一种用于稳定百里香二萜类化合物的方法及其在糖尿病肾病中的治疗潜力

《Chinese Medicine》：A stabilized enrichment method for rosemary diterpenoids and their therapeutic potential in diabetic kidney disease

　　**摘要**

**背景**
作为传统药用草本植物，迷迭香叶在糖尿病肾病（DKD）的治疗中显示出潜力。然而，其发挥抗DKD作用的生物活性化合物尚未被鉴定出来，其主要植物化学物质的不稳定性限制了其实际应用。

**方法**
本研究调查了迷迭香叶中的活性成分，并使用UPLC-Q/TOF–MS/MS技术对其降解途径进行了表征。通过体外DKD模型评估了四种溶剂萃取的组分，以确定主要的抗DKD成分。随后开发了一种靶向富集方法来分离这些生物活性化合物。最后，在C57BL/6J小鼠中建立了DKD模型，通过高脂肪饮食结合链脲佐菌素注射来评估富集提取物的治疗效果。进一步研究了这些主要成分的药代动力学特征。

**结果**
共鉴定出38种化学成分，其中二萜类化合物被确定为主要的抗DKD成分。鉴于它们对氧化降解的高度敏感性，开发了一种基于水和乙醇的新型总二萜类（TD）富集策略。维生素C作为稳定剂使用了，提高了TD的稳定性，使得TD的提取收率为40.12%，二萜类含量为81.80%。体内研究表明，TD能够减轻DKD小鼠的肾损伤，改善葡萄糖和脂质代谢异常，并降低肾氧化应激。体内吸收实验表明TD也具有良好的生物利用度。

**结论**
本研究提供了一种有效的TD富集方法，并证明了TD的肾脏保护作用。这些发现为迷迭香叶的更广泛使用以及基于天然产物的DKD疗法的开发提供了新的见解。

**图解摘要**
（此处可加入图像的替代说明或使用AI生成的文本。）

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**引言**
迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）原产于地中海地区。《本草纲目》将迷迭香归类为具有辛辣味道、温性且无毒的传统中药。传统上，迷迭香被用作驱风剂、抗痉挛剂、止痛剂和促进头发生长。最新研究表明，迷迭香具有多种潜在的药理作用，包括抗菌、抗抑郁、抗肿瘤、抗炎、降糖和降脂作用[1,2,3,4,5]。迷迭香的药理活性来源于其丰富的化学成分，如酚酸、二萜类、三萜类和黄酮类[6,7]。然而，关键活性成分（尤其是肉桂酸）对氧气极其敏感[8]。传统的富集方法（如索氏提取和浸泡法）容易导致这些成分的氧化降解。迷迭香叶提取物的这种固有不稳定性限制了其更广泛的工业应用。因此，在富集过程中提高这些生物活性成分的稳定性是实现迷迭香全面应用的主要挑战。为应对这些挑战，本研究系统地研究了迷迭香叶的药效学基础，并建立了一种新的富集方法。采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q/TOF–MS）技术表征了化学成分，发现二萜类是发挥抗DKD作用的主要活性成分。此外，对二萜类降解动力学的研究及其降解途径的阐明为总二萜类（TD）的富集方法开发提供了基础。新方法使用水和乙醇作为溶剂，并以维生素C作为稳定剂。重要的是，在最终的富集步骤中完全去除了维生素C。该方法有效抑制了TD的降解，获得了二萜类含量超过80%的提取物。体内研究表明，TD改善了DKD小鼠的葡萄糖和脂质代谢紊乱，减轻了肾损伤，并减轻了肾氧化应激。药代动力学研究还证明了TD具有良好的生物利用度。这项工作为迷迭香二萜类的生产提供了新策略，从而支持了迷迭香的进一步应用，并促进了针对DKD的潜在药物的发展。

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**材料与方法**
甲醇、甲酸和乙腈购自Sigma-Aldrich（中国上海）。维生素C、乙醇和磷酸来自中国上海的Sinopharm集团化学试剂公司。Milli-Q水使用Milli-Q水纯化系统制备（美国）。肉桂酚、迷迭香醇、迷迭香酸、homoplantaginin、cirsimaritin和12-甲氧基肉桂酸的参考标准品购自中国成都的Must Biotechnology公司。芹菜素、hispidulin、epirosmanol、genkwanin、pectolinarigenin、bergenin和betulinic酸购自中国成都的Push Biotechnology公司。肉桂酸购自中国成都的Pufei De Biotech公司。

**提取与纯化过程**
迷迭香叶从中国亳州的中药市场购买后，储存在26°C ± 5°C的黑暗环境中24小时。收集的样品由中国药科大学的李平教授鉴定。干燥的迷迭香叶使用95%乙醇在90°C下进行两轮提取。所得滤液浓缩后冻干，得到浓缩残渣。接着，将粗提取物（组分1）依次用水（组分2）和环己烷（组分3）进行分离，剩余的残渣为组分4。

