番茄（Solanum lycopersicum）中胞嘧啶N4乙酰化（ac4C）的表转录组学分析及其在热应激条件下的动态变化

《Molecular Horticulture》：Epitranscriptomic profiling of cytosine N4 acetylation (ac4C) in Solanum lycopersicum and dynamic changes under heat stress condition

　　摘要：N4-乙酰胞苷（ac4C）是一种在真核生物中进化保守的RNA修饰类型，它作为一种关键的表观转录组调控因子，能够增强mRNA的稳定性和翻译效率。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）中，ac4C已被证实为转录组稳态的调节因子，通过调控翻译效率和维持RNA结构发挥作用；然而，其他植物物种中ac4C的分布模式和生物学功能尚未得到充分探索。对番茄（Solanum lycopersicum）的全转录组ac4C图谱分析显示，这种修饰具有跨物种保守的特征，尤其在mRNA翻译起始和终止区域富集，并且修饰基序和目标基因的功能类别在不同物种间高度保守。值得注意的是，热应力会引发ac4C的普遍乙酰化，而乙酰化基因主要位于编码光合作用相关基因和耐热性调控因子的转录本中。多组学整合分析进一步表明，这些基因在应激响应通路中显著富集，且其转录水平升高。SLNAT10基因的沉默导致热应力条件下高度乙酰化转录本的稳定性下降。这些发现揭示了RNA乙酰化与促进转录重编程的转录后调控的同步性，为植物通过表观转录组控制环境适应性提供了机制。

在番茄（Solanum lycopersicum）的热应力条件下，观察到ac4C的全球性乙酰化增加。乙酰化基因在与光合作用和耐热性相关的通路中显著富集，并表现出协调的转录上调以及转录后稳定性的增强。本研究中使用的基因及相关访问号码信息可以在数据库（Sol Genomics Network：https://solgenomics.net）中找到，基因名为SLNAT10（Solyc04g051670.2.1）。

引言：在表观转录组学领域，已经鉴定出超过170种不同的RNA化学修饰类型，这些修饰类型作为转录后调控元素发挥了重要作用（Zhao等人，2017年）。这些修饰对于精确调控基因表达、维持RNA稳定性和确保准确翻译至关重要；因此，它们的发现扩展了我们对调控RNA代谢复杂网络的理解（Nachtergaele和He，2018年）。几乎所有类型的细胞RNA，包括编码RNA和非编码RNA（如tRNA、rRNA、lncRNA和miRNA）都检测到了化学修饰（Roundtree等人，2017年）。其中，甲基化是最被广泛研究的修饰类型，典型的例子包括N6-甲基腺苷（m6A）、5-甲基胞苷（m5C）、N7-甲基鸟苷（m7G）、伪尿苷（Ψ）和N1-甲基腺苷（m1A）。相比之下，关于RNA乙酰化修饰的研究仍然有限，而ac4C是最具代表性的类型。这种修饰主要发生在胞苷的氨基上，形成N4-乙酰胞苷。首次在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的tRNA-Met中发现了ac4C修饰（Oashi等人，1972年），后续研究证实了它在包括人类和酵母在内的多种真核生物系统中的存在，从而证明了其跨物种的保守性（Thomas等人，2018年）。ac4C的酶促沉积由ATP依赖的乙酰转移酶催化（Ito等人，2014年），其中人类NAT10和酵母Kre33是主要的“写入”蛋白（Sharma等人，2015年）。这些酶利用乙酰-CoA作为乙酰供体来完成修饰。与广泛研究的m6A修饰不同，ac4C因其在多种生物学背景下通过增强RNA稳定性和翻译效率而受到关注（Arango等人，2018年）。在mRNA分子中，ac4C修饰通过调节其二级结构来提高稳定性和翻译准确性（Dominissini等人，2018年）。在tRNA中，ac4C集中于反密码子环区域，优化折叠和解码效率以确保蛋白质合成的准确性。在核糖体RNA（rRNA）中，ac4C对于核糖体亚单位的正确组装至关重要；缺乏这种修饰与蛋白质合成效率降低、代谢紊乱和细胞功能受损相关。此外，ac4C在各种生理和病理条件下也起着重要作用。DNA损伤后NAT10的表达会上升，从而增强细胞对H2O2诱导的衰老的抵抗力（Liu等人，2016年）。在乳腺癌中，NAT10的过表达增加了肿瘤相关蛋白（如EGFR）的翻译效率，从而推动肿瘤进展（Wei等人，2023年）。此外，人类免疫缺陷病毒（HIV）利用宿主来源的NAT10来修饰vRNA，从而增强病毒的翻译和增殖（Tsai等人，2020年）。这些发现表明，ac4C修饰不仅调节RNA稳定性和功能调控，还通过多种分子机制参与应激反应、基因调控和病理过程，为其作为治疗靶点和生物标志物的潜力提供了依据。

