另有2名西班牙裔供体和1名非裔美国供体。所有供体的年龄范围为：男性供体11–73岁，女性供体10个月–80岁。男性高加索供体的年龄范围为11–73岁，女性高加索供体为11–80岁；两名西班牙裔女性供体的年龄分别为10个月和56岁，1名非裔美国供体的年龄为59岁。所有供体中，0–20岁、21–30岁、31–40岁、41–50岁、51–60岁、61–70岁和>70岁的供体数量分别为4人、4人、6人、5人、12人、6人和2人，约74%的供体年龄在31–70岁之间（表1）。

## EGF和HGF对培养的人类肝细胞RDS的影响
图2显示了在36项CLE研究中使用的39种人类肝细胞制剂在采用EGF（浓度范围0.5–100 ng/ml）和/或HGF（浓度范围1–100 ng/ml）作为阳性对照诱导肝细胞RDS时的反应数据。如有需要，测试化合物溶解在DMSO中（最终浓度0.1或0.5% v/v），并添加到所有培养基中，包括使用对照培养基及EGF或HGF处理的肝细胞。与其他研究（图3–7）一样，使用0.1%或0.5%（v/v） DMSO处理的对照组中，人类肝细胞标记指数值非常相似。由于个别研究的差异，EGF和/或HGF的浓度在各个实验中有所不同，因此每种浓度的EGF和HGF以及CAR和PPARα激活剂的数据点数量也存在一些变化（图2–7）。如图2所示，使用1–25 ng/ml EGF和1–100 ng/ml HGF处理时，肝细胞RDS呈浓度依赖性增加。使用25 ng/ml EGF和100 ng/ml HGF时，肝细胞RDS的最大中位数增加分别为9.4倍（范围3.5–28.2倍）和3.3倍（范围1.3–10.2倍）。在各个CLE肝细胞研究中，通常在≥10 ng/ml的EGF或HGF处理后观察到肝细胞RDS的显著增加。

图2展示了使用含有0.1或0.5% DMSO的对照培养基、0.5–100 ng/ml EGF和1–100 ng/ml HGF处理对39名供体的培养的雄性和女性人类肝细胞中的复制DNA合成（RDS）的影响。结果以箱线图形式表示，肝细胞RDS的中位数倍数变化在对数尺度上与同时期对照值进行比较。横线将矩形一分为二，矩形代表上下四分位数。须状部分表示最远的数据点在箱线范围（IQR）的1.5倍范围内，上须代表上四分位数范围＋1.5倍IQR，下须代表下四分位数范围－1.5倍IQR。被标记为异常值的个别人类肝细胞实验用点表示。

图3展示了使用含有0.1或0.5% DMSO的对照培养基、0.5–100 ng/ml EGF和1–100 ng/ml HGF处理对39名年龄在10个月至80岁之间的男性（红色符号）和女性（蓝色符号）人类肝细胞中的复制DNA合成（RDS）的影响。结果以每种处理的平均值表示，肝细胞RDS的倍数变化在对数尺度上与同时期对照值进行比较。图3显示了使用0.5–100 ng/ml EGF或1–100 ng/ml HGF处理对不同年龄的39名男性和女性受试者肝细胞RDS的影响。如表1所示，相对较少的供体年龄<20岁或>70岁，大多数肝脏供体的年龄在31–70岁之间。尽管受试者之间存在一些差异，但在所有年龄段的39名男性和女性受试者的肝细胞中都观察到使用EGF或HGF处理后肝细胞RDS的增加。

## CAR和PPARα激活剂对培养的人类肝细胞RDS的影响
图4显示了使用CAR激活剂PB（浓度范围5–1000 μM）和CITCO（100 μM）、PPARα激活剂WY-14,643（50和100 μM）以及EGF（浓度范围0.5–100 ng/ml）和HGF（浓度范围1–100 ng/ml）作为阳性对照处理对雄性和女性人类肝细胞RDS的影响。肝细胞RDS中位诱导值在使用所有浓度的PB、100 μM CITCO、50和100 μM WY-14,643处理后，与对照组水平没有变化，分别为1.0、1.1、1.0和0.9。相比之下，使用0.5–100 ng/ml EGF和1–100 ng/ml HGF处理的人类肝细胞，RDS中位诱导值分别增加了3.5倍和2.1–倍。