**二萜类提取与分析**
进行了单因素实验，以评估各种参数对TD提取效率的影响，包括提取方法、乙醇浓度、固液比、温度和回流时间等。通过测量提取物中的二萜类含量来确定最佳提取条件。

**优化提取过程**
为了优化多个因素并减少实验次数，我们采用了正交实验来确定去除酚酸的关键因素。随后进行了L9(3^3)正交实验，以优化关键因素，包括洗涤方式（A）、固液比（B）和洗涤循环次数（C）（见表S1和S2）。

**三萜类提取**
将提取物稀释后用乙醇过滤，以选择性分离三萜类。评估了乙醇浓度和固液比，测量了肉桂酸的产量和含量以及betulinic酸的面积，以确定最佳条件。

**定量分析**
将提取物和参考标准品稀释至最终浓度为0.1 mg/mL。离心后，上清液在4°C下保存作为测试溶液。使用搭载6530 Q-TOF系统的Agilent 1290 Infinity UPLC系统进行定性分析（美国圣克拉拉）。UPLC方法：色谱分离采用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm），梯度洗脱条件如下：溶剂A（0.1%甲酸水）和溶剂B（乙腈）的流速分别为0 min, 5%; 2 min, 15%; 13 min, 60%; 18 min, 60%; 19 min, 80%; 27 min, 95%; 27.5 min, 95%; 28.5 min, 5%; 33 min, 5%。流速设为0.4 mL/min，注射体积为1 μL，柱温保持在30°C。质谱检测采用Dual AJS ESI源，在负离子模式下进行：毛细管电压3500 V；碎片化电压120 V；雾化气体压力35 psi；干燥气体（N?）温度350°C；干燥气体流速10 L/min；鞘气温度350°C。碰撞能量设定为20 V和40 V。质谱扫描范围m/z 100–1500，自动MS/MS模式覆盖m/z 100–1000。

**定量分析**
将10.00 mg提取物溶解在25 mL甲醇中，离心后储存在4°C下进行后续分析。参考标准品在甲醇中的浓度为1 mg/mL，然后稀释至适当的浓度范围（见表S4）。使用配备二极管阵列检测器的Agilent 1290 Infinity UPLC系统进行定量分析，注射体积为2 μL，检测波长为284 nm。定量分析基于标准曲线方法，使用Microsoft Excel进行计算。

**提取收率**
TD的提取收率通过测量肉桂酸和肉桂酚的含量来确定，计算公式如下：
$$
{\text{X (%)} = \frac{M \times C}{M_0 \times C_0} \times 100
$$
其中X表示提取收率，M（g）是提取的TD质量，C（%）是TD中肉桂酸和肉桂酚的含量，M0（g）是干燥迷迭香的质量，C0（%）是迷迭香叶中肉桂酸和肉桂酚的含量。

**降解动力学**
不同加热条件下肉桂酸热降解动力学的详细方法见补充材料。

**稳定性研究**
研究了磷酸、甲酸和维生素C对TD溶液中肉桂酸稳定性的影响。进一步优化了维生素C的浓度。选择维生素C作为稳定剂后，在4°C、25°C和50°C下评估了TD溶液的稳定性，通过测量肉桂酸的含量进行评估。为了研究维生素C与二萜类之间的潜在化学相互作用，对含有或不含维生素C的TD进行了30天储存后的UPLC-Q/TOF–MS分析。

**细胞培养**
HK2细胞在含有10% FBS、100 μg/mL链霉素和100 μg/mL青霉素的MEM培养基中，在37°C和5% CO2条件下培养。细胞在高葡萄糖（30 mM）和棕榈酸（200 μM）存在下培养24小时，同时也可以加入提取物（8 μg/mL）。

**细胞活力检测**
为了评估提取物对HK2细胞活力的影响，将细胞接种在96孔板中（1 × 10^4细胞），培养24小时。随后用不同浓度的提取物处理细胞。再培养24小时后，弃去培养基，向96孔板中加入100 μL（90 μL细胞培养基 + 10 μL CCK8）的CCK8混合溶液（Abbkine，武汉）。继续培养0.5小时，通过测量450 nm处的吸光度来确定细胞活力。

