甘草提取物可调节免疫力、增强有益微生物群，并缓解PRRSV阳性猪的肺部病变：优化剂量及给药途径

《Animal Diseases》：Licorice extract modulates immunity, enhances beneficial microbiota, and alleviates lung pathology in PRRSV-positive pigs: optimizing the dose and administration route

　　摘要
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种主要的免疫抑制性病原体，与猪的呼吸道疾病复合体密切相关。甘草提取物（LE）具有抗炎、免疫调节和促进生长的作用。本研究评估了在PRRSV感染的保育猪中使用LE作为新型饲料添加剂的效果，并比较了通过饮食补充和饮用水补充的方法。共有264头断奶仔猪被分为8组：3个饮食补充组（低剂量、中剂量和高剂量：BLL、BLM和BLH），3个饮用水补充组（低剂量、中剂量和高剂量：WLL、WLM和WLH），1个农场对照组（Farm）和1个阴性对照组（CON）。与CON组相比，BLL和BLM组的日平均增重（ADG）分别增加了1.02倍和1.18倍（P < 0.001），饲料转化率（F/G）降低了3.58%和5.35%（P < 0.05），其中BLM组的效果最为显著。此外，与CON组相比，无论是通过哪种方式给予LE都能缓解咳嗽症状，在第3-4周期间，BLH、WLL和WLH组的咳嗽评分显著降低（P < 0.001）。另外，与CON组相比，BLM组的气管纤毛完整性有所提高（P < 0.1），肺部损伤评分也显著降低（P < 0.05）。虽然LE没有改变PRRSV特异性抗原或抗体的水平（P = 0.065），但它通过下调IL-1β和IL-6（P < 0.05）、上调IL-10（P < 0.05）以及增加IgA、IgG和IgM的水平（P < 0.05）显著调节了免疫反应。肠道宏基因组分析显示，LE显著增加了多种有益细菌的数量，并改变了肠道微生物群的结构。具体而言，LE上调了Anaeromassilibacillus sp. An172的数量，并逆转了抗生素引起的Bacteroides bouchesdurhonensis和Bacteroides sp. OF04-15BH数量的减少。这些发现表明，以2.6克/公斤的最佳剂量给予LE，是一种有前景的饲料添加剂，可通过免疫调节和肠道微生物群重塑来改善PRRSV感染猪的健康状况。

引言
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种具有包膜的单链正链RNA病毒，属于Arteriviridae科的Betaarterivirus属。在过去三十年中，由于其基因组的高度变异性，PRRSV给全球养猪业造成了巨大的经济损失，这种多样性推动了病毒的持续进化并导致了反复爆发（Hanada等人，2005；Yu等人，2022）。根据遗传特征，PRRSV可以分为两种基因型：PRRSV-1和PRRSV-2。在中国，超过80%的猪群对PRRSV呈血清阳性，主要为PRRSV-2基因型，现在已在23个省检测到PRRSV-1（Guo等人，2018；Sun等人，2023）。除了直接削弱免疫功能外，PRRSV感染还会导致呼吸道损伤，并使猪易于发生继发感染，从而形成猪的呼吸道疾病复合体（PRDC）（He等人，2024）。尽管主要的预防策略依赖于灭活疫苗和减毒活疫苗，但目前的疫苗无法提供足够的交叉保护 against 不同株的PRRSV。这一限制源于PRRSV引起的免疫抑制、病毒的持续进化以及野生型病毒株与疫苗病毒株之间的频繁重组，这对疫苗开发提出了重大挑战（Amona等人，2024；Lunney等人，2016；Parisio等人，2024）。因此，迫切需要开发新的策略来对抗PRRSV感染并减轻其对猪的影响。