在植物中，对ac4C修饰的研究正在迅速发展。acRIP-seq技术已经绘制了拟南芥和水稻中ac4C的分布图谱，揭示了其对RNA稳定性和剪接调控的贡献（Li等人，2023年）。这种修饰调节mRNA的转录重编程，在植物免疫反应中发挥关键作用。乙酰转移酶OsNAT10/OsACYR在免疫激活期间增强与免疫相关的基因翻译并激活茉莉酸生物合成（Lu等人，2024年）。此外，深度学习模型“iac4C”被用于识别植物RNA转录区域中的特定ac4C修饰模式，突出了其在可变剪接调控中的作用（Guo等人，2024年）。在番茄果实中，ac4C修饰在果实成熟相关基因中富集，并影响乙烯的产生、果实质地和风味（Ma等人，2024年）。基于这些发现，本研究进行了acRIP-seq分析，以检测和绘制番茄植物中的全转录组ac4C模式，并分析番茄叶片mRNA中ac4C修饰的分布情况。通过结合acRIP-seq和RNA-seq的分析，研究了番茄植物在热应力条件下mRNA乙酰化修饰的动态变化及其对mRNA转录水平的影响。我们的结果揭示了ac4C在应对环境应力方面的潜在调控机制及其对mRNA稳定性的影响。

结果：番茄（S. lycopersicum）mRNA中胞苷N4乙酰化（ac4C）的存在：RNA ac4C修饰已在拟南芥（A. thaliana）和水稻（O. sativa）的mRNA中得到验证（Li等人，2023年；Wang等人，2023年）。这种mRNA中的修饰非常丰富，被认为可以调节基因表达或维持mRNA稳定性。为了确定番茄植物中是否存在ac4C修饰，从6周大的番茄叶片中提取总RNA，并使用寡dT包被的磁珠纯化mRNA。首先通过RNA点印迹分析评估了番茄mRNA中ac4C修饰的存在（图1A），观察到显著的ac4C特异性信号。为了在全基因组范围内绘制修饰位点，进行了acRIP-seq分析。含有ac4C修饰的RNA片段用ac4C特异性抗体免疫沉淀（图1B），并对高质量库进行测序，然后将干净读段比对到番茄参考基因组（Sol Genomics Network：https://solgenomics.net）以鉴定ac4C修饰的转录本。

图1：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

番茄mRNA中ac4C的检测及SLNAT10的亚细胞定位：对番茄mRNA中的ac4C修饰进行RNA点印迹分析。采用抗ac4C抗体对连续十倍稀释的样本（500 ng至5 ng）进行探测，显示出强烈的ac4C特异性信号。B：acRIP-seq的流程图，用于鉴定S. lycopersicum中ac4C修饰的mRNA。C：Western blotting分析确认了SLNAT10-GFP融合蛋白的表达。D：SLNAT10-GFP在番茄叶片表皮细胞和原生质体中的核定位。与核标记H2B-mCherry的共定位证实了其 exclusively nuclear靶向。比例尺=20 μm。