**甘油三酯和胆固醇测定**
为了测量细胞内总甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC），将细胞培养在6孔板中，然后用1 mL PBS收获。将100 μL细胞悬液转移至新试管中，4°C下1000 × g离心5分钟。随后将细胞沉淀物溶解在裂解缓冲液中（Beyotime，上海），用于蛋白质定量（BCA蛋白测定试剂盒，南京建城）。剩余的细胞悬液用于脂质提取。4°C下1000 × g离心5分钟后，将细胞沉淀物与200 μL氯仿/甲醇（2:1，v/v）混合在振荡器中震荡3小时。向每个反应管中加入100 μL 0.1 M NaCl溶液，充分混合后离心3700 rpm 10分钟，收集下层有机相并蒸发至干燥。干燥后的残留物被重新悬浮在10 μL的1% Triton X-100和无水乙醇中，然后使用商业检测试剂盒（Jiancheng，南京，中国）根据制造商的说明测定TG和TC的浓度。RT–qPCR Total RNA使用Trizol试剂（Vazyme，中国）从样本中分离出来，并使用HiScript Reverse Transcriptase试剂盒（Vazyme，中国）反转录成cDNA。使用SYBR Green Master Mix（Vazyme，中国）进行定量实时PCR，并使用Light-Cycler 480（Roche Diagnostics GmbH）进行检测。本研究中使用的引物序列列在表S7中。

动物实验所有动物实验均得到了中国药科大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（编号202409032），并按照美国国立卫生研究院的实验室动物护理和使用指南（编号8023）进行。动物在标准条件下饲养（22±2°C，12小时光照/黑暗周期），可以自由取食和饮水。根据体重减轻和小鼠的日常活动严格应用人道终点。使用随机数生成器将动物随机分配到实验组中，以减少选择偏差。由于干预的性质，药物给药过程未对组别分配进行盲法处理。然而，结果评估和数据分析是由对组别分配不知情的研究人员进行的。

TD对DKD小鼠模型的体内治疗效果C57BL/6J小鼠被随机分为标准饲料组（Jiangsu synergetic biology，1,010,039）和高脂饲料组（HFD，60%脂肪，Research Diets，D12492）。在分别暴露于这些饲料4周后，HFD组的小鼠在连续禁食5天后通过腹腔注射40 mg/kg的streptozocin（STZ，Sigma-Aldrich）溶液。标准饲料组仅接受溶剂。7天后，空腹血糖水平≥16.7 mM的HFD/STZ小鼠被成功诱导。小鼠被随机分成5组，每组10只：（i）NC组（用0.5% CMC-Na处理的正常小鼠）；（ii）DKD组（用0.5% CMC-Na处理的DKD小鼠）；（iii）DKD+Dap组（用dapagliflozin处理的DKD小鼠）；（iv）DKD+TDL组（用25 mg/kg TD处理的DKD小鼠）；（v）DKD+TDH组（用50 mg/kg TD处理的DKD小鼠）。治疗每天进行一次，持续10周。TD的剂量是根据之前的研究[4]选定的。dapagliflozin的剂量是通过体表面积标准化方法（Meeh-Rubner公式）计算的。在干预结束时，使用血糖仪（Sinocare，中国）测量空腹血糖水平。收集24小时尿液并离心，然后使用相应的检测试剂盒（Jiancheng，南京，中国）分析尿液中的白蛋白、尿微量白蛋白和尿肌酐。提取血清样本，使用相应的检测试剂盒（Jiancheng，南京，中国）检测肌酐、血液尿素氮（BUN）、TG、TC、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的水平。使用Bioswamp（武汉，中国）的检测试剂盒量化malondialdehyde（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）。

TD的体内吸收特性实验程序，包括动物分组、给药、血浆样本的制备、血浆样本的分析和分析方法验证，详细内容在补充材料中有描述。

TD的急性毒性从Charles River Laboratory（平湖，中国）购买了Balb/c小鼠（8周龄，半雄半雌）。小鼠被随机分为6组（每组10只；5只雄性和5只雌性）。小鼠分组和给药剂量的详细信息见表S14。小鼠接受单次口服TD，并进行14天的观察。第14天，所有存活的小鼠被安乐死，并收集主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和小肠）进行组织学分析，使用hematoxylin和eosin（H&E）染色。

胰岛素耐受性和口服葡萄糖耐受性测试在干预结束时进行了胰岛素耐受性测试（ITT）。在腹腔注射0.75 IU/kg胰岛素后，分别在0、30、60、90和120分钟时测量血糖水平。3天后，进行了口服葡萄糖耐受性测试（OGTT）。在口服2 g/kg葡萄糖后，分别在0、15、30、60和120分钟测量血糖水平。计算曲线下面积（AUC）以量化ITT和OGTT的结果。

病理学检查在干预结束时取出肾脏，并用预冷的盐水冲洗。将一半的肾脏固定在4%的甲醛溶液中48小时，然后包埋在石蜡中。制备组织切片，并使用H&E、 periodic acid–Schiff（PAS）和Masson trichrome染色进行病理评估。图像使用OLYMPUS IX73显微镜（东京，日本）捕获。