甘草是一种传统药用植物，具有公认的抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒和免疫调节作用（Ding等人，2022；Ji等人，2024）。这种广泛的活性使其成为替代抗生素和对抗PRRSV的新策略的有希望的候选者。体外研究直接证明，甘草的主要成分如甘草多糖和甘草苷显著抑制了PRRSV的复制（Duan等人，2015；Yang等人，2023）。其在动物生产中的价值体现在提高了猪（You等人，2023；Zhu等人，2024）及其他物种（如肉鸡（Tang等人，2025b；Toson等人，2023）和肉牛（Liang等人，2024）的生长性能。其在呼吸健康方面的效果通过甘草酸得到证实——甘草酸是其主要活性成分，能够显著降低鸡由支原体感染引起的气囊病变评分和免疫器官损伤（Wang等人，2022）。此外，研究表明甘草提取物增加了肠道益生菌的数量（Li等人，2025；Song等人，2023）。肠道微生物群在维持肠道稳态中起着关键作用，并对宿主的整体健康产生深远影响（Wan等人，2023）。因此，甘草提取物在PRRSV阳性猪群中的应用具有多重靶点潜力，尽管其效果需要在体内得到验证。

本研究旨在确定甘草提取物的剂量和给药方式对商业生产环境中PRRSV阳性猪群的影响，从而为改善群体健康管理和减少抗生素依赖提供理论和技术基础。

结果
**LE补充剂提高了生长性能**
表1显示了保育猪的生长性能。BLL组的最终体重明显高于其他所有组（WLM、WLH、Farm和CON）（P < 0.001）。BLL和BLM组的日平均增重（ADG）显著高于WLM、WLH和CON组，其中BLM组的数值最高。与WLH组相比，所有组的饲料转化率（F/G）均显著降低（P < 0.05）。BLM组的F/G值最低，表明其饲料效率更高。

**LE补充剂减少了咳嗽症状**
咳嗽评分以两周为间隔进行统计（表2）。结果显示，在最初的两周内所有组的评分都较高，而在随后的四周内评分有所下降。在第1-2周和第5-6周之间，各组之间没有显著差异（P > 0.05）。然而，在第3-4周，与CON组相比，BLM、WLL和WLH组的咳嗽评分显著降低（P < 0.001），而与Farm组相比则没有显著差异（P > 0.05）。此外，通过饮用水和混合饲料给予LE组的咳嗽评分没有显著差异（P > 0.05）。

**LE补充剂减轻了气管和肺部损伤**
组织病理学评分标准见图1A-B。综合气管损伤评分在各组之间没有显著差异（P > 0.05）（图1C）。与CON组相比，Farm、BLH和BLM组的纤毛完整性评分有所改善（P = 0.065，P = 0.065，P = 0.055）（图1D）。肺部损伤的组织病理学评分显示，WLM组的评分最低，显著低于CON组（P < 0.05）（图1E）。

**PRRSV和PRRSV特异性抗体**
本实验使用了PRRSV阴性但抗体阳性的断奶仔猪。在第2、4和6周测量了PRRSV病毒载量（CT值）和抗体水平。所有组的抗体会随年龄增长而增加。在第4和6周，LE处理组的阳性率低于CON组，但组间差异无统计学意义（P > 0.05）（图2A）。PRRS抗体的分析显示，到第6周时，LE组的S/P值在0.4到2.0范围内的样本比例高于CON组。具体而言，BLH和WLH组的比例分别达到了80%和100%，但这些差异也无统计学意义（P > 0.05）（图2B）。通过饲料和饮用水给予LE的组之间的PRRSV病毒载量和抗体水平没有显著差异（P > 0.05）。

**LE补充剂增强了猪的抗炎活性**
与CON组相比，LE处理组在第2、4和6周的IL-6和IL-1β水平显著降低（P < 0.05），表明总体上存在剂量-反应负相关。相反，IL-10浓度显著增加（P < 0.05），表明总体上存在剂量-反应正相关（图3）。