为了鉴定负责ac4C沉积的乙酰转移酶，对公开的拟南芥（A. thaliana）和水稻（O. sativa）NAT10序列进行了BLAST搜索，发现番茄中有一个单拷贝的同源物，命名为SLNAT10（Solyc04g051670.2.1）。序列比对显示，番茄RNA胞苷乙酰转移酶的氨基酸序列与酵母Kre33、人类NAT10和拟南芥NAT10具有相似性（图S1A）。进一步的系统发育分析表明，SLNAT10与其他茄科植物的NAT10同源物相似，但不位于同一分支上（图S1B）。亚细胞定位分析显示，EGFP标记的SLNAT10在番茄叶片表皮细胞和原生质体中均仅定位于细胞核内，这与其他物种中NAT10同源物的核功能一致。此外，Western blotting分析确认了SLNAT10在番茄叶片中的表达（图1C和图S2）。

对番茄RNA ac4C 组学的分析：acRIP-seq实验进行了三次生物学重复实验，每个样本产生的数据量至少为7.48 Gb，且清洁读段的Q30评分超过90%。高质量测序读段使用STAR软件比对到番茄参考基因组，生成了7-20百万个映射到番茄基因组的读段。每个样本的映射率均超过90%，证实了acRIP-seq在检测番茄mRNA中ac4C修饰方面的准确性（补充材料2）。全基因组分析显示，共有6,311个ac4C峰值分布在5,167个基因上，它们在所有12条番茄染色体上均匀分布（图2A）。峰值长度分析显示，峰值大小范围主要是75-500 bp（图2B）。基因注释表明，ac4C修饰在起始密码子附近富集（图2C），这与人类、拟南芥（A. thaliana）和水稻（O. sativa）mRNA中的观察结果一致（Dominissini等人，2018年；Li等人，2023年；Wang等人，2023年）。值得注意的是，与拟南芥（A. thaliana）和水稻（O. sativa）不同，31.3%的ac4C修饰集中在3'非翻译区（UTR），而近47.47%位于基因的非编码区域（图2D）。为了鉴定保守的ac4C基序，使用HOMER软件分析共享峰值，提取序列区间并可视化富集基序。鉴定出两个富集基序CNHCGVCV和CWGCKG（图2E）。尽管它们缺乏拟南芥（A. thaliana）和水稻（O. sativa）中的强周期性（CUUCUUCYUCYU在拟南芥中排名较高，CNNCNNCNNC在水稻中排名较高（Li等人，2023年）），但它们遵循类似CNN的骨架，并显示出以CG为中心的富集特征，表明在组成层面具有部分保守性。

图2：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

番茄中ac4C峰的全基因组分布和序列基序：Circos图展示了番茄基因组中ac4C修饰的模式。从外到内的两个环分别显示了基因组上ac4C修饰的分布密度（第一环）和染色体片段上ac4C修饰的富集程度（第二环）。B：目标基因中ac4C峰的长度分布。C：Metaplot显示了番茄转录本中ac4C峰的分布。底部显示了UTR和CDS的相对位置。D：不同功能区域中ac4C修饰转录本的比例分布。E：在ac4C峰中鉴定出的前五个保守基序。

为了阐明番茄中ac4C修饰的潜在生物学功能，对具有ac4C修饰峰的基因进行了基因本体（GO）和KEGG通路分析。GO富集分析表明，ac4C修饰的RNA与关键过程相关，包括rRNA代谢过程、核糖体生物发生和mRNA剪接，表明它们在调控基因表达和蛋白质合成中起核心作用。分子功能分析显示，这些修饰在RNA结合、核酸结合和蛋白质结合方面富集，直接将ac4C与RNA-蛋白质相互作用和转录后调控联系起来。细胞组分分析进一步将这些修饰定位到RNA处理的功能中心，包括细胞核、核仁和核糖体，并在线粒体和叶绿体中也有富集，表明它们在能量代谢和光合作用中可能具有潜在作用。KEGG通路分析显示，经过ac4C修饰的RNA在“剪接体”、“RNA运输”和“核糖体生物发生”等通路中富集，这突出了它们在RNA成熟和翻译中的重要性。值得注意的是，与光合作用相关的通路表明其可能与叶绿体基因表达和光依赖性过程有潜在的联系。总体而言，这些发现证实ac4C是一种多方面的调控因子，在番茄植物中调节RNA代谢、翻译精确性和细胞器功能（图3）。图3：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

