从原始数据到有意义的信息：一种可靠且灵活的方法来评估体外实验的反应——从新型Dicentrarchus labrax雌激素筛选测试中获得的经验

《Archives of Toxicology》：From raw data to meaningful information: a robust but flexible method to assess in vitro assay responses—lessons learned from a novel Dicentrarchus labrax estrogen screen test

　　摘要
体外检测数据的统计分析是正确解释生物反应的关键步骤。然而，由于统计方法不当、误解、统计功率不足（通常是由于样本量小）或方法定义不明确（特别是在标准化测试的情况下），这一过程仍经常受到削弱。根据临床研究和最近的生物监测研究中普遍采用的做法，使用阈值来解释结果可能提高结论的稳健性。本文介绍了一种基于正态分布的方法来定义阈值的应用。作为案例研究，这些阈值被应用于分析从DLES测试（Dicentrarchus labrax雌激素筛查测试）中获得的数据，这是一种体外筛查工具，用于检测化学物质与D. labrax核雌激素受体之间的相互作用。随后将结果与OECD TG 455衍生方法和非参数统计分析进行了比较。通过应用基于正态分布的阈值，数据分析变得更加简化，DLES测试结果的可靠性也得到了提高，尤其是在与假设检验相比时。这一点在研究非模式物种时尤为明显，因为这些物种的标准参考物质很少可用。然而，应特别注意用于定义阈值的初始数据集的大小。这里实施的方法可以为其他体外检测提供借鉴。总体而言，本文鼓励对体外数据分析方法进行反思。

引言
类雌激素内分泌干扰物（EEDC）对人类和环境健康构成了严重威胁。由于其多样的物理化学性质，它们广泛分布于所有环境介质中，尤其是在水生环境中（Kabir等人2015年；Monneret 2017年；Thacharodi等人2023年）。根据经济合作与发展组织（OECD）的测试指南（TG），已经设计了多种生物测定方法来检测与雌激素通路相互作用的化合物（OECD，2025年）。大多数，如果不是全部的话，都是使用人类受体的体外测试（TG 455、456、457和493），而体内测试主要使用啮齿动物（TG 440）和鱼类（TG 229、230、250和252）作为模式物种。这种关注点忽略了不同物种之间信号通路的复杂性，其中核受体和膜受体的类型和数量可能存在很大差异（Pinto等人2025年；Serra等人2019年、2020年；Slaby等人2024a年；Sonavane等人2016年；Zapater等人2024年）。例如，虽然哺乳动物拥有两种主要的核受体和一种膜受体，但在大多数硬骨鱼类中已鉴定出三种核受体（Esr1、Esr2a和Esr2b）和两种膜受体（GPER1和GPER1类似物）（Lafont等人2016年；Pinto等人2018年；Zapater等人2024年）。尽管评估对人类健康的风险是优先事项，但欧盟委员会已规定开发额外的标准化筛查工具，以便更好地表征环境中的EEDC（Grignard等人2022年）。因此，已经使用淡水鱼如Danio rerio、Oncorhynchus mykiss和Oryzias latipes开发了多种体外检测方法（Slaby等人2024a）。然而，也有一些生物测定方法是为海洋物种开发的，包括Micropogonias undulates（Kitano等人2006年）、Paralichthys olivaceus（Hawkins和Thomas 2004年）、Sparus auratus（Passos等人2009年；Patrícia I. S. Pinto等人2006a、b）以及Dicentrarchus labrax（Muriach等人2008年；Pinto等人2019年；Quesada-García等人2012年；Zapater等人2019年）。在此背景下，并基于先前的研究，最近提出了DLES测试，该测试涉及一种报告基因测定方法，涉及D. labrax中鉴定出的三种核雌激素受体（sbEsr1、sbEsr2a和sbEsr2b）（Slaby等人2024a）。