**LE补充剂对血清细胞因子指标的影响**
图3A显示了IL-1β的检测结果。在第2和4周，高剂量组的IL-1β水平显著低于低剂量组（P < 0.05）。到第6周，BLM和WLH组在LE处理组中的IL-1β水平最低。通过饲料给予LE的组的IL-6水平低于通过饮用水给予LE的组。此外，与其他LE处理组相比，BLM、BLH和WLH组的IL-6水平也显著降低（P < 0.05）（图3B）。抗炎细胞因子IL-10在第2周和第4周显示出显著的剂量-反应关系（P < 0.05）（图3C）。然而，到第6周时，BLM组和BLH组之间的差异不再显著。在整个实验过程中，补充了LE的组的IL-10水平始终高于仅补充水的组。LE补充剂增强了猪的免疫力。在第6周测量了血清中的IgA、IgG和IgM水平（图4）。与CON组相比，大多数甘草提取物组的血清IgA浓度显著升高（P < 0.05），BLL组和WLL组除外（图4A）。与其它LE组相比，BLM组的IgA水平显著更高，但这种差异不显著（P > 0.05）。LE处理组的IgG和IgM水平显示出相似的反应模式（图4B和4C）。与CON组相比，除了BLL组外，所有LE组的血清IgG水平显著升高（P < 0.05），而除了WLH组外，所有LE组的血清IgM水平也显著升高（P < 0.05）。然而，不同LE处理组之间的这些免疫球蛋白水平没有显著差异（P > 0.05）。

不同浓度的LE和补充方法对血清免疫球蛋白（Ig）指标的影响：A 血清IgA浓度；B 血清IgG浓度；C 血清IgM浓度。箱形图显示了每个类别的中位数（中心线）、四分位距（箱体）和全范围（须状线）（n = 9）。通过单因素方差分析（one-way ANOVA）确定统计显著性。同一列中带有不同上标的值在P < 0.05时具有显著差异。IgA，免疫球蛋白A；IgG，免疫球蛋白G；IgM，免疫球蛋白M。

对BLM组（表现出最佳生产性能的组）以及CON组和Farm组的直肠内容物进行了宏基因组测序，以进行比较分析。高通量测序分析显示了所有样本中的188个不同的门类，这些门类被分为四个域：21个属于古菌门，148个属于细菌门，11个属于真核生物门，以及8个属于病毒门。值得注意的是，细菌序列占据了数据集的93.82%（图S1A）。前三大门类是杆菌门（Bacillota）、拟杆菌门（Bacteroidota）和螺旋体门（Spirochaetota）（图S1B）。分析杆菌门与拟杆菌门的比例发现三组之间没有显著差异（P > 0.05）（图S1C）。主要菌属包括普雷沃氏菌属（Prevotella）、塞加特氏菌属（Segatella）和拟杆菌属（Bacteroides）（图S1D）；在这些菌属中，塞加特氏菌属在Farm组中相对富集（图S1E）。通过Shannon指数（图5A）、Simpson指数（图5B）和Invsimpson指数（图5C）评估了细菌微生物群的α多样性。在所有组中，BLM组的这三个指数值最高。这一模式表明BLM组的物种多样性最高，而组间没有显著差异。基于Bray-Curtis相似性分析的主坐标分析（PCA）显示，PCA1和PCA2分别解释了微生物群落结构总变异的34.12%和19.81%（图5D）。CON组的样本与Farm组和BLM组的样本之间没有重叠，仅有少量GLM组与Farm组之间存在重叠。这些结果表明三个组之间的微生物组成存在显著差异。

为了阐明LE对猪肠道微生物群的调节作用，我们使用STAMP软件进行了数据标准化和特征细菌鉴定，并实施了严格的Bonferroni校正进行统计调整（图6A）。与CON组相比，中等剂量LE的饮食补充显著增加了某些已被证实具有或表现出产生短链脂肪酸（SCFA）潜力的细菌种群的丰度。具体来说，富集的菌属包括Faecalibacterium spp.（未分类的Faecalibacterium种，未培养的Faecalibacterium sp. Faecalibacterium prausnitzii）、Subdoligranulum variabile、Clostridium spp.（Clostridium sp. CAG632、Clostridium sp. CAG433）、Holdemanella spp.（Holdemanella porci、Holdemanella_biformis）、Hallella spp.（Hallella sp.，未分类的Hallella种）、Anaeromassilibacillus sp. An172、Alistipes onderdonkii和Dialister sp. CAG486（图6A）。与FA组相比，中等剂量LE的饮食补充增加了几种益生菌的丰度，包括Ligilactobacillus salivarius、Selenomonas ruminantium、Fibrobacter succinogenes、Butyrivibrio_crossotus、Phocaeicola barnesiae、Bacteroides salyersiae、Bacteroides togonis、Bacteroides bouchesdurhonensi、未分类的Butyricimonas种、Muribaculum sp. An28、Parabacteroides sp. An277和未分类的Phocaeicola种（图6A）。