对番茄中经过ac4C修饰的转录本进行富集分析：A. 对番茄ac4C修饰转录本的生物过程进行GO富集分析；B. 对番茄ac4C修饰转录本的分子功能进行GO富集分析；C. 对番茄ac4C修饰转录本的细胞组分进行GO富集分析；D. 对番茄ac4C修饰转录本进行KEGG富集分析。

热应激下番茄中ac4C乙酰化的特征表明，ac4C在热适应中的保守作用得到了支持，因为它能够在Thermococcus kodakarensis中稳定RNA（Sas-Chen等人，2020年），这表明这种修饰在应激反应中具有进化保守性。为了探索其在植物中的功能相关性，研究人员对热应激番茄植物的mRNA进行了acRIP-seq分析。结果表明，热应激并未导致ac4C修饰在基因功能区域的分布或ac4C修饰的峰值长度发生显著变化（图4A-B）。然而，值得注意的是，与ac4C峰值相关的序列基序在热应激条件下表现出不同的模式：排名最高的基序是CWG，但大多数排名靠前的基序仍保持特征性的CNN序列模式（图4D）。定量分析显示，ac4C峰值的数量和相关基因的数量均有所增加，峰值数量从5,167个增加到6,311个，含有这些峰值的基因数量从7,372个增加到8,824个（图4E）。此外，热应激条件下ac4C修饰的水平也显著上升（图4F）。

热应激诱导的番茄转录本中ac4C修饰的动态变化：A. 一张Metaplot图表显示了正常条件和热应激条件下的ac4C峰值分布；底部显示了UTR和CDS的相对位置；B. 一个饼图显示了热应激条件下番茄基因中不同转录区域（5'UTR、CDS、3'UTR）中ac4C峰值的比例分布；C. 一个直方图显示了热应激条件下与ac4C峰值相关的基因的长度分布；D. 在热应激条件下从ac4C富集转录本中鉴定出的前五个序列基序；E. 在正常生长条件（25°C）和热应激条件（42°C）下番茄转录本中ac4C峰值及其相关基因的数量；F. 在25°C或42°C条件下番茄植物中RNA修饰水平的箱形图（log10(RPKM)）。42°C下的RNA修饰水平显著高于25°C（p<0.001，Welch’s t检验）；G. 对DMGs的生物过程进行GO富集分析；H. 对DMGs进行KEGG富集分析。

使用DESeq2鉴定出在热应激条件下与室温条件相比发生显著修饰的基因，共鉴定出2,721个差异修饰基因（DMGs）。对这些DMGs的GO富集分析显示，其分子功能和生物过程发生了显著变化。与非热处理条件相比，结果突出了几个应激响应通路，特别关注与活动相关的分子功能和热适应生物过程。生物过程主要由热响应通路主导，包括“对热的响应”和“对温度刺激的响应”（图4G），直接将ac4C与热适应过程中的转录重编程联系起来。此外，光合作用电子传递链的富集表明，ac4C介导的调控可能在应激条件下对于维持光合作用效率是必要的。代谢通路也显著富集，表明向与应激相关的次级代谢产物生产方向发生了适应性转变。分子功能分析突出了与活动相关的术语，并显示了ac4C修饰在热应激期间对酶和蛋白质调控的重要性。“裂解酶活性”和“苹果酸脱氢酶活性”的富集表明ac4C在调节碳代谢以维持能量稳态中的作用，而“SNARE结合”的富集表明在应激条件下增强了囊泡运输（图4G）。总体而言，这些发现表明，ac4C通过影响转录重编程、代谢适应和通过RNA修饰的细胞保护来增强番茄的抗热性。

为了研究热应激条件下ac4C修饰对mRNA转录的影响，采用了RNA-seq分析来分析暴露于高温下的番茄mRNA的转录变化。分析结果显示，在热处理后有5,154个差异表达基因（DEGs），包括2,694个上调基因和2,460个下调基因（图5A-B）。通过将具有显著转录变化的基因与具有显著ac4C修饰变化的基因进行比较，进行了联合分析。与ac4C修饰数据的整合显示有614个重叠基因（图5C），这些基因根据转录和乙酰化水平的log2(fold-change)值被分为四组（图5D）。在这四组中，超上调组（包含219个基因）明显大于其他三组，表明ac4C修饰与转录上调之间存在正相关。这些发现表明，ac4C修饰可能在应激条件下增加转录活性。