在生物测定处理、数据操作尤其是统计分析中，这些步骤对于解释结果至关重要。然而，只有少数标准化体外测试指南规定了详细的处理和解释数据程序（Hothorn 2014年）。即使推荐并应用了统计显著性测试，它们也可能被误用或未能反映真正的生物学意义（Greenland等人2016年；Hothorn 2014年）。此外，对p值阈值（统计显著与否）的“全有或全无”应用以及对其过度依赖应该仔细评估——或许甚至应该完全放弃，正如来自统计学、临床和医学研究、生物学以及心理学领域的800多位专家所主张的（Amrhein等人2019年）。显然，在筛查生物测定的标准化过程中，数据操作特别是统计分析是“与众不同”的。缺乏分析体外生物测定数据的标准化方法，或者至少没有足够的明确指导，这需要协调良好的实践。

长期以来，基于阈值的方法已被用于人类健康领域的数据分析。例如，临床血液分析通常与参考值相关联。Kluxen和Hothorn（2020年）提出了一些在将这些方法应用于其他领域之前需要解决的问题。这些作者对参考值的确定方式表示担忧，特别是历史对照数据与同时对照的选择，以及置信区间、容忍区间或预测区间的选择。例如，任何历史数据集的大小都需要足够大以减少方差。此外，还必须考虑在受污染条件下反应变异性的增加。在开发生物测定中定义检测限的稳健方法时，Holstein等人（2015年）强调，考虑测试条件下的方差可以降低I型和II型错误的风险，即假阳性和假阴性。

准确解释体外检测结果需要使用结合稳健性和易用性的分析工具。当测试像体外生物测定这样的常规操作时，这一点尤为重要，因为这些测试的用户可能没有特定的统计专业知识。在这种情况下，使用阈值似乎是一种合适的方法，因为它们是明确且无歧义的。对于旨在评估雌激素通路变化的生物测定，OECD TG 455指南（即体外转激活测定，用于检测雌激素受体激动剂和拮抗剂）已经依赖于将测试条件下的结果与来自阳性对照浓度范围的参考值进行比较，一方面用于评估信号诱导，另一方面用于评估信号抑制。然而，该指南没有提供检测超出自然配体通常引发的反应增强的程序。此外，TG 455方法基于与人雌激素核受体的相互作用，对此已有大量文献知识，并且有特征明确的抑制剂可用。

Leprêtre等人（2022年）使用基于正态分布的阈值解决了确定生物学上有意义反应值的问题，这些阈值已被用于环境生物监测，以分析原位笼养生物中的生物标志物反应。这些阈值的计算依赖于Besse等人（2013年）的工作，他们定义了一个基于正态分布的阈值来评估Gammarus fossarum中污染物的生物累积。简而言之，这种类型的阈值计算假设生物数据通常应遵循正态分布。这种正态分布对应于反应或生物状态的自然变异，通常称为体外测定中的“背景噪声”。显著偏离这种分布的值被解释为超出自然变异范围，因此可以归因于压力引起的效应。然后，在塞纳-诺曼底盆地的淡水-河口-沿海连续体上，这些阈值被成功应用于大规模环境生物监测（Slaby等人2024b）。

在这里，我们提出可以采用基于正态分布的阈值来进行体外筛查测定，以确定信号是否确实有意义，即是否对应于雌激素信号通路的诱导或抑制（Besse等人2013年）。为此，我们将这种阈值确定方法应用于从DLES测试（Dicentrarchus labrax雌激素筛查）中获得的结果（Slaby等人2024a）。该方法使他能够确定评估雌激素通路激活的阈值（诱导阈值）以及检测E2介导的通路激活抑制或增强的阈值（抑制阈值和增强阈值）。然后，将这些阈值获得的结果与OECD TG-455指南中基于逻辑响应定义的阈值进行了比较。此外，这种比较还包括了一种常见的统计方法（Kruskal-Wallis检验，随后进行Conover-Iman事后比较）。这一比较的结果提供了一种稳健可靠的程序，可用于分析无论是已标准化的还是仍在开发中的体外筛查生物测定数据。