Western blot小鼠肾脏组织在RIPA（Beyotime，上海，中国）缓冲液中加入蛋白酶抑制剂（Roche，上海，中国）在冰上裂解，然后在4°C下以12,000 g离心10分钟以获得上清液。使用蛋白质定量试剂盒（BCA protein assay kit，Jiancheng，南京，中国）测定蛋白质浓度。将20 μg/条的蛋白质在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶（Servicebio，武汉，中国）上电泳，然后转移到0.22 μm的NC膜（Millipore，美国）上，然后用5%的牛血清白蛋白封闭1小时。用TBST洗涤三次后，所有膜与以下一级抗体一起在室温下孵育1小时：Nrf2（1:1000，Cell signaling Technology，12,721），HO-1（1:5000，proteintech，10,701–1-AP）和β-actin（1:1000，proteintech，66,009–1-Ig）。然后在与二级抗体一起在室温下孵育1小时。使用ECL试剂盒（Abbkine，武汉，中国）进行定量。

所有数据均表示为平均值±SEM。组间比较使用单因素方差分析（Dunnett’s posttest）进行。至少进行了3次独立实验。统计分析使用GraphPad Prism 10.3.1进行。P < 0.05的差异被认为具有统计学意义。

迷迭香叶提取物的化学表征通过UPLC-Q/TOF–MS/MS分析了95%乙醇提取物的迷迭香叶的化学成分，根据保留时间、分子量、碎片离子和与参考标准的比较，鉴定出38种化合物。图1A显示了负模式下典型的总离子色谱图（TIC）。如表1所总结，提取物主要由酚酸、黄酮类、二萜类和三萜类组成。

图1 这张图像的替代文本可能是使用AI生成的。

UPLC-Q/TOF–MS/MS分析迷迭香叶提取物。A、B 负模式下的总离子色谱图（TIC）。（A）迷迭香叶95%乙醇提取物；对应的化合物编号见表1。（B）室温下储存7天后的迷迭香叶95%乙醇提取物。#表示可降解化合物，*表示表S8中显示的降解产物。C–F 分别是（C）迷迭香酸；（D）肉桂酸；（E）表儿茶素；（F）芹菜素的推荐裂解途径。

表1 迷迭香叶提取物的峰归属

表1 中鉴定的酚酸化合物2、3、4、6、8和12分别被鉴定为丁香酸、咖啡酸3-葡萄糖苷、咖啡酸3-葡萄糖苷异构体、咖啡酸、迷迭香酸3-O-葡萄糖苷和迷迭香酸。迷迭香酸的推荐裂解途径显示在图1C中。迷迭香酸产生了m/z 359.0769的[M-H]?离子。这一结果表明其裂解模式对应于酯键的断裂，产生了m/z 179.0350和m/z 197.0448的特征碎片离子。m/z 161.0239的离子是由m/z 197.0448片段丢失一个H2O分子产生的。

在迷迭香叶中鉴定出13种二萜类化合物。化合物26（[M-H]?，m/z 329.1739）和化合物31（[M-H]?，m/z 331.1922）分别被鉴定为肉桂醇和肉桂酸。肉桂酸产生了m/z 287.2001的主要碎片离子，对应于CO2片段的丢失。m/z 244.1454的碎片离子是由于[M-H-CO2]?离子进一步丢失了CH(CH3)2片段。肉桂醇的类似裂解模式也观察到了，它产生了m/z 285.1848的主要碎片离子，是由于失去了CO2。表儿茶素、rosmanol和epirosmanol是异构体，它们产生了m/z 345的[M-H]?离子，并且具有相同的裂解模式，特征是m/z 301和m/z 283处的两个突出离子。通过与其他参考标准的保留时间比较进一步确认了这些化合物。

在迷迭香叶中鉴定出12种黄酮类化合物，其中大多数含有2-苯基-5-羟基色酮骨架，例如homoplantaginin和apigenin。homoplantaginin产生了m/z 461.1057的主要[M-H]?离子，其碎片离子分别在m/z 299.0532和283.0228处。化合物14通过与参考标准的比较被鉴定为apigenin。前体离子（[M-H]?，m/z 269.0438）失去了CO2，产生了m/z 225.0553的碎片离子。进一步的裂解产生了m/z 117.0345的离子，这是通过连续丢失C3H2和两个C2H2单位实现的。

二萜类化合物减轻了HG/PA压力下HK2细胞的脂质积累和纤维化据报道，迷迭香具有对抗DKD的治疗潜力。为了鉴定其活性成分，通过溶剂提取获得了四个组分（Fr.1-Fr.4），并随后使用UPLC-Q/TOF-MS/MS进行了表征（图2A）。结果显示Fr.1是粗提取物，而Fr.2和Fr.3主要含有酚酸和二萜类化合物。Fr.4主要含有三萜类和二萜类化合物（图S1A）。各种提取物对细胞活力的影响显示在图S1B–E中。

