双神颗粒通过调节髓源性抑制细胞引起的T细胞耗竭，提升肺腺癌患者抗PD1治疗的疗效

《Chinese Medicine》：Shuangshen granules enhance anti-PD1 therapy effectiveness in lung adenocarcinoma by modulating myeloid-derived suppressor cell-induced T cell exhaustion

　　摘要
背景
在全球范围内，肺癌是与癌症相关死亡的最常见原因。针对非小细胞肺癌（NSCLC）的分子靶向疗法和免疫疗法在过去二十年中显著改善了治疗效果。然而，绝大多数晚期NSCLC会对现有治疗产生耐药性并最终进展。一种传统中药方剂“双肾颗粒”（SSG）在缓解癌症副作用和提高生存率方面显示出潜力。尽管有临床证据支持其益处，但人们对SSG中活性成分及其作用机制仍了解不足，这限制了其更广泛的临床应用。

方法
建立Lewis肺癌（LLC）荷瘤小鼠模型以评估SSG与抗PD-1疗法联合使用的体内效果，并分离髓系来源的抑制细胞（MDSC）和CD8+T细胞进行体外共培养实验，同时使用苏木精和伊红（HE）进行病理检查。通过免疫组化（IHC）、免疫荧光和流式细胞术以及Western blotting检测PD-1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3、Arg-1、IDO、iNOS、PD-L1和Gal-9的表达。利用逆转录-定量聚合酶链反应（qPCR）检测IL-2、TNF-α和IFN-γ的表达。通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）测量IL-10和TGF-β的浓度。利用网络药理学和分子对接技术筛选SSG在肺腺癌（LUAD）中的潜在治疗靶点和介导信号通路。这些预测结果通过Western blotting进一步验证。

结果
使用LLC异种移植小鼠的体内实验表明，SSG以剂量依赖的方式抑制肿瘤生长，高剂量SSG在抑制肿瘤血管生成和细胞增殖方面表现出最佳效果。SSG通过减少T细胞耗竭和MDSC介导的免疫抑制来增强抗肿瘤免疫力，SSG+抗PD-1联合疗法协同优化了肿瘤免疫微环境。网络药理学分析揭示了5个与免疫、LUAD和SSG活性成分相关的核心靶点（IL2、STAT3、HSP90AA1、LGALS3和FGF2），这些靶点在PI3K-Akt通路中显著富集。与对照组相比，SSG组中的p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平显著下调，表明PI3K-Akt通路可能受到抑制。

结论
SSG可以剂量依赖地抑制小鼠中的LLC肿瘤生长，并通过缓解T细胞耗竭和MDSC介导的免疫抑制发挥抗肿瘤作用。值得注意的是，IL2、STAT3、HSP90AA1、LGALS3和FGF2作为SSG的潜在靶点，在PI3K-Akt通路中显著富集，为LUAD的治疗提供了新的视角。

引言
肺癌仍是全球最常见的恶性肿瘤，也是导致癌症相关死亡的主要原因。针对非小细胞肺癌（NSCLC）的分子靶向疗法和免疫疗法在过去二十年中显著改善了治疗效果。然而，绝大多数晚期NSCLC会对现有治疗产生耐药性并最终进展。一种传统中药方剂“双肾颗粒”（SSG）在缓解癌症副作用和提高生存率方面显示出潜力。尽管有临床证据支持其益处，但人们对SSG中活性成分及其作用机制仍了解不足，这限制了其更广泛的临床应用。

材料与方法
Panax quinquefolium L.（批号23011602）、Panax notoginseng（批号21030903）和Cordyceps sinensis（批号230360511）由中国中医科学院广安门医院提供（详见表1）。Ginsenoside Rg1（编号110703–202235）、ginsenoside Rb1（编号110704–202331）、ginsenoside Rd（编号111818–202,104）和notoginsenoside R1（编号110745–202322）来自中国食品药品监督管理局（北京）。RIPA裂解液来自Promega（美国威斯康星州麦迪逊），RPMI-1640培养基来自Solarbio（北京），DMEM和胎牛血清（FBS）来自HyClone（美国犹他州洛根）。