热应激条件下转录和ac4C修饰动力学的综合分析：A. 一个条形图显示了热处理后5,154个差异表达基因（DEGs）在转录水平上的变化，包括2,694个上调基因和2,460个下调基因；B. 一个火山图显示了DEGs的分布，包括2,694个上调基因（红色）和2,460个下调基因（蓝色）；C. 一个韦恩图展示了614个DMGs和DEGs显著改变的基因的重叠情况；D. 一个象限图可视化了614个共同基因在热应激条件下转录和乙酰化水平的变化，区分了超上调组、超下调组、低上调组和低下调组；E. 对219个超上调基因进行了基因本体（GO）富集分析；F. RT-qPCR结果显示，在热应激条件下四个候选基因的转录水平显著上调。数据代表三次生物复制的平均值±标准差（*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001）。GO分析显示超上调组（图5E）中的应激响应生物过程，如“甲醛分解过程”、“对活性氧（ROS）的响应”、“对热量的响应”和“对过氧化氢的响应”，表明它们在减轻热诱导的细胞损伤中的作用。分子功能类别包括酶活性（谷胱甘肽脱氢酶、酒精脱氢酶、酸性磷酸酶和双加氧酶），将ac4C与代谢重组和解毒联系起来。这些发现共同表明，ac4C在热应激下通过协调转录韧性起作用。实验验证（图5F, G）针对在42°C（12小时）与25°C对照组下处理的6周龄番茄植物中的四个超上调基因（Solyc06g036290.3、Solyc05g021540.2、Solyc01g105970.3和Solyc02g093600.3）。在高温和对照条件下分析了选定基因的ac4C修饰水平和转录表达。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性后（图S3），acRIP-RT-qPCR的结果显示，在热应激条件下四个候选基因的ac4C修饰显著增加，而RT-qPCR分析显示它们的转录水平也显著上调（图5F-G）。RT-qPCR分析显示，在热应激条件下这些基因的转录水平上调（图5F）。值得注意的是，acRIP-RT-qPCR显示这些基因的ac4C修饰水平也相应增加（图5G）。同时，通过RT-qPCR和acRIP-RT-qPCR对两个超下调基因（Solyc10g050460.1、Solyc01g091320.3）的验证显示，这两个候选基因在热应激下的转录水平显著降低（图S4A-B），以及相应的ac4C修饰减少（图S4C-D）。这种转录和乙酰化的协调与一个机制模型一致，即ac4C修饰可能通过增强mRNA稳定性来促进应激响应基因的表达。

为了研究热应激条件下ac4C修饰对mRNA转录的影响，采用了RNA-seq分析来分析暴露于高温下的番茄mRNA的转录变化。分析显示，在热处理后有5,154个差异表达基因（DEGs），包括2,694个上调基因和2,460个下调基因（图5A-B）。通过将具有显著转录变化的基因与具有显著ac4C修饰变化的基因进行比较，进行了联合分析。与ac4C修饰数据的整合显示有614个重叠基因（图5C），这些基因根据转录和乙酰化水平的log2(fold-change)值被分为四组（图5D）。在四个类别中，超上调组（包括219个基因）明显大于其他三类，表明ac4C修饰与转录上调之间存在正相关。这些发现表明，ac4C修饰可能在应激条件下增加转录活性。