图4：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。使用对照培养基（含有0.1%或0.5% DMSO）、0.5–100 ng/ml EGF（所有浓度组合）、1–100 ng/ml HGF（所有浓度组合）、5–1000 μM PB（所有浓度组合）、100 μM CITCO、50和100 μM WY-14,643（WY）处理后，对39位供体的培养男性和女性人类肝细胞中的复制DNA合成（RDS）的影响。结果以箱线图表示，显示为相对于同时期对照值的肝细胞RDS中位变化倍数，对数刻度上绘制。水平线将矩形一分为二，代表中位数值，矩形代表下四分位数和上四分位数。须状部分代表距离箱形图内1.5×四分位数范围（IQR）最远的数据点，上须状部分是上四分位数范围+1.5×四分位数范围，下须状部分是下四分位数-1.5×四分位数范围。被标记为异常值的单个人类肝细胞实验用点表示。虽然图4展示了所有PB浓度的综合数据，但图5显示了PB各个浓度对男性和女性人类肝细胞RDS影响的结果。与EGF和HGF的研究（图4）不同，使用5–1000 μM PB处理男性和女性人类肝细胞并未显示出任何浓度依赖性反应，肝细胞RDS中位诱导值分别为对照值的1.2倍、0.9倍、1.1倍、0.9倍、1.0倍、0.9倍和0.9倍。图5：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。使用对照培养基（含有0.1%或0.5% DMSO）和5–1000 μM PB处理后，对39位供体的培养男性和女性人类肝细胞中的复制DNA合成（RDS）的影响。结果以箱线图表示，显示为相对于同时期对照值的肝细胞RDS中位变化倍数，对数刻度上绘制。水平线将矩形一分为二，代表中位数值，矩形代表下四分位数和上四分位数。须状部分代表距离箱形图内1.5×四分位数范围（IQR）最远的数据点，上须状部分是上四分位数范围+1.5×四分位数范围，下须状部分是下四分位数-1.5×四分位数范围。被标记为异常值的单个人类肝细胞实验用点表示。使用单个人类肝细胞制备物的重复性研究：对所有CLE人类肝细胞研究的数据进行检查后发现，来自一位51岁白人男性供体（表1中的供体识别号HU8210）的肝细胞总共在十四项研究中被使用（图6）。其中十项研究由实验室1进行，四项研究由实验室2进行，采用不同的培养条件和程序来评估治疗对人类肝细胞RDS水平的影响。在这些研究中，实验室1使用25 ng/ml的EGF作为肝细胞RDS的阳性对照，实验室2使用1 ng/ml和10 ng/ml的EGF。CAR激活剂PB在不同浓度（10、100、500和1000 μM）下的影响也进行了研究。尽管使用了不同的实验程序和EGF浓度，但在所有十四项研究中均观察到EGF处理后人类肝细胞RDS的统计学上显著的显著增加（图6）。相比之下，在所有十四项研究中，使用高达1000 μM的PB处理对肝细胞RDS没有任何影响。这表明该方法具有稳健性，结果可以在不同的实验室中成功重现。图6：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。使用对照培养基（含有0.1%或0.5% DMSO）和5–1000 μM PB处理后，对一名51岁白人男性供体（表1中的供体HU8210）的人类肝细胞中的复制DNA合成（RDS）的影响。结果以箱线图表示，显示为相对于同时期对照值的肝细胞RDS中位变化倍数，对数刻度上绘制。水平线将矩形一分为二，代表中位数值，矩形代表下四分位数和上四分位数。须状部分代表距离箱形图内1.5×四分位数范围（IQR）最远的数据点，上须状部分是上四分位数范围+1.5×四分位数范围，下须状部分是下四分位数-1.5×四分位数范围。被标记为异常值的单个人类肝细胞实验用点表示。使用单一人类肝细胞制备物的重复性研究：对所有CLE人类肝细胞研究的数据进行检查后发现，一位51岁白人男性供体的肝细胞（表1中的供体HU8210）在总共十四项研究中被使用（图6）。其中十项研究由实验室1进行，四项研究由实验室2进行，采用不同的培养条件和程序来评估治疗对人类肝细胞RDS水平的影响。