主要抗体
针对Arg-1（arginase-1，编号#93,668）、IDO（编号#51,851）、PD-L1（编号#64,988）、TIM-3（编号#83,882）、CTLA-4（编号#53,560）、LAG-3（编号#80,282）和β-actin（编号#3700）的一抗来自Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州波士顿）。针对iNOS（ab178945）、Gal-9（ab69630）、PD-1（ab214421）和BTLA（ab216505）的抗体来自Abcam（英国剑桥）。用于体内实验的抗小鼠PD-1单克隆抗体（克隆RMP1-14，BE0273）来自BioXcell（美国新罕布什尔州西黎巴嫩）。用于Western blot分析的一抗包括GAPDH Rabbit pAb（AC001）、IL2 Rabbit mAb（A22200）、Pan-Akt Rabbit mAb（A18675）、Phospho-AKT-S473 Rabbit mAb（AP0637）、PIK3CG Rabbit pAb（A6688）、STAT3 Rabbit mAb（A19566）和Phospho-PI3 Kinase p55-Y199 Rabbit mAb（AP1463），均来自Abclonal（中国武汉）。Hsp90 alpha抗体（AB3632）来自ABWAYS（上海）；Galactin-3多克隆抗体（14,979–1-AP）和FGF2多克隆抗体（30,333–1-AP）来自Proteintech Group, Inc（中国武汉）。辣根过氧化物酶（HRP）结合的山羊抗兔IgG（H?+?L）二抗（31,460）来自Invitrogen（上海）。用于流式细胞术的荧光标记抗体来自BioLegend（美国加利福尼亚州圣地亚哥），包括FITC–anti-CD11b（编号101,205）、PerCP/Cyanine5.5–anti-Gr-1（编号108,425）、PE–anti-PD-L1（编号155,403）、PE/Cyanine7–anti-Gal-9（编号137,913）、FITC–anti-CD3（编号100,203）、PerCP/Cyanine5.5–anti-CD8a（编号100,733）、PE–anti-PD-1（编号114,117）和Brilliant Violet 605–anti-TIM-3（编号119,721）。IL-10、TNF-α、IL-2、IFN-γ和TGF-β的ELISA试剂盒来自NeoBioscience（中国深圳）。Recombinant GM-CSF（编号315–03）和IL-6（编号216–16）来自PeproTech（美国新泽西州罗克希山）。Lewis肺癌（LLC）细胞系从中国细胞系资源国家基础设施获得，并在添加10% FBS的DMEM培养基中于37°C、5% CO2湿润环境中培养。

肿瘤荷瘤小鼠模型的建立及SSG治疗
SSG由经过认证的草药原料（Panax quinquefolius、Panax notoginseng和Cordyceps sinensis）制备，通过粉碎草药并按1:6:1（w/w/w）比例混合而成。对草药原料和最终制剂的质量控制遵循我们之前的研究方案[18, 19]。雄性C57BL/6 J小鼠（4–5周龄）在肿瘤植入前适应7天。为了建立肿瘤模型，将LLC细胞（5×10^6个细胞，溶于100 μL PBS）皮下注射到每只小鼠的左侧胁部[20]。为了确定最佳SSG剂量，将荷瘤小鼠随机分为四组（每组n=5只）：对照组、低剂量SSG（SSG-L）、中等剂量SSG（SSG-M）和高剂量SSG（SSG-H）。SSG-L的剂量是基于该草药配方在人体中的等效剂量（约6克/70公斤成年人体重），这相当于约18.0毫克/天，用于约20克重的老鼠，通过体表面积转换因子（老鼠与人类的比例为9.01）进行计算。SSG-M和SSG-H的剂量 respectively 是SSG-L剂量的两倍（36.0毫克/天）和三倍（54.0毫克/天）。SSG通过口服方式每天给予一次，持续21天，而对照组则接受等体积的水。在21天的药物干预后，通过腹腔注射30毫克/公斤剂量的0.4%戊巴比妥钠对老鼠进行麻醉。从每组老鼠中收集外周血液、脾脏和肿瘤组织以用于后续实验。根据观察到的肿瘤抑制程度，高剂量的SSG被选为后续实验的最佳剂量。