材料与方法
试剂和物质
Gibcotm Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，含高浓度葡萄糖、丙酮酸钠、GlutaMAXtm和酚红）、Gibco? DMEM营养混合物F-12（DMEM/F-12，不含酚红）、Gibco?青霉素-链霉素（10000 U.mL?1）、Gibco? Opti-MEM? I低血清培养基（不含酚红）、Invitrogen? Lipofectamine? 3000转染试剂、Thermo Scientific? 17-β雌二醇（E2，纯度：98%）均购自Fisher Scientific（美国沃尔瑟姆）。胎牛血清（FBS，非美国来源）、活性炭处理过的FBS（南美洲来源）和二甲基亚砜（DMSO）购自Dutscher（法国Bernolsheim）。DI-二硫苏糖醇98%（HPLC）和腺苷5-三磷酸二钠盐均购自Sigma-Aldrich（法国Saint-Quentin-Fallavier），d-荧光素钾盐购自Revvy（法国Bussy St Martin）。

DLES测试
DLES测试是一种基于报告基因系统的体外生物测定，用于评估化合物单独或混合物的雌激素活性。它基于D. labrax的三种核雌激素受体（sbEsr1、sbEsr2a和sbEsr2b）中的一种的激活，以及在雌激素响应元件（ERE）控制下编码荧光素酶的报告基因的表达。本研究使用的程序与Slaby等人（2024年）的方法略有修改，以缩短其持续时间，并在补充信息（附录A.1）中详细描述。简而言之，HEK 293细胞（ATCC CRL-1573）按照制造商的建议使用Lipofectamine? 3000转染试剂盒进行转染。关于暴露，化合物或环境污染物提取物单独测试，或在不同浓度范围内与E2（10^-8 M）混合测试。所有暴露溶液均含有0.1% DMSO。每个平板准备了阴性对照（NC，0.1% DMSO）和一系列阳性对照E2（10^-11、10^-10、10^-9、10^-8、10^-7、10^-6 M），以获得实验的质量控制。10^-8 M的E2条件代表阳性对照（PC），因为这是观察到sbEsr1、sbEsr2a和sbEsr2b荧光素酶活性诱导的最低E2浓度（Slaby等人2024a）。每次暴露重复三次（24小时，37℃，5% CO2）。在暴露后，使用了Siebring-Van Olst等人（2013年）开发的萤火虫荧光素酶测定试剂来评估荧光素酶的活性。发光强度是通过多孔板读数器的发光功能测量的（2000毫秒，24°C，Tecan Infinite? M200，瑞士M?nnedorf）。数据分析与统计分析包括对原始数据的标准化处理。

对于每个96孔板，测试溶液的不同浓度进行了三次重复测定。发光数据如下处理：将NC的平均值视为背景噪声并从所有测量结果中减去。然后，将校正后的值相对于PC进行标准化。下面描述的所有数据分析都是使用RStudio（Build 576）完成的。

### 基于正态分布的阈值定义
使用Leprêtre等人（2022年）描述的程序，并对Besse等人（2013年）的计算方法进行了轻微修改，生成了基于正态分布的阈值。在本研究中，该方法用于确定三个不同的阈值：(i) 诱导阈值，表示荧光素酶活性显著增加；(ii) 抑制阈值，表示E2介导的荧光素酶活性显著降低；(iii) 放大阈值，表示E2介导的荧光素酶活性显著增强。用于确定阈值的数据来自诺曼底地区（奥恩河，49°09’08.0"N 0°22’57.0"W）的环境样本提取物或化学物质暴露，例如双酚A（BPA）。