图2 这张图像的替代文本可能是使用AI生成的。

图2 主要抗DKD成分的筛选。A 不同迷迭香叶组分的富集工作流程。B–G HK2细胞在添加或不添加不同组分的情况下，用HG和PA刺激24小时。总TG（B）和TC（C）含量；通过RT–qPCR测定KIM-1（D）、FN（E）、α-SMA（F）和COL1A1（G）的mRNA表达水平。（n=3）。*P < 0.05，**/##P < 0.01，***/###P < 0.001，****/####P < 0.0001。数据以平均值±SEM显示。统计分析使用单因素方差分析进行，#表示与NC组的比较，*表示与模型组的比较。

肾小管上皮细胞中的脂质积累是DKD的标志[9]。为了评估迷迭香组分对脂质积累的影响，我们评估了暴露于高葡萄糖（HG）和棕榈酸（PA）的HK2细胞中的TG和TC水平。结果显示，所有组分都减少了脂质积累，其中Fr.3在减少TG和TC水平方面显示出最显著的效果（图2B，C）。

为了研究提取组分是否能够逆转肾损伤和肾纤维化，评估了关键生物标志物。如图2D所示，KIM-1（肾损伤的生物标志物）在Fr.3处理后显著下调。此外，Fr.3处理后HK2细胞中关键的纤维化相关基因（FN、α-SMA和COL1A1）的表达也下调（图2E-G），表明二萜类是针对DKD的主要活性成分。

迷迭香二萜类的富集使用95%乙醇提取迷迭香二萜类，然后用水洗涤并用40%乙醇纯化。富集过程显示在图3A中。相应的色谱图显示在图3M中。

图3 这张图像的替代文本可能是使用AI生成的。

TD的富集。A TD的富集工作流程。B–G 不同变量对TD提取的影响。（B）提取方法；（C）乙醇浓度；（D）固液比；（E）加热温度；（F）加热回流时间。（G）循环次数。H–L 不同变量对TD纯化效率的影响。对于去除酚酸，（H）洗涤方法；（I）固液比；（J）循环次数。对于去除三萜类，K 乙醇浓度；L 固液比。m/z负模式下的总离子色谱图：（1）迷迭香叶95%乙醇提取物；（2）水洗涤后加入维生素C的提取物；（3）TD的最终产物。数据以平均值±SEM显示。统计分析使用单因素方差分析进行。

进行单因素实验以获得最大的二萜类产量。使用迷迭香叶中代表性的二萜类化合物肉桂醇和肉桂酸的含量作为评估提取效率的标准。单因素提取优化实验中不同变量的比较显示在表S5中。比较评估显示，热回流比冷浸法和超声波提取具有更高的效率（图3B）。这种提取性能可能来自加热和溶剂循环的协同作用。升高的温度加速了分子运动，促进了目标化合物向溶剂的扩散。同时，连续的溶剂循环促进了目标化合物与溶剂之间的反复相互作用。热回流被选为后续优化的首选方法。乙醇浓度与提取效率呈正相关，这可能是由于二萜类化合物的亲脂性。较高的乙醇浓度可以提高其溶解度，从而增加提取产量。在此研究中，选择95%（体积/体积）乙醇作为最佳溶剂进行进一步研究（图3C）。由于溶剂和目标化合物之间的浓度梯度，提取效率随着固液比的增加而提高，直到达到质量传递平衡。如图3D所示，二萜类化合物的提取效率随着固液比的增加而提高，在1:10（克/毫升）时达到饱和值33.4毫克/克。进一步增加固液比并不会导致更高含量，因此选择1:10（克/毫升）作为最佳比例。在80°C、90°C和100°C的提取温度下，提取效率没有显著差异。因此，选择80°C进行提取（图3E）。热回流时间和循环次数影响了提取效率，在1小时的热回流和3次提取循环后，产量达到最大（图3F和G）。总之，这些结果表明TD的最佳提取条件如下：提取方法为热回流；溶剂为95%（体积/体积）乙醇；固液比为1:10（克/毫升）；温度为80°C；热回流时间为1小时；提取循环次数为3次。