基于STAMP分析在BLM组与CON组以及BLM组与Farm组之间识别出的差异细菌种类，使用Venn图分析了这些菌类在两组之间的重叠和特异性（图6B）。与CON组和Farm组相比，中等剂量LE的饮食补充显著增加了Anaeromassilibacillus sp. An172的丰度。此外，养猪场的常规健康管理显著减少了Bacteroides bouchesdurhonensis和Bacteroides sp. OF04-15BH的丰度，而这种调节趋势通过中等剂量LE的补充被显著逆转。

在动物饲养中，应用天然化合物和药用植物治疗疾病是一种新兴趋势，因为它们具有调节免疫功能的潜力（Azab等人，2016；Huang等人，2025），具有抗菌和抗病毒活性（El-Saadony等人，2025），并可以作为抗生素的替代品（Gautam等人，2023）。甘草是一种历史悠久的中国传统药物，也是兽医临床实践中最常用的药用植物之一。先前的报告表明，在饲料中添加2或3克/公斤的甘草提取物可以增强肉鸡雏鸡的生长性能和生理状况（Toson等人，2023）。来自甘草的多酚化合物和黄酮类物质可以增加断奶仔猪的营养吸收能力和抗氧化能力（Zhu等人，2024）。迄今为止，还没有关于在PRRSV阳性的猪群中LE补充的最佳剂量和给药途径的报道。

本研究表明，添加2.6克/公斤的甘草提取物可以显著增加PRRSV阳性和抗体阳性的猪群的日均增重并降低饲料转化率，最佳补充水平为饲料中的2.6克/公斤。甘草的主要提取物甘草酸的甜度是蔗糖的150倍（Nomura等人，2019）；当它与饲料混合时，可能会提高饲料的适口性。尽管通过饮用水给药是常见的方法，但其效果可能受到多种因素的影响。除了水质、药物的溶解度以及饮用水管道中的微生物和洗涤剂外（Vandael等人，2019），猪的行为和生理特征也可能起着关键作用。特别是，猪的天然打滚行为往往会浪费水，从而减少实际摄入量（Bracke，2011）。此外，猪有发达的嗅觉和味觉系统（Brunjes等人，2016）。与饲料补充不同，溶解在水中的LE保持其特有的气味和较差的适口性，这可能会减少水的摄入量。因此，中等和高剂量水补充组的猪可能经历了间歇性或低于预期的暴露。尽管如此，免疫参数可能仍然得到了调节，而与持续免疫调节相关的代谢成本可能部分抵消了生长益处（Kvidera等人，2017）。总体而言，这些因素可能有助于解释为什么饲料中LE补充的效果优于通过饮用水给药，以及为什么在饮用水组中观察到的剂量-反应模式不典型。