在这些研究中，实验室1使用25 ng/ml的EGF作为肝细胞RDS的阳性对照，实验室2使用1 ng/ml和10 ng/ml的EGF。CAR激活剂PB在不同浓度（10、100、500和1000 μM）下的影响也进行了研究。虽然使用了不同的实验程序和EGF浓度，但在所有十四项研究中均观察到EGF处理后人类肝细胞RDS的稳健且统计学上显著的增加（图6）。相比之下，在所有十四项研究中，使用高达1000 μM的PB处理对肝细胞RDS没有任何影响。这表明该方法具有稳健性，结果可以在不同的实验室中成功重现。图6：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。使用对照培养基（含有0.1%或0.5% DMSO）和5–1000 μM PB处理后，对一名51岁白人男性供体（表1中的供体HU8210）的人类肝细胞中的复制DNA合成（RDS）的影响。结果以箱线图表示，显示为相对于同时期对照值的肝细胞RDS中位变化倍数，对数刻度上绘制。水平线将矩形一分为二，代表中位数值，矩形代表下四分位数和上四分位数。须状部分代表距离箱形图内1.5×四分位数范围（IQR）最远的数据点，上须状部分是上四分位数范围+1.5×四分位数范围，下须状部分是下四分位数-1.5×四分位数范围。被标记为异常值的单个人类肝细胞实验用点表示。使用对照培养基（含有0.1%或0.5% DMSO）和5–1000 μM PB处理后，对39位供体的培养男性和女性人类肝细胞中的复制DNA合成（RDS）的影响。结果以箱线图表示，显示为相对于同时期对照值的肝细胞RDS中位变化倍数，对数刻度上绘制。水平线将矩形一分为二，代表中位数值，矩形代表下四分位数和上四分位数。须状部分代表距离箱形图内1.5×四分位数范围（IQR）最远的数据点，上须状部分是上四分位数范围+1.5×四分位数范围，下须状部分是下四分位数-1.5×四分位数范围。数据以DMSO或PB各个浓度在15位供体的PROD和BROD活性研究中的影响以及6位供体的BQ活性研究中的影响表示。讨论：本文报告的结果包含了由CLE公司使用两个实验实验室进行的39个单独冷冻保存的人类供体肝细胞制备物的大量研究数据库，这些实验室采用了不同的培养条件和方法来评估测试化学物质对肝细胞RDS的影响。这些研究是为了获取关于活性成分对人类肝细胞RDS影响的数据，并包含在监管提交中。研究使用了EGF和HGF作为阳性对照剂，以及CAR激活剂PB和CITCO以及PPARα激活剂WY-14,643的研究。对于单个人类肝细胞制备物获得的数据清楚地表明，使用EGF或HGF处理的人类肝细胞对RDS有强烈的诱导反应，而人类肝细胞对CAR激活剂PB和CITCO以及PPARα激活剂WY-14,643的促有丝分裂效应具有抵抗力。人类肝细胞是一种已建立的体外测试系统，适用于多种应用，包括异生物质代谢和动力学研究、异生物质诱导的毒性研究以及CYP和其他异生物质代谢酶的诱导（Godoy et al. 2013; Hewitt et al. 2007a,b; Parkinson et al. 2004; Soldatow et al. 2013）。虽然异生物质代谢研究通常使用短时间的肝细胞悬浮液进行，但异生物质代谢酶的诱导和对肝细胞RDS的影响研究需要更长的处理时间，涉及使用铺板的肝细胞。培养的人类肝细胞已被用于评估化学物质对肝细胞RDS的影响的物种差异超过30年。在最早发表的研究之一中，虽然PB在培养的大鼠肝细胞中诱导了RDS，但PB和PPARα激活剂nafenopin均未在培养的人类肝细胞中诱导RDS，而人类肝细胞的RDS在使用EGF处理后增加（Parzefall et al. 1991）。这些研究是使用通过新鲜获取的肝脏样本进行灌流分离的人类肝细胞进行的。