在联合治疗实验中，另一组携带LLC肿瘤的老鼠被随机分配到四个组（每组n=8只）：对照组、单独使用SSG、单独使用抗PD-1抗体以及SSG+抗PD-1抗体组合。SSG组的老鼠每天口服最佳剂量的SSG，持续21天。抗PD-1抗体组的老鼠从肿瘤接种后第7天开始，每隔一天腹腔注射一次抗小鼠PD-1抗体（每只老鼠200微克），总共注射7次（14天）。对照组的老鼠则按相同时间表接受口服水和生理盐水。第21天，所有老鼠都被安乐死，并收集肿瘤组织、外周血液和脾脏进行进一步分析。所有动物实验程序都得到了中国中医科学院光安门医院动物伦理委员会的批准（批准编号IACUC-GAMH-2022–011）。实验时间线如图1所示。

图1：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

动物实验的时间线。(A) SSG剂量优化实验的时间线。(B) 主要体内研究中对照组、SSG组、抗PD-1组及联合治疗组的治疗时间线。

**HE和IHC**：切除的肿瘤组织用4%中性缓冲福尔马林固定，嵌入石蜡中，切成4-6微米的切片。对于H&E染色，切片首先脱蜡、复水，然后用苏木精染色，随后用伊红染色。对于IHC，组织切片在柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中进行抗原修复，并用3% H2O2和甲醇淬灭内源性过氧化物酶活性。之后用5% BSA封闭切片，并在4°C下过夜孵育一级抗体。洗涤后，加入HRP标记的二级抗体，使用DAB显色剂可视化免疫反应。切片经过复染（用苏木精），用中性树脂封片，在光学显微镜下进行检查和评分。

**免疫荧光**：石蜡包埋的肿瘤切片进行脱蜡并如上所述进行抗原修复。在室温下用5% BSA封闭1小时后，切片与针对CD3、PD-1、CD11b或PD-L1的一级抗体孵育。随后，切片与适当的Alexa Fluor标记的二级抗体孵育。细胞核用DAPI进行复染。染色后的切片使用激光扫描共聚焦显微镜（Leica Microsystems，德国韦茨拉尔）观察和成像。

**流式细胞术**：从小鼠脾脏或培养细胞中制备单细胞悬浮液，并用PBS洗涤。细胞首先在冰上与抗小鼠CD16/32 Fc阻滞剂孵育15分钟以防止非特异性抗体结合。然后应用两个抗体染色组合：一个组合（针对髓系细胞）包括FITC-anti-CD11b、PerCP/Cyanine5.5-anti-Gr-1、PE-anti-PD-L1和PE/Cyanine7-anti-Gal-9；另一个组合（针对T细胞）包括FITC-anti-CD3、PerCP/Cyanine5.5-anti-CD8a、PE-anti-PD-1和BV605-anti-TIM-3。染色在4°C下进行25分钟。染色后，细胞用PBS缓冲液（含2% FBS）洗涤并重悬。数据采集使用BD LSR II流式细胞仪（BD Biosciences）完成，后续数据分析使用FlowJo v10软件进行，并应用Tukey多重比较检验进行统计分析。

**Western blotting**：肿瘤组织样本或培养细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰冷RIPA缓冲液中裂解30分钟。裂解物在4°C下以12,000 rpm离心15分钟，收集上清液。通过SDS-PAGE分离等量的蛋白（通过BCA测定），然后转移到PVDF膜上。膜在室温下用5% BSA封闭1小时后，与一级抗体在4°C下过夜孵育。洗涤后，用HRP标记的二级抗体（ZSGB-Bio，北京，中国）孵育1小时。使用增强化学发光（ECL）试剂检测免疫反应条带，并进行成像。条带强度使用ImageJ软件（v1.53a）量化。

**酶联免疫吸附测定**：外周血液样本和细胞培养上清液在4°C下以12,000 rpm离心20分钟以获得无细胞上清液。使用特定的ELISA试剂盒根据制造商的协议测量这些上清液中的IL-10和TGF-β浓度。使用GloMax Discover微孔板读数器（Promega，威斯康星州麦迪逊）在适当波长下读取吸光度，并根据标准曲线计算细胞因子浓度。

**逆转录-定量聚合酶链反应**：使用Rapid RNA Purification Kit（ES Science，上海，中国）从小鼠肿瘤组织中提取总核糖核酸（RNA）。使用RevertAid逆转录试剂盒（Yeasen，上海，中国）合成cDNA，然后在Applied Biosystems（Bio-Rad T100，美国）上进行逆转录-定量聚合酶链反应，以量化IL-2、IFN-γ和TNF-α mRNA的水平。基因表达使用GAPDH作为稳定表达的参考基因进行标准化。重复三次实验以确保可重复性，引物设计通过primer-basic local alignment search工具（美国国立卫生研究院国家生物技术信息中心）完成（表2）。