甘草补充剂缓解了咳嗽和呼吸系统损伤。咳嗽是一种生理反射，用于清除呼吸道中的刺激物和分泌物（Nasra和Belvisi，2009）。咳嗽可以是自愿发起的，但更常见的是作为呼吸道感染的症状而自发发生（Naqvi等人，2023）。因此，咳嗽评分在临床实践中被广泛用作评估猪群呼吸健康状况和监测呼吸道疾病发作和进展的重要指标（Witt等人，2023）。在本研究中，LE补充剂显著降低了猪的咳嗽指数和咳嗽评分，这一发现与甘草及其提取物在传统医学和现代药理学研究中的公认的止咳和祛痰效果一致（Kuang等人，2018；Saha等人，2011）。从机制上讲，甘草及其衍生物的止咳效果归因于调节外周ATP敏感钾通道和激活中枢5-羟色胺（serotonin）受体，从而抑制咳嗽反射的传递（Kuang等人，2018）；这些效果也可能涉及甘草的抗炎活性（Liu等人，2022）。多种疾病，包括PRRS，可导致呼吸系统损伤，从而导致生长迟缓和死亡率增加（Chae，2016）。许多研究报道甘草和甘草提取物可以减轻气管和肺部的炎症反应，减少气管损伤，并减轻肺部损伤（Chen等人，2022；Liu等人，2022；Wang等人，2022，2025）。我们的结果与这些先前的发现一致。其潜在机制可能与LE的抗炎、抗氧化和免疫调节活性有关：LE中的生物活性成分，如甘草酸，可以抑制NF-κB活性等炎症信号通路，并减少促炎细胞因子的释放（例如IL-1β、TNF-α和IL-6），从而缓解持续的肺部炎症和淋巴细胞浸润（Wang等人，2025）。此外，LE增强了身体的抗氧化能力，减轻了氧化应激对肺泡上皮细胞和血管内皮的损伤，从而减少了肺泡壁增厚和纤维素沉积的发生（Liu等人，2022；Gad El-Hak等人，2022）。

先前的研究表明，LE在体外和体内都能抑制猪流行性腹泻病毒（PRRSV），为其抗病毒潜力提供了支持证据（Bai等人，2024）。此外，各种甘草衍生物——包括甘草酸、甘草苷酸和甘草多糖——已被证明在体外能够显著抑制PRRSV（Duan等人，2015；Yang等人，2023；Zhang等人，2024）。然而，尽管有这些体外发现，但在体内给予甘草酸和马兜铃素复合物（4:1比例）并未产生实际的抗PRRSV效果（Zhang等人，2024）。我们的结果表明，LE在体内没有抗PRRSV效果。

PRRSV感染并破坏猪的肺泡巨噬细胞（PAMs），导致呼吸道炎症，影响黏液纤毛运输，最终破坏促炎和抗炎细胞因子之间的平衡（Tang等人，2025a）。值得注意的是，咳嗽诱导和气道敏感性与促炎细胞因子（特别是IFN-α和IL-1β）直接相关（Naqvi等人，2023）。甘草具有显著的抗炎作用，主要是通过下调关键的炎症介质（IL-1β、IL-6、TNF-α和COX-2）和减轻氧化应激来实现的，从而缓解炎症相关疾病的进展（Yang等人，2017）。我们的发现进一步证实了LE在PRRSV感染猪中的抗炎作用。IL-1β是一种经典的促炎细胞因子，在猪呼吸道疾病的发病机制中通过促进炎症细胞的浸润和激活来介导炎症损伤（Opriessnig等人，2011）。相比之下，IL-10通过抑制巨噬细胞和树突状细胞的抗原呈递功能来减轻组织损伤，从而减少促炎因子的释放（Liu等人，2018）。