其他几项使用通过灌流分离的人类肝细胞的研究表明，CAR激活剂（例如PB）和PPARα激活剂（例如bezafibrate、ciprofibrate、clofibric acid、di-(2-ethylhexyl)phthalate、di-(isononyl)phthalate；2-ethylhexanoic acid、fomesafen、methylclofenapate、mono-(2-ethylhexyl)phthalate和nafenopin）与在啮齿动物肝细胞中的效果不同，不会在培养的人类肝细胞中诱导RDS（Elcombe et al. 1996; Goll et al. 1999; Hasmall et al. 1999, 2000; Hirose et al. 2009; Perrone et al. 1998）。然而，如当前研究中使用的，肝脏灌流技术的进步和改进的冷冻保存方法的发展使得可以从许多个体供体中获得高活力的可铺板人类肝细胞（Hewitt and Li 2015）。使用这样的制备物，已经对许多表现出CAR或PPARα机制的非遗传毒性化学物质进行了MOA/人类相关性研究。文献示例包括benfluralin（Strupp et al. 2020）、fluxapyroxad（Goettel et al. 2024）、metazachlor（Wiemann et al. 2019）、metofluthrin（Hirose et al. 2009; Yamada et al. 2015, 2019）、momfluorothrin（Okuda et al. 2017）、天然除虫菊酯（Osimitz and Lake 2009）、nitrapyrin（LaRocca et al. 2017）、permethrin（Kondo et al. 2020）、piperonyl butoxide（Lake et al. 2020）和sedaxane（Peffer et al. 2018a）。当前研究使用了来自39位个体供体的冷冻保存的男性和女性人类肝细胞制备物，其中包括三十六位白人、两位西班牙裔和一位非裔美国人。正如本研究清楚地显示的，使用EGF和/或HGF处理后，无论男性和女性供体的肝细胞制备物，RDS都得到了持续的刺激，而使用PB、CITCO或WY-14,643处理后未观察到RDS的增加（图2-6）。当一个肝细胞制备物被实验室1测试十次和实验室2测试四次时，PB和EGF的效果也非常一致（图6）。尽管个体之间的反应幅度存在差异，但这些研究清楚地表明了一种物种差异，即与啮齿动物肝细胞不同，EGF和HGF可以刺激培养的人类肝细胞中的RDS，而CAR和PPARα激活剂则没有这种效果。基于这些数据，可以建议在进行培养人类肝细胞RDS研究的实验室中，筛选不同批次的冷冻保存肝细胞以确定EGF或HGF的最低/最高反应数据，然后只使用在预期正常范围内的制备物进行研究。尽管进行了大量文献研究，但使用培养的人类肝细胞来评估非遗传毒性啮齿动物肝脏CAR激活剂的人类相关性仍存在疑问（van Kesteren et al. 2022）。提出的问题包括，使用培养的人类肝细胞来评估RDS的物种差异并未得到充分证实，虽然有许多关于“典型CAR激活剂”PB的实验和流行病学数据，但关于其他CAR激活剂对人类肝细胞RDS的影响以及人类流行病学研究的数据很少。这些作者还提出了所需人类供体的数量、供体的年龄范围，以及是否需要评估男性和女性供体的肝细胞的问题。van Kesteren等人（2022）还提出了EGF和/或HGF作为适合人类肝细胞RDS研究的阳性对照物的适用性问题（van Kesteren et al. 2022; Shizu and Yoshinari 2020）。van Kesteren等人（2022）提出的关于使用培养的人类肝细胞研究啮齿动物肝脏PPARα激活剂的物种差异的问题也适用于使用培养的人类肝细胞研究啮齿动物肝脏PPARα激活剂的情况（Yamada et al. 2022, 2025）。关于van Kesteren等人（2022）提出的使用培养的人类肝细胞研究RDS的物种差异尚未得到充分证实的问题，现在有基于当前数据和许多文献研究的广泛数据库（Corton et al. 2018; Yamada et al. 2021, 2025）。