为了定义诱导阈值（图1A），根据受体类型整理了所有可用数据。在平均了三次暴露测量结果后，样本量分别为sbEsr1 n=1845，sbEsr2a n=1821，sbEsr2b n=1789。由于每组样本都在不同浓度下进行了多次测试，因此每种条件的平均值分别为n=707（sbEsr1），n=699（sbEsr2a），n=698（sbEsr2b）。从每个受体数据集中随机选择30个值进行无放回抽样，并使用Shapiro-Wilk检验来确定其是否遵循正态分布（α=5%）。如果检验结果显示数据分布与正态分布无显著偏差，则确定子数据集分布的95百分位数并进行整理。否则，如果不符合正态分布条件，则逐步移除超出正态分布的最大值，直到可以接受“无显著差异”的零假设（图1A）。然后，对正态分布的数据集重复此过程10,000次，并计算所有95百分位数的平均值±标准误差（SE）。这个平均值构成了能够确定雌激素活性的诱导阈值。

**图1**：该图像的替代文本可能是通过AI生成的。

### 不同分析方法的示意图
A. 确定基于正态分布的诱导、抑制和放大阈值的方法。
B. 确定基于逻辑反应的阈值；PC10对应于最大反应的10%（即0.1d）。
C. 应用经典假设检验来识别与对照条件相比的统计显著差异。

对于抑制和放大阈值，仅考虑了在E2 10^-8 M条件下获得的数据平均值。如上所述，由于每组样本都在多个浓度下进行了多次测试，因此计算了每种条件的平均值，最终数据集分别为n=352（sbEsr1），n=351（sbEsr2a），n=346（sbEsr2b）。同样，如果应用Shapiro-Wilk检验后拒绝零假设，则移除子数据集中的最大绝对值，并重新测试正态分布。一旦验证了正态分布假设，就整理出2.5百分位数和97.5百分位数。按照之前的程序重复该过程10,000次，并计算2.5百分位数和97.5百分位数的平均值±SE，以分别定义抑制和放大阈值（图1A）。

### 判断雌激素活性、抗雌激素活性或放大雌激素活性的规则
需要两次实验重复的结果得出相似的结论（即高于或低于阈值），否则实验需要重新进行。

### 基于逻辑反应的阈值定义
基于逻辑反应的阈值是使用类似于EU DG 455指南（OECD, 2021；图1B）中描述的过程来确定的。对于每个受体和每个实验，使用暴露于一系列E2浓度后获得的结果来建立四参数逻辑曲线（4PL）。然后提取最大水平渐近值（d）并除以10，得到PC10（10%阳性对照），用于定义雌激素效应。

正如本文下面讨论的，对于从与环境样本中提取并与E2 10^-8 M混合的污染物混合物的雌激素效应，EU DG 455指南提供了一种确定抗雌激素活性的方法，但它不允许评估E2介导的诱导可能的放大效应。因此，EU DG 455指南建议使用特征明确的人类雌激素受体抑制剂他莫昔芬的浓度范围，并使用4PL模型得出的阈值来判断拮抗效应。然而，这种操作方法需要一个特征明确的抑制剂分子，这对于非模型生物体来说很少见。因此，在使用非人类受体的体外生物检测（如DLES测试）中采用TG 455指南的方法在评价拮抗效应时存在局限性。

### 非参数统计检验
另一种简单的方法——科学家们普遍熟知的方法——是应用分组统计检验，如ANOVA或Kruskal-Wallis，并进行适当的后续检验和多重比较的p值校正（图1C）。我们的分析方法包括执行标准统计检验：Kruskal-Wallis检验，然后是Conover-Iman检验，并使用Benjamini-Hochberg p值调整方法（α=5%）。当无法可靠地满足正态性和同方差性假设时，它被广泛用作ANOVA的替代方法，正如目前的工作中所做的。选择Conover–Iman检验而不是Dunn检验，因为它在组数超过五个时提供了更大的统计功效和更好的I型错误控制。