血清中的IgA、IgG和IgM是参与体液免疫和细胞免疫的免疫活性分子，它们的浓度与免疫状态和整体健康状况呈正相关（Jiang等人，2022）。甘草多糖逆转了环磷酰胺引起的免疫抑制，分别将肠道IgG和sIgA水平提高了1.11倍和1.31倍，同时显著保持了免疫细胞的稳态（Song等人，2023）。甘草酸的口服给药在口蹄疫疫苗接种后显著提高了小鼠和猪的血清sIgA水平（Shin等人，2025年）。此外，甘草提取物与嗜酸乳杆菌的组合被证明能够显著提高肉鸡的血清IgA和IgG水平（Lu等人，2025年）。总体而言，这些发现强调了甘草衍生化合物对适应性免疫的免疫刺激作用。PRRSV是一种典型的免疫抑制病毒，在PRRSV感染期间，先天性和适应性免疫反应会受损，使受感染的动物容易受到其他病原体的二次或共感染（Li等人，2023年）。与先前的研究结果一致，当前的研究表明，甘草提取物（LE）提高PRRSV阳性猪的血清IgA、IgG和IgM水平的能力可能有助于宿主对抗其他病原体。甘草提取物的补充改变了肠道微生物群的结构。哺乳动物的肠道微生物群在宿主体内发挥着许多有益作用，包括碳水化合物的消化和发酵、维生素的生成、维持肠绒毛功能、免疫调节以及对抗病原菌的保护（Gresse等人，2017年）。然而，在现代养猪生产中，断奶、感染、环境变化和抗生素的过度使用等挑战会共同引发肠道菌群失调（Gresse等人，2017年）。这种紊乱会对生长性能产生负面影响。饮食中添加甘草或其提取物已被证明可以增加有益肠道细菌的数量，特别是那些产生短链脂肪酸（SCFAs）的细菌，从而提高SCFAs的浓度（Song等人，2023年；Wu等人，2023年）。在这项研究中，我们报告说饮食中添加甘草提取物显著增加了多种有益细菌的数量。值得注意的是，与对照组（CON）和农场组（Farm）相比，甘草提取物的补充显著上调了Anaeromassilibacillus sp. An172的数量。Anaeromassilibacillus是一种已知的SCFA生产菌，已被证明可以保护小鼠免受肥胖的影响，并且在表现出改善肠道健康的瘦肉型肉鸡中显著富集（Jing等人，2021年；Treichel等人，2019年）。因此，甘草提取物诱导的Anaeromassilibacillus sp. An172的增加可能有助于提高仔猪的肠道健康和瘦肉型生产。迄今为止，Bacteroides bouchesdurhonensis的研究较少，尽管它显示出发酵各种植物多糖和膳食纤维的潜力（Ndongo等人，2019年）。Bacteroides sp. OF04-15BH在高体重滇南小耳猪中的数量增加，并且与乙酸水平呈正相关，表明其具有益生菌的作用（Lan等人，2023年）。有趣的是，常规的药物预防措施观察到减少了Bacteroides bouchesdurhonensis和Bacteroides sp. OF04-15BH的数量，而甘草提取物的补充则显示出逆转这种变化的潜力。新兴的证据强调了肠道疾病和肺部疾病之间的关联。肠道微生物组的变化可能导致免疫系统的失调，这可能促进肺部疾病的发展，包括哮喘和慢性阻塞性肺病（COPD）等疾病（Eladham等人，2024年）。已经证明有几种因素在肠道-肺轴上发挥其调节功能，包括细菌来源的成分和代谢降解产物的系统传播，其中SCFAs是最显著的免疫调节代谢物（Tulic等人，2016年）。SCFAs已成为肠道和周围组织中的关键信号分子，用于限制炎症并指导保护性反应，特别是在肠道-肺轴上。通过抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性并激活mTOR-S6K信号通路，SCFAs促进调节性T细胞（Tregs）、Th1细胞和Th17细胞的分化。此外，作为脂肪酸氧化的底物，SCFAs在流感感染期间增加了CD8? T细胞的代谢活性和功能，从而有助于改善肺部免疫反应（Dang和Marsland，2019年）。在这方面，植物提取物具有优势。例如，据报道草药可以通过恢复肠道微生物群来缓解肺炎。具体来说，Gegen Qinlian煎剂（葛根、黄芩、黄连和甘草）已被证明可以缓解流感病毒引起的胃肠道症状，通过增加有益细菌来调节肠道微生物群，恢复肠黏膜免疫功能，并抑制肠系膜淋巴结和血清中的炎症因子表达，从而减少肺部炎症（Deng等人，2021年）。有趣的是，我们的实验中也观察到了类似的现象。除了甘草提取物通过抑制肺部炎症途径来缓解肺损伤的报告机制（Zhou等人，2023年）之外，它通过调节肠道微生物群来调节肺功能的潜在作用也值得进一步研究。结论：对于PRRSV感染的猪群来说，以2.6克/千克的最佳剂量进行饮食甘草提取物补充是最佳的给药途径和剂量，可以显著改善生长性能，增强呼吸健康，调节全身免疫，并增加生长猪的有益肠道微生物群。特别是，甘草提取物的补充逆转了抗生素引起的仔猪有益肠道细菌数量的减少，为开发替代抗生素提供了新的证据。本研究的局限性包括缺乏详细的机制分析，需要在更广泛的背景下进行进一步验证。