纯化
如表1所述，迷迭香叶提取物含有酚酸、黄酮类、二萜类和三萜类化合物。这些化合物在C18柱上的洗脱顺序表明极性逐渐降低[10]。

（1）酚酸的去除
酚酸良好的水溶性使其可以通过水洗法选择性地分离出来。作为代表性的酚酸，迷迭香酸在洗涤溶液中的峰面积被确定为最佳条件的标准。洗涤方法被认为是影响去除效率的关键步骤。如图3H所示，超声波处理比研磨和振荡具有更高的酚酸去除效率。而且，超声频率的变化对去除效率的影响可以忽略不计。此外，固液比也影响了酚酸的去除效率。如图3I所示，迷迭香酸含量最初增加，在1:4（重量/体积）的比率时达到饱和。洗涤循环次数的增加也观察到了类似的趋势，迷迭香酸含量在一定范围内增加后趋于平稳（图3J）。随后，基于单因素实验进行了正交实验，重点关注三个因素：洗涤方法（A）、固液比（B）和洗涤循环次数（C），每个因素设置三个水平。根据表S3中的方差分析结果，洗涤方法对酚酸去除效果有显著影响。表S2中的范围分析（r）表明，影响酚酸去除效率的因素顺序为A> C> B。因此，最佳因素组合确定为“A1B2C2”，即超声波处理、固液比1:3和三次洗涤循环。

（2）三萜类的去除
三萜类的极性低于二萜类，可以通过乙醇提取和过滤选择性地分离出来。在图3K中，分别测量了肉桂酸和贝氏木脂素的峰面积，作为二萜类和三萜类的代表成分。随着乙醇浓度从20%增加到50%，二萜类的提取效率稳步提高。相比之下，当乙醇浓度超过40%时，三萜类的提取效率急剧增加。因此，选择40%乙醇作为去除三萜类的最佳溶剂。通过评估最终产品中三萜类的产量和含量来确定最佳固液比。3:1（克/毫升）的比率被确定为适合去除三萜类的条件（图3L）。基于此，三萜类被选择性地提取到40%乙醇相中，而三萜类则留在残渣中并通过过滤分离。乙醇通过旋转蒸发去除。浓缩后的溶液再次过滤，所得残渣经真空干燥得到TD提取物。

迷迭香叶提取物的降解过程
在富集过程中，迷迭香叶乙醇提取物的颜色从绿色明显变为橙色（图4A和B）。这种颜色变化归因于主要成分的降解。

图4
迷迭香叶提取物的降解过程。A. 迷迭香叶提取物的照片。B. 在室温下储存5小时后的迷迭香叶提取物照片。C. 三萜类的潜在降解过程

为了研究降解产物，在室温下储存7天后，使用UPLC-Q/TOF–MS/MS对提取物进行了分析。如图1B所示，化学表征显示三萜类发生了显著降解，特别是肉桂酸，这是一种强效的抗氧化剂[11]。肉桂酸在C11和C12位置的酚羟基使其能够作为氢供体，与自由基反应并终止自由基链反应[12]。然而，这一特性也使肉桂酸容易发生氧化降解。如图1B所示，肉桂酸含量的减少伴随着肉桂醇含量的相应增加，表明这两种化合物之间的转化[13]。在14.467分钟和14.906分钟洗脱出的两种化合物分别被鉴定为11-乙氧基肉桂酚半醌和表桂醇乙醚，它们是表桂醇的假定衍生物。在迷迭香叶提取物中鉴定出的降解化合物在表S8中进行了总结。所提出的降解途径如图4C所示。

稳定性改进
在分离三萜类时，通过加热和旋转蒸发去除乙醇。这种长时间的热暴露加速了肉桂酸的氧化。系统研究了肉桂酸的热降解动力学。首先，在不同加热条件下评估了肉桂酸的降解情况。如图S2A所示，肉桂酸在4°C时相对稳定，其降解速率随着温度的升高而增加。降解动力学结果表明，肉桂酸的降解遵循零阶动力学（表S6）。不同温度下的相应降解曲线如图S2B所示，表明肉桂酸的热降解速率在不同浓度下保持恒定。

最初使用酸化处理来减少肉桂酸的降解。如图S2C所示，磷酸略微延缓了降解过程。相比之下，维生素C（1 M）可以有效阻止肉桂酸的氧化长达7天（图S2D）。重要的是，由于维生素C具有水溶性，它在最后的富集步骤中可以通过过滤轻易去除。进一步评估了含有维生素C的TD在4°C、25°C和50°C下的稳定性。结果显示，它在4°C和25°C下可稳定保存长达1个月，而在50°C下18天后肉桂酸开始降解（图S2E）。

为了研究维生素C与二萜类之间的潜在化学相互作用，对含有或不含维生素C的肉桂酸和TD进行了UPLC-Q/TOF–MS分析。如图S2F所示，含有维生素C的样本中没有观察到新的峰，表明在接触维生素C后没有生成新的化合物。

TD的化学组成通过UPLC-Q/TOF–MS/MS进行了表征。通过标准曲线方法定量了十种相对含量较高的成分，其中五种是二萜类，占TD的81.80%。主要二萜类被鉴定为肉桂酸（59.11%）、表桂醇（12.60%）、12-甲基肉桂酸（3.17%）和rosmanol（0.49%），这些百分比代表了它们在提取物中的相对丰度（表S4）。在最佳条件下，提取产率为41.12%。量化分析进一步证明了富集方法的可靠性和效率。