### 应用于案例研究
为了评估和比较上述不同方法的优点和局限性，将这些方法应用于使用已知识别EEDC（BPA）和环境提取物（均在不同浓度下进行评估）的数据收集的实验中。在第一个实验中，测试了四种浓度的BPA，分别与天然配体E2（10^-8 M）组合或不组合，使用DLES检测在10、100、1000和10,000 nM的环境实际浓度下进行。

随后，上述数据处理的步骤也被应用于淡水样本的筛选。该样本于2024年1月从塞纳河（49°20’18.9"N 1°05’48.6"E，法国奥塞尔）采集（2升）。使用亲水-疏水平衡卡盘进行污染物提取，可以捕获广泛的分子，仅排除极端极性和极端非极性化合物。然后用丙酮和甲醇进行连续洗脱。洗脱物在真空下蒸发。提取的物质溶解在DMSO中，最终浓度是环境浓度的2000倍（2000X）。然后在四个浓度下测试提取物：0.01X、0.1X、1X和10X，分别结合和不结合E2（10^-8 M）。

### 结果与讨论
如图2和图3所示，使用基于正态分布的阈值方法确定的阈值表明，BPA通过sbEsr1（10000 nM）、sbEsr2a（10000 nM）和sbEsr2b（10、1000和10000 nM）诱导了雌激素信号的增加，而环境污染物提取物通过sbEsr2a（在所有浓度下）和sbEsr2b（0.001X）引发了反应。在BPA暴露后使用基于逻辑反应的阈值也得到了类似的结果（图4）。然而，对于环境污染物提取物可以注意到一个微小差异：没有检测到sbEsr2b的诱导（图5）。有三个主要假设可以解释这些结果。首先，基于正态分布的阈值对检测暴露诱导反应更为敏感。相反，由于基于逻辑反应的阈值主要由E2浓度范围内的最大值驱动，因此该浓度范围内的任何变化都可能人为地提高或降低阈值，分别导致假阴性或假阳性结果。最后，根据每个受体的反应变异性（基于正态分布的阈值）定义特定阈值，考虑到它们自身的特异性和敏感性，可以提供一种更可靠的手段来区分雌激素活性，相比于逻辑反应阈值中使用的有些任意的10%最大反应阈值。

### 结论
然而，对于风险评估来说，观察到sbEsr2b反应在两种方法之间的差异可能不是问题。实际上，由于无论浓度如何都检测到了雌激素化合物的存在和效应，这两种方法都将环境位置分类为受影响。然而，如果目标是表征已知物质或混合物的响应，则可能需要准确量化有效浓度，这样的差异可能会变得关键。

**图2**：该图像的替代文本可能是通过AI生成的。
**图3**：该图像的替代文本可能是通过AI生成的。
**图4**：该图像的替代文本可能是通过AI生成的。
**图5**：该图像的替代文本可能是通过AI生成的。

### 讨论
尽管在两种方法之间观察到差异，但对于风险评估来说可能不是问题太大。实际上，这两种方法都将环境位置分类为受影响，因为无论浓度如何都检测到了雌激素化合物的存在和效应。然而，如果目的是表征已知物质或混合物的响应，则可能需要准确量化有效浓度，这种情况下差异可能会变得关键。