**甘草提取物的来源**
甘草提取物（批次号20230501）来自中国洛阳Lansealy公司，其主要成分包括蛋白质（7.0%）、水分（5.0%）、灰分（9.0%）、总黄酮类（4.0%）、甘草酸（3.0%）、总皂苷（6.0%）、总糖（25.0%）、液甘草素（0.3%）、相关物质A（20.0%）、相关物质B（2.0%）以及其他成分（18.7%）。1克甘草提取物完全可溶于10毫升自来水，并在24小时内保持稳定，没有观察到沉淀或性质变化。

**动物实验和饮食**
共选择了264只断奶后的仔猪（杜洛克×兰德拉斯×约克夏杂交品种，体重6.51±0.06千克，28天大），随机分配到八个组（每组三个重复），并在一个商业PRRSV阳性养猪场饲养42天。这些组包括三个甘草提取物补充组（BLL：1.3克/千克；BLM：2.6克/千克；BLH：5.2克/千克）、三个水溶性甘草提取物补充组（WLL：0.43克/升；WLM：0.86克/升；WLH：1.72克/升）、一个农场对照组（常规农场管理）和一个阴性对照组（CON）。农场组的用药方案详见补充表1。维持标准的住房、温度和湿度条件，并记录每日饲料摄入量和死亡/淘汰记录；在试验结束时测量空腹体重。

**样本收集**
在0天、14天、28天和42天时从前腔静脉血液样本中分离血清，用于检测PRRSV、抗体测量和免疫指数分析。在70天龄时，每栏平均体重的一只仔猪被安乐死；气管中部和肺组织用4%甲醛固定，制备HE染色组织切片，收集直肠内容物用于肠道微生物组宏基因组测序。

**咳嗽评分**
两名兽医在试验期间每天两次（08:00，17:00）根据标准评分协议独立评估每个栏的咳嗽情况（Witt等人，2023年）。评分者在整个实验过程中对治疗分配不知情。详细的评分标准见补充表2。

**PRRSV和PRRSV特异性抗体的检测**
从血清中提取病毒RNA，并使用RealPCR试剂盒量化PRRSV载量；使用IDEXX试剂盒检测PRRSV特异性抗体。CT值≤30表示PRRSV阳性，S/P值≥0.4表示抗体阳性。

**血清分析**
根据制造商的方案，使用商业试剂盒（南京建城生物工程研究所）三次测量免疫指标IgA（H108-1-2）、IgG（H106-1-1）、IgM（H109-1-1）、IL-1β（H002-1-2）、IL-6（H007-1-2）和IL-10（H009-1-2）。

**组织学分析**
准备气管和肺组织的5微米厚石蜡切片，进行HE染色，并在光学显微镜下根据病变的严重程度和分布进行病理评分。为了减少偏见，在数据分析完成之前，评分者对组别分配不知情。详细的评分标准见补充表3。

**肠道微生物组的宏基因组测序**
使用粪便DNA试剂盒（TIANGEN Biotech Co., Ltd., 北京）从直肠内容物中提取总DNA，并验证DNA质量。在Illumina PE150平台上进行宏基因组测序，获得的读段经过de novo组装（Li等人，2016年）。基因丰度进行了标准化处理，基因序列使用MEGAN6（Potter等人，2018年）在多个分类水平上进行了注释。

**统计分析**
使用SPSS 26.0进行单因素方差分析（Liang等人，2025年）。统计显著性设定为P<0.05，高度显著性为P<0.01，趋势为0.05≤P≤0.10。所有结果均以平均值和平均值的標准误差（SEM）表示。通过计算Shannon指数、Simpson指数和invsimpson指数评估α多样性。通过主成分分析（PCA）评估β多样性。