在这项研究中，我们使用acRIP-seq技术系统地分析了番茄mRNA中的ac4C修饰。我们的结果确认了番茄叶片mRNA中存在ac4C修饰。在所有IP样本中，都检测到了ac4C信号，并成功绘制了它们的基因组分布图。番茄mRNA中的ac4C修饰分布在整个染色体上，尤其是在启动密码子附近富集，并且与一个保守的CNN序列基序相关。通过对拟南芥（A. thaliana）和油莎草（O. sativa）中显著修饰基因的比较功能富集分析，发现ac4C靶基因在植物中具有相当大的功能保守性。这些基因主要富集在与RNA结合、蛋白质结合和GTP酶活性相关的途径中。为了研究ac4C修饰在植物应激反应中的作用，我们使用了acRIP-seq技术来分析热应激下的番茄。结果表明，热应激与mRNA中ac4C修饰水平的增加有关，特别是在3'UTR区域的富集更为明显，尤其是在终止密码子附近。这些发现表明，ac4C修饰可能会提高翻译效率和准确性，从而促进应激响应基因的表达，帮助植物更好地应对高温 stress。在哺乳动物中，已证明mRNA中的ac4C修饰可以增加转录本稳定性和翻译效率（Arango等人，2018年）。类似地，植物研究也表明，ac4C修饰的转录本往往具有更长的半衰期和更高的翻译效率（Wang等人，2023年）。我们的实验结果进一步证实了ac4C修饰与热应激条件下RNA稳定性之间的潜在联系。在热应激条件下表达增加的基因显示出相应的转录本丰度增加，这些基因主要富集在与环境应激反应相关的途径中。与这些发现一致的是，SLNAT10的沉默会导致热应激条件下高度乙酰化转录本的稳定性降低。因此，这些转录本在暴露于高温时表现出明显的寿命缩短，并加速降解，这突显了ac4C在维持植物应激反应期间mRNA完整性中的重要作用。

尽管有这些发现，但仍有一些未解决的问题。鉴于ac4C修饰在mRNA代谢中的关键作用，未来的研究可以使用高分辨率的空间转录组技术，系统地研究NAT10及其目标mRNA在组织特异性和细胞异质性水平上的共定位特征，从而阐明它们的时空调控机制。此外，尽管NAT10介导的ac4C修饰已经得到了很好的表征，但负责特异性识别ac4C并决定其生物学效果的“读取”蛋白尚未确定。未来的研究可以将RNA-蛋白质共沉淀与基于质谱的蛋白质组学分析相结合，系统地鉴定候选蛋白。总体而言，这些研究方向的进步将加深我们对由NAT10介导的RNA修饰在植物发育和环境适应中调控网络的理解。

**材料与方法**

**植物材料及生长条件**
本实验使用了六周大的番茄（S. lycopersicum）。栽培过程包括16小时光照和8小时黑暗的恒定光周期，温度维持在25°C，相对湿度设置为60%。
对于热应激处理，一部分植物在持续光照条件下暴露于42°C下12小时，而对照植物则保持在25°C下，具有相同的湿度和光周期条件。处理后和对照组的叶片组织立即被采集用于后续分析。

**生成稳定过表达和瞬时沉默的番茄品系**
SLNAT10的CDS被克隆并插入到与Gateway兼容的Gateway100载体中，位于CaMV 35S启动子下，其序列得到验证后，再引入根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens，GV3101）以转化番茄子叶外植体。共培养后，外植体在添加卡那霉素和头孢噻肟的MS培养基上选择并再生，然后在选择性培养基上生根。T0代植物随后移植到土壤中并通过自交繁殖到T1代。转基因植物通过针对选择标记物的PCR得到确认，表达水平通过RT-qPCR（标准化至肌动蛋白）进行验证，并至少选择三条具有强SLNAT10过表达的独立纯合品系用于后续分析。对于基因沉默，使用了TRV VIGS系统（pTRV1 + pTRV2-SLNAT10）通过农杆菌介导的叶片渗透。

**质粒构建**
为了生成35S:SLNAT10-GFP载体，从番茄cDNA中扩增SLNAT10的全长编码序列，并使用In-Fusion克隆技术（ClonExpress II One-Step Cloning Kit，Vazyme）将其克隆并插入pCAMBIAsuper1300-GFP载体中。

**RNA提取和RNA点印迹**
RNA提取时，将200毫克处理过的叶片迅速冷冻在液氮中，然后用研磨机粉碎，然后用Trijol试剂（Vazyme）提取。使用NanoDrop2000仪器在260 nm和280 nm处测量吸光度来评估RNA浓度和纯度。(reverse transcription) 使用TransScript? All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（Vazyme）进行。