如上所述，在任何案例研究中都没有观察到雌激素信号通路的抑制。当数据集足够大时，使用基于正态分布的阈值定义特定阈值可以替代对明确的拮抗剂响应控制的需求，因为这些阈值是基于在含有E2（10 nM）的条件下观察到的反应变化。实际上，可以使用已知雌激素受体拮抗剂（例如他莫昔芬）来评估生物测定中雌激素活性的抑制。然而，需要进一步的研究来充分表征任何可能的拮抗剂候选物的剂量-反应效应，并评估它们作为定义雌激素活性抑制的参考化合物的适用性。在人类研究中常用的参考化合物的应用需要谨慎进行，因为不同物种之间的受体反应可能存在显著差异。当应用到非模式生物体时，可能会出现特定分类单元或群体的雌激素信号传导差异。这突显了需要仔细评估用于哺乳动物系统的雌激素受体激动剂和拮抗剂的分类特异性，以避免对信号传导机制的保守性做出错误假设和不适当的推断（Pinto等人，2025年）。例如，ICI 182,780在哺乳动物中被认为是完全的拮抗剂，但在其他分类单元中可能表现为选择性的雌激素受体调节剂，包括与环境相关的生物如硬骨鱼类，在这些生物中它可能表现出拮抗、激动或增强效应（Notch和Mayer 2011年；Passos等人2009年；Patrícia I.S. Pinto等人2006a, b年；Slaby等人2024a年）。另一个示例是关于人类雌激素受体拮抗剂甲基哌啶基吡唑和吡唑[1,5-a]嘧啶，它们未能抑制D. rerio的核雌激素受体对EE2的作用，而共暴露于这两种拮抗剂的情况下反而增强了EE2介导的反应（Notch和Mayer 2011年）。基于正态分布的阈值方法表明，在暴露于10,000 nM的BPA后，通过sbEsr1和sbEsr2b途径诱导的雌激素活性增加（图2），以及在0.01X、0.1X和1X的环境提取物下通过sbEsr2a途径也观察到这种增加（图3）。此外，内分泌干扰不仅可能是由于拮抗剂干扰了配体-受体结合的正常反应，也可能由于某些物质直接作用于受体或下游信号转导通路从而增强了反应。然而，现有的标准化检测方法（如OECD TG 455）并未涵盖这一机制，因为目前缺乏能够引起这种特定雌激素受体效应的典型参考分子。

为了评估反应或生物状态的变化是否与阳性或阴性对照有显著差异，需要使用统计测试程序。选择合适的测试方法取决于数据的性质及其变异性。参数化测试由于其更强的统计效力而更受青睐，但当样本量（n）较小时，通常会使用非参数化测试，正如本研究中的情况——这在生物测定中很常见。一方面，有限的样本量限制了正态性和同方差性的检验。然而，较低的统计效力往往会降低检测到真正显著差异的可能性。统计测试常被用于分析体外测试数据。实际上，在同时设置的对照中测量相同终点相对简单，因为稀释测试化合物的介质本身就起到了阴性对照的作用。然而，多项研究指出这些测试容易被误用，p值常常被高估（Amrhein等人2019年；Greenland等人2016年；Hothorn 2014年；Thiese等人2015年）。重要的是，这些方法依赖于足够的实验重复次数以得出可靠的结论，这与结果的变异性相关。然而，即使在高通量筛选工作中，也难以达到足够的重复次数。

如图6所示，在没有E2的情况下，本研究中进行的非参数测试只在10,000 nM BPA暴露下对sbEsr1（p值=1.79e-07）、sbEsr2a（p值=0.004）和sbEsr2b（p值=0.002）的反应显示出显著诱导，在1,000 nM BPA暴露下对sbEsr2b的反应也有显著诱导（p值=0.035）。同样，在结合E2的暴露条件下，10,000 nM BPA下sbEsr1和sbEsr2b的反应被增强（p值分别为0.0003和0.007，图6），而在0.01X和1X环境提取物下也观察到这种增强（p值分别为0.008和0.0006，图7）。这些显著差异也通过基于正态分布的阈值方法被检测到。然而，非参数程序未能检测到其他相关变化（图2和图3）。将 BENJAMINI-HOCHBERG校正应用于Conover-Iman测试得出的p值会导致统计效力降低，而其他校正方法可能会增加I型错误的风险或进一步降低统计效力。尽管如此，缺乏检测到的主要原因仍然是与反应变异性相关的低重复次数（n=3），这是体外筛选工作中经常遇到的限制。