TD减轻肾脏损伤并保护肾功能
接下来，我们通过DKD小鼠模型评估了TD的肾保护作用。实验设计的示意图如图5A所示。如图5B–F所示，TD处理改善了DKD小鼠的空腹血糖和胰岛素耐受性，但对口服葡萄糖耐受性没有影响。这些发现表明TD可以提高胰岛素敏感性。

图5
TD处理减轻了DKD小鼠的肾病理损伤并保护了肾功能。A. 小鼠模型的实验设计示意图。B. 干预结束时小鼠的空腹血糖水平（n=10）。C–F. TD处理后小鼠的OGTT和ITT结果（n=5）。G–N. 干预结束时收集血液和尿液样本以检测UAE（G）、UACR（H）、血清肌酐（I）、血清BUN（J）、TC（K）、LDL-C（L）、HDL-C（M）（n=10）。N. 肾组织制成石蜡切片，并进行PAS、H&E和Masson三色染色（n=6）。数据以均值±SEM显示。统计分析使用单因素ANOVA进行，*P<0.05，**/##P<0.01，***/###P<0.001，****/####P<0.0001。“#”表示与NC小鼠的比较，“*”表示与DKD小鼠的比较。

TD处理还改善了关键的肾损伤指标。24小时尿白蛋白排泄（UAE）和尿微白蛋白与肌酐比（UACR）显著得到改善（图5G和H）。这些改善表明TD减轻了肾小球屏障功能障碍，这是DKD早期进展的中心事件。TD处理还降低了血清肌酐和BUN水平（图5I和J），表明TD有效恢复了DKD小鼠的肾过滤功能。

脂质代谢紊乱是DKD的一个公认特征。如图5K–M所示，TD降低了TC和LDL-C水平，同时增加了HDL-C水平，表明TD减轻了DKD小鼠的脂质异常。

为了研究TD处理后的肾病理变化，进行了H&E和Masson三色染色。与NC小鼠相比，DKD小鼠在H&E和PAS染色中显示出系膜细胞增生、系膜基质扩张和糖原沉积。相比之下，TD处理显著改善了糖尿病引起的肾小球组织病理变化。这些形态学改善表明TD抑制了DKD小鼠的系膜基质积累，这是糖尿病性肾小球硬化的标志。同时，Masson三色染色显示TD处理减轻了DKD小鼠的间质纤维化（图5N）。总之，这些结果表明TD具有强大的肾保护作用。

TD减轻了DKD小鼠中的氧化应激引起的肾脏损伤
鉴于TD是一种强效抗氧化剂，而氧化应激是DKD的关键病理特征[15]，我们研究了TD是否能够缓解DKD小鼠模型中的肾氧化应激。如图6A–C所示，TD降低了DKD小鼠肾脏中的MDA水平，并提高了超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性。这些结果表明TD减轻了DKD小鼠的肾氧化应激。

图6
TD对DKD小鼠肾氧化应激的治疗效果研究。A. MDA的相对含量。B-C. CAT（B）和GSH-Px（C）的相对活性。D, E. 小鼠肾脏中Nrf2（D）和HO-1（E）的mRNA表达。F–H. 通过western blot检测Nrf2（G）和HO-1（H）的蛋白质表达水平，并以β-actin为对照进行定量。I–K. 给小鼠口服TD后，血浆中肉桂酸（I）、肉桂醇（J）和12-甲基肉桂酸（K）的浓度-时间曲线。数据以均值±SEM显示。统计分析使用单因素ANOVA进行，*P<0.05，**/##P<0.01，***/###P<0.001，****/####P<0.0001。“#”表示与NC组的比较，“*”表示与DKD组的比较。此外，Nrf2是细胞抗氧化反应的关键调节因子。HO-1是Nrf2的下游靶基因，通过其酶产物的协同作用发挥抗氧化和细胞保护作用[16]。为了检测TD是否激活Nrf2/HO-1通路，我们评估了小鼠肾脏组织中Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白质表达水平。如图6D–E所示，TD处理显著增加了Nrf2和HO-1的mRNA水平。Western blot结果进一步显示TD处理后Nrf2和HO-1的蛋白质水平也升高（图6F–H）。总体而言，这些结果表明TD通过激活Nrf2/HO-1通路表现出潜在的体内抗氧化效果。

TD的体内吸收情况如图所示。在给大鼠口服TD（如通过胃内给药）后，检测到了其主要成分（肉桂酸、肉桂醇和12-甲氧基肉桂酸），其浓度-时间曲线显示在图6I-K中。肉桂酸和肉桂醇的双峰血浆浓度-时间曲线表明可能存在肠肝循环。如表S9所示，尽管肉桂酸在体外容易降解为肉桂醇，但它们的最大浓度（Tmax）值并未显示出明显的体内转化。肉桂酸、肉桂醇和12-甲氧基肉桂酸的口服生物利用度分别为43.2%、24.4%和91.8%，这表明TD的主要成分具有良好的生物利用度。此外，表S10-13展示了用于分析血液样本的LC-MS/MS方法的验证结果。