大量单独的人体肝细胞研究清楚地表明，非遗传毒性CAR和PPARα激动剂对培养的人类肝细胞中的细胞增殖反应（RDS）的影响存在显著的物种差异，与啮齿动物肝细胞相比。此外，这些研究在多个不同的实验室进行，使用了来自不同年龄的男性和女性捐赠者的人体肝细胞样本。正如van Kesteren等人（2022年）所指出的，PB是一种“典型的CAR激动剂”，在实验动物和人类中都已被广泛研究（Elcombe等人2014年；IARC 2001年；Lake 2018年；Monro 1993年；Whysner等人1996年；Yamada等人2021年）。根据van Kesteren等人（2022年）的评论，现在有大量的数据关于其他已知的啮齿动物肝脏CAR激动剂以及PPARα激动剂在培养的人类肝细胞中的效果（Corton等人2018年；Yamada等人2021年、2025年），并且如下面所述，还有额外的人类流行病学数据可用。另一个提出的问题是需要多少人捐赠者、他们的年龄和性别才能证明某种啮齿动物肝脏CAR激动剂对人类的相关性（van Kesteren等人2022年）。虽然本文报道的大部分研究使用了高加索捐赠者的肝细胞样本，但很明显，经过EGF和/或HGF处理的培养人类肝细胞中的RDS增加，而使用CAR和PPARα激动剂处理后没有增加，这似乎与捐赠者的年龄、性别无关（基于有限的非高加索样本数量，也与种族无关）。尽管有人建议只需一个单一的人类肝细胞样本即可排除CAR激动剂对人类的相关性（Peffer等人2018b），但本文引用的几项早期研究使用了多个肝细胞样本以提高实验结果的可靠性。本文的数据表明，没有必要在大量人类肝细胞样本中检测非遗传毒性啮齿动物CAR和PPARα激动剂的效果。如图2所示，不同个体对化学刺激的反应存在差异。可能需要进一步的研究来确定在人类肝细胞RDS研究中所需的捐赠者数量，以考虑个体间的差异。已有研究探讨了代谢多态性如何影响危险性和风险评估（Carnesecchi等人2019年；Kasteel等人2020年；Darney等人2021年）。关于与非遗传性肝脏癌变相关的核受体的药物基因组学数据（Neary和Owen 2017年）可以进一步指导体外初级肝细胞增殖试验的捐赠者选择。

EGF和HGF在肝脏生物学和再生中起着重要作用，有助于在损伤或部分肝切除后恢复肝脏组织（Kang等人2012年；Kimura等人2023年）。关于在没有合适化学物质的情况下使用EGF和/或HGF作为培养的人类肝细胞中RDS刺激的阳性对照，本文描述的研究以及本文和其他地方引用的许多其他研究（Corton等人2018年；Yamada等人2021年、2025年）已经明确表明，没有任何非遗传毒性啮齿动物肝脏CAR和PPARα激动剂能够在培养的人类肝细胞中诱导RDS。值得注意的是，当前的研究和之前的研究都包括了使用强效的人类CAR激动剂CITCO的处理效果（Maglich等人2003年；Soldatow等人2016年）。总体而言，这代表了化学物质对培养的大鼠和小鼠肝细胞中的RDS的影响存在根本的物种差异。因此，没有化学物质可以用作培养的人类肝细胞RDS研究的阳性对照，EGF和/或HGF是这类研究中唯一的可用阳性对照。

另一个潜在的问题是，使用纯化的大鼠肝细胞样本的研究表明，在PPARα激动剂处理后刺激肝细胞RDS需要Kupffer细胞的存在（Parzefall等人2001年）。然而，对于人类肝细胞样本来说这不是问题，因为像通过常规细胞分离程序制备的啮齿动物肝细胞样本一样，得到的样本将同时包含实质细胞和非实质细胞（Corton等人2018年）。虽然当前的研究使用的是单层（即二维）培养，但来自包含实质细胞和非实质细胞的球形（三维）培养系统的结果也支持这一点，其中PB在老鼠和人类肝细胞中均诱导了CYP mRNA水平（Plummer等人2019年）。然而，虽然HGF在老鼠和人类肝细胞中都诱导了RDS，但PB仅在大鼠的球形培养系统中诱导了RDS和细胞增殖基因nucleophosmin 1的水平，而在人类球形培养系统中则没有（Plummer等人2019年；Elcombe等人2025年）。因此，这些研究中使用的二维培养系统满足了评估化学物质对肝细胞RDS影响的物种差异所需的测试系统要求。增加复杂性不会提高测试性能，这对于将来将这种类型的研究扩大到筛选目的非常重要。新兴的机制数据进一步支持这些物种差异，因为最近的分子分析表明，YAP（Yes相关蛋白）与CAR以及可能的PPARα的相互作用可能导致肝细胞增殖的物种特异性差异，这与YAP在Hippo通路中的作用一致（Shizu等人2024年；Yamada等人2025年）。