值得注意的是，非参数测试还发现，在0.001X和0.01X环境提取物下，sbEsr1对E2诱导的反应有显著抑制作用（p值分别为7.3e-05和3.7e-06，图7）。这些效果没有被基于正态分布的阈值方法检测到（图3）。区分真实变异和自然生物变异仍然具有挑战性，尤其是对于仅基于小数据样本的传统统计分析而言。相比之下，基于正态分布的阈值方法通过考虑反应的自然变异性消除了这些假阳性结果。

本研究中使用的阈值是根据Besse等人（2013年）和Leprêtre等人（2022年）的方法确定的，称为基于正态分布的阈值，用于定义污染物提取物引起的雌激素效应。这些阈值分别为sbEsr1的10.16%、sbEsr2a的10.23%和sbEsr2b的5.02%。对于评估E2诱导反应的抑制或增强作用，分别为sbEsr1的49.55%和127.41%、sbEsr2a的72.59%和143.66%、sbEsr2b的69.70%和131.61%（表1）。建议使用阈值；然而，其确定必须适当进行。如果数据特征更适合，也可以采用其他方法，例如当数据在无压力条件下不遵循正态分布时。例如，Besse等人（2013年）还提出可以将数据拟合到Baranyi模型。这种模型的应用是因为在原位采样的生物体中，污染物浓度的增加可能表现出类似于细菌生长模型的分布。在这种情况下，滞后参数被用作阈值。

应用基于正态分布的阈值定义的一个必要条件是拥有足够大的数据集，以获得稳健的阈值（Leprêtre等人2022年）。大规模数据集能更好地反映每个受体的内在敏感性和降低的变异性。实际上，尽管生物测定的实验条件受到严格控制，但房间温度、细胞质量、细胞培养基质量或移液精度等参数的小变化仍然不可避免，可能导致反应的小差异。此外，通过整合对照和暴露条件下的所有数据，基于正态分布的阈值方法可以解释体外测试中可能引起的反应变异性变化（Holstein等人2015年）。

在标准化之前，应通过严格的过程验证生物测定，以表征反应变异性和测试的预期范围。这一步提供了积累足够数据的机会，以便后续设置可用于反应分析的阈值。作为关键因素，数据集的大小必须根据反应变异性进行调整。在这项工作中，我们主要使用了来自环境质量评估的大量数据。然而，数据集的大小不应仅取决于分析时的观察次数，而应基于计算平均值的可靠性指标来确定。正如表1所示，每个阈值的99.9%置信区间宽度小于1%，表明估计是可靠的。正如Horowitz等人（2010年）在定义、建立和验证临床测定中的参考区间时所提出的，阈值必须在不同实验室之间具有可转移性。因此，必须满足某些要求：首先，分析程序应保持一致。对协议的任何修改可能都需要重新确定阈值，或者至少比较其对结果的影响。例如，在基因报告基因测定的情况下，感兴趣的基因（此处为sbEsr1、sbEsr2a、sbEsr2b和报告基因）可以在不同的细胞系中表达。这些修改及其可能引入的内在数据集变异性应被彻底研究和理解。其次，Horowitz等人（2010年）强调了测试对象群体可比性的重要性。然而，这一条件主要适用于体内测定，对于体外生物测定来说重要性较低。

本文提倡一种用户友好的方法，该方法具有广泛适用性，可以用于提取体外筛选生物测定的稳健数据分析和解释。Besse等人（2013年）的方法经过Leprêtre等人（2022年）的修改，可以简单地确定考虑实验变异性的阈值。此外，它还能够评估相对于阳性对照的反应效应（无论是抑制还是增强），这在使用非模式物种时非常有价值，或者在这种情况下，非模式物种的受体可能与描述良好的模式物种的受体略有不同。值得注意的是，这种方法依赖于数据集的变异性和大小。它要求实验程序重复进行多次，这对提出新的生物测定时无论如何都是必要的。使用明确和标准化的反应标准可以方便结果比较和更有效地评估效应。稳健的体外分析和结果解释是指导研究的重要基础。这是不良后果途径框架的关键部分，最终有助于进行相关和可靠的风险评估。