为了研究TD的体内毒性，我们进行了急性毒性研究。结果显示TD的LD50为3.721克/千克（95%置信区间2.933–5.805克/千克）（表S14）。此外，在存活小鼠的主要器官中未检测到明显的毒性（图S4A），这一点通过使用H&E染色的组织学分析得到了证实（图S4B）。尸检显示一些死亡小鼠的肠道有轻微胀气，组织学分析显示小肠绒毛可能受损。未观察到的不良效应水平（1.20克/千克）远高于有效剂量（50毫克/千克）。

糖尿病肾病（DKD）是慢性肾病中增长最快的原因之一，大约40%的糖尿病患者会发展为DKD。它已被确认为终末期肾病（ESRD）的主要原因[17]。DKD最初由代谢紊乱引发，包括高血糖、高脂血症和胰岛素抵抗。这些问题随后会触发一系列病理事件，如肾小球高通量过滤、炎症、氧化应激和进行性纤维化，最终导致肾功能丧失[18, 19]。迷迭香富含生物活性化合物，这些化合物已被证明可以调节糖脂代谢并减轻氧化应激。这使得迷迭香成为治疗DKD的一个有前景的候选物。

在这项研究中，我们使用UPLC-Q/TOF-MS/MS技术阐明了迷迭香叶的药理动力学基础。我们鉴定出38种成分，包括13种二萜类化合物、6种酚酸、12种黄酮类化合物和4种三萜类化合物。使用细胞DKD模型进行的体外筛选表明，二萜类化合物是其抗DKD效应的主要活性成分。

最近关于迷迭香二萜类化合物提取的研究主要集中在肉桂酸上。传统提取方法主要依赖于Soxhlet、浸渍和渗滤。Grzegorz等人开发了一种基于超声波的浸渍方法，获得了147.5毫克/克的肉桂酸含量[20]。Salamatin等人使用Soxhlet提取法从Salvia officinalis的叶子中提取二萜类化合物，总二萜类化合物含量为50毫克/克[21]。然而，Soxhlet提取需要加热，这可能导致生物活性成分的降解。浸渍耗时较长，并且通常使用甲醇、丙酮、醚和己烷等有毒有机溶剂[22]。为了解决传统方法的局限性，一些新的提取方法被建立起来。Wang等人报告了一种结合超声波辅助提取和基于疏水性共沸溶剂的高速逆流色谱分离的方法。尽管这种方法减少了有机溶剂的使用，但在工业应用中仍然具有挑战性，且肉桂酸的含量较低（30%[23]。Mo等人使用自制色谱柱提取肉桂酸，纯度超过90%[24]。然而，对实验室自制色谱柱的依赖限制了其工业应用。Thibault等人开发了一种在线提取-超临界流体色谱方法，该方法可以在25°C下进行提取，减少了肉桂酸的降解。该方法获得了含有49%肉桂酸的产品[25]。与报道的方法相比，我们的富集方法环保，仅使用水和乙醇。额外的维生素C在提取过程中阻止了二萜类化合物的降解，并且维生素C可以从最终产品中轻松去除。总之，这种方法简单，最终产品中含有60%的肉桂酸和80%的总二萜类化合物。虽然这种方法高效且环保，但目前的TD提取量仅为40%，这表明迷迭香叶的利用率还有进一步提高的空间。一个未来的研究方向是进一步优化提取过程以提高TD的产量。

为了评估TD extract对DKD的治疗效果，我们建立了一个DKD小鼠模型。经过十周的治疗，TD不仅改善了葡萄糖和脂质代谢紊乱，还减轻了肾脏损伤。鉴于肾氧化应激损伤是DKD的标志，我们随后评估了关键的氧化应激相关因素。结果表明，TD降低了MDA水平，并提高了SOD和GSH-Px的活性，表明TD减弱了DKD小鼠肾脏中的氧化应激。此外，TD治疗激活了Nrf2/HO-1通路，通过增加Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白质水平，表明其具有潜在的体内抗氧化活性。

为了进一步探讨TD的体内吸收情况，对其主要成分进行了药代动力学分析。结果显示TD的主要成分具有良好的生物利用度，这支持其在DKD治疗中的潜在应用。

结论：本研究开发了一种新的迷迭香二萜类化合物富集方法，为其他可降解天然产物的富集提供了一个实用框架。富集的二萜类提取物在DKD小鼠中显示出强大的肾脏保护作用，表明其作为DKD治疗剂的潜力。