**ac4C修饰的验证**
使用点印迹法验证RNA样本的ac4C修饰。将RNA在70°C下加热10分钟，然后将每个样本或稀释液的1 μL点印在硝酸纤维素膜上。膜在空气中干燥后，使用UV交联剂以120 mJ/cm2的剂量照射30秒以交联RNA。膜在室温下用含有5% BSA的TBST封闭1小时，然后在4°C下用抗ac4C抗体（1:500稀释）孵育过夜（Abcam）。用1×TBST洗涤三次后，膜用HRP偶联的抗兔二抗（1:5000稀释）孵育1小时。使用Immobilon Western Chemiluminescent HRP底物进行化学发光检测，并通过GelCap成像系统（Bio-Rad）可视化荧光信号。

**RNA-Seq和acRIP-Seq文库构建**
RNA-seq和acRIP-Seq由Cloudseq Biotech, Inc.（中国上海）完成。首先使用GenElute mRNA Miniprep Kit（Sigma–Aldrich）从总RNA中纯化poly(A) + RNA，然后使用Ribo-Zero kit（Illumina）进一步去除剩余的rRNA，准备文库。acRIP按照制造商的说明使用GenSeq ac4C RIP Kit进行。acRIP和输入样本均用于使用NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit（New England Biolabs）构建文库。使用Agilent 2100生物分析仪对文库进行验证，并在HiSeq 4000仪器（Illumina）上进行测序。

**测序数据分析**
使用fastp软件（版本0.23.0）对测序数据进行质量控制（QC）。在文库制备过程中，每个分子片段被随机标记一个唯一的标识符（UID）序列。原始数据经过QC处理后，使用kcUID软件将相似的读段聚类到相同的UID下，以实现错误校正和去除PCR重复序列。这确保了更准确的分子序列信息和表达量化。高质量的干净读段首先使用Bowtie2与目标物种的核糖体RNA（rRNA）数据库对齐，然后去除rRNA读段。剩余的读段随后使用HISAT2映射到参考基因组（https://solgenomics.net/ftp/tomato_genome/annotation/ITAG3.2release/）。使用exomePeak工具进行峰值调用以识别富集峰值。分析峰值的基因组分布，确定它们位于编码序列（CDS）、基因间区域或内含子区域，并对相关基因进行功能注释。使用Homer提取对应于峰值的序列区域，扫描共享基序，识别目标结合基序，并构建基序标志。使用DESeq2软件进行比较组间的差异峰值分析，阈值设置为输入数量≥2且p值<0.05。基因表达水平以RPKM表示。为了注释基因功能和途径，进行了GO和KEGG富集分析。最后，使用Prism 8软件完成数据可视化和展示。

**acRIP-RT-qPCR**
对于acRIP，将500 μg的总RNA与抗ac4C抗体（Abcam）或IgG抗体（Beyotime）在500 μL的IP缓冲液（150 mM NaCl，0.1% NP-40，10 mM Tris–HCl，pH 7.4）中孵育4小时，温度为4°C。混合物与30 μL的磁珠偶联的抗兔抗体（NEB）在4°C下孵育2小时，然后用1 ml的IP缓冲液洗涤六次。使用Trijol试剂提取RNA并通过RT-qPCR进行定量。

**RT-qPCR**
RT-qPCR使用2×ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）在Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR系统上进行。目标基因的相对表达水平使用2?ΔΔCt方法计算，而转录本的修饰水平使用% input方法评估。% input的计算公式为：$$\% Input=\frac{{2}^{({Ct}_{Input}-{Ct}_{RIP})}}{dilution factor}\times 100$$
CtInput和CtRIP分别代表输入样本和IP或IgG样本的Ct值，稀释因子为10。所有反应重复三次，结果表示为三个独立生物重复的平均值±标准差（SD）。所有用于RT-qPCR的引物列在补充材料2中。

**mRNA衰变分析**
番茄叶片用30 μM放线菌素D（Sigma–Aldrich）处理。使用Trijol从200毫克叶片组织中提取总RNA，在处理后0小时、4小时、8小时和12小时提取。通过逆转录合成cDNA，用于评估候选基因的稳定性。所有用于RT-qPCR的引物列在补充材料2中。