本文描述的研究结果以及在其他地方引用的文献研究（Corton等人2018年；Yamada等人2021年、2025年）清楚地表明，人类肝细胞对啮齿动物肝脏CAR和PPARα激动剂的促有丝分裂效应具有抗性。然而，啮齿动物CAR和PPARα激动剂在人类中也可以观察到其他效应。例如，在啮齿动物和人类中，CAR激动剂可以引起肝脏肥大并诱导肝脏外源物质的代谢酶，而PPARα激动剂可以产生降脂效应（Corton等人2018年；Yamada等人2021年、2025年）。在当前的研究中，尽管PB对培养的人类肝细胞中的RDS没有影响，但观察到CYP酶活性的增加（图7和补充图1）。关于啮齿动物CAR和PPARα激动剂在体外培养的人类肝细胞中没有效果的数据得到了具有植入人类肝脏的嵌合小鼠的体内研究以及可用的人类流行病学数据的支持。这种嵌合小鼠模型中，移植的人类肝细胞替换了宿主肝细胞，已被用于许多应用，包括外源物质代谢和毒性的研究（Tateno和Kojima 2020年；Yamada 2021年）。用CAR激动剂PB、metofluthrin和momfluorothrin以及PPARα激动剂fenofibrate处理嵌合小鼠并未刺激人类肝细胞中的RDS（Okuda等人2017年；Tateno等人2015年；Yamada等人2014年）。关于可用的人类流行病学数据，啮齿动物肝脏CAR激动剂PB作为镇静剂、安眠药和抗癫痫药物在人类中已使用了数十年，治疗剂量水平导致的血液浓度与在小鼠中产生肿瘤的浓度相似（Monro 1993年）。因此，有大量的流行病学数据证实，长时间接受PB的人类没有出现肿瘤形成（La Vecchia和Negri 2014年；Stritzelberger等人2021年；Yamada等人2021年、2025年）。此外，还有流行病学数据显示，另外两种啮齿动物肝脏CAR激动剂oxazepam和carbamazepine也没有增加肝脏肿瘤的形成（Friedman等人2009年；Stritzelberger等人2021年；Yamada等人2021年）。同样，对于多种啮齿动物肝脏PPARα激动剂，包括bezafibrate、clofibrate、gemfibrozil和fenofibrate，也有相关的人类流行病学数据，未观察到额外的癌症死亡率（Bonovas等人2012年；Corton等人2018年；Klaunig等人2003年）。

总体而言，本文描述的结果进一步证明了培养的人类肝细胞在确定化学物质对肝脏影响的物种差异方面的有用性。可以得出结论，该方法可以在不同的实验室使用不同的实验技术进行，并且RDS的诱导性不依赖于性别、年龄或（基于有限样本数量）种族。捐赠者之间的反应幅度存在差异，这可以通过筛选冷冻保存的肝细胞样本的适用性并相对于对照组表达效应来解决。本综述还提供了对初级肝细胞作为监管测试系统的重要细节，包括暴露条件、剂量选择程序、评估的终点、变异性测量和适当的性能化学物质。这些信息是OECD指导文件34（OECD 2005）所要求的，并且与评估测试验证状态相关。系统地验证包括肝细胞之外的其他细胞类型的细胞增殖是非常推荐的。实际上，最近欧盟的一份出版物强调了使用人类肝细胞的研究在评估啮齿动物肝脏CAR激动剂的作用机制信息方面的价值（Capel?a等人2024年）。该方法被认为已经准备好根据OECD指导文件34进行彻底的验证，以系统地评估其稳健性，引入更多的标准化，并增加这种新方法在监管决策中的采用。