**SSG含药血清的制备**：初始体重为（180–200）克的雄性Wistar大鼠每天两次（BID）接受SSG提取物（62.5毫克/公斤）治疗，持续7天。该剂量是基于6克/70公斤人体剂量的HED转换得出的（大鼠与人类的比例为6.25）。最后一次给药后两小时，通过腹腔注射30毫克/公斤剂量的3%戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，从腹主动脉采集血液并冷藏过夜。在4°C下以3,000 rpm离心15分钟后，收集血清并储存于-20°C。实验方案得到了中国中医科学院光安门医院动物福利和伦理委员会的批准，并符合国际实验室动物科学协会的指导方针（批准编号IACUC-GAMH-2024–004-SQ）。

**SSG含药血清的成分分析**：使用高效液相色谱串联质谱（HPLC–MS/MS）分析了SSG含药血清中的主要化学成分。分析是在ExionLC-20AD HPLC系统上进行的，该系统连接了一个AB Sciex质谱仪，遵循先前描述的方案[21]。每种人参皂苷的优化多重反应监测（MRM）参数列在表3中。分析前，将100微升血清与300微升甲醇-乙腈（4:1，v/v）混合，以6000 rpm旋涡5分钟，然后在4°C下以20,000 × g离心10分钟。收集上清液并在氮气流下蒸发至干燥。残留物重新溶解在甲醇中至浓度为10毫克/毫升。准备混合标准化合物的储备溶液（每种化合物1毫克/毫升），并逐步稀释以生成校准曲线。LC–MS/MS数据在正离子和负离子模式下收集，扫描范围为30–1300，扫描时间为0.4秒。数据采集和分析使用MassLynx v4.1软件（Waters Corp. Milford，马萨诸塞州，美国）及其Elemental Composition工具（Waters）完成。

**MDSCs和CD8+ T细胞的分离**：从4-5周大的C57BL/6 J小鼠的股骨和胫骨中采集骨髓细胞。红细胞溶解后用PBS洗涤，骨髓细胞在含有10% FBS的RPMI-1640培养基中培养，并补充100 ng/mL GM-CSF和100 ng/mL IL-6以诱导MDSCs的分化和扩增。培养4天后，收集细胞并调整至5 × 10^6细胞/毫升的浓度。然后，细胞用抗CD11b和抗Gr-1抗体共同标记，并通过流式细胞术确认MDSCs的成功富集。当诱导分化的MDSCs纯度达到98%时，符合后续实验的要求。Gr-1抗体可以识别Ly6G和Ly6C上的表位，从而标记整个MDSC群体[22]。随后，MDSCs富集的细胞用含有SSG的大鼠血清的培养基处理24小时。处理后，收集MDSCs及其培养上清液进行流式细胞术、Western blotting和ELISA分析，以评估其免疫抑制特性的变化。

**CD8+ T细胞的分离**：从4-5周大的C57BL/6 J小鼠的脾脏中采集脾脏组织。通过70微米细胞滤网研磨脾脏组织制备单细胞悬浮液。红细胞溶解后，使用Miltenyi Biotec（德国贝吉施格拉德巴赫）的磁CD8a+ T细胞分离试剂盒根据制造商的说明分离CD8+ T细胞。简而言之，脾细胞与抗CD8a磁微珠孵育，然后通过磁场通过MS柱；富集的CD8+T细胞随后洗脱并通过流式细胞术验证纯度。用上述含SSG的血清预处理的MDSCs和CD8+T细胞一起在Transwell系统中共培养以评估功能相互作用。CD8+T细胞放置在Transwell板的下层孔中，MDSCs加入上层孔（孔径约0.4微米，允许因子交换但阻止细胞迁移）。两种细胞群体按照后续实验指定的时间共培养。共培养后，收集细胞（及其培养上清液）进行流式细胞术、Western blotting和ELISA分析。

**CFSE增殖测定**：使用CFSE稀释法评估CD8+T细胞的增殖。分离的CD8+T细胞在37°C下与5 μM CFSE（Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester；BD Biosciences）孵育15分钟。通过加入五倍体积的冷RPMI-1640培养基淬灭染色。细胞洗涤后，然后重新悬浮在含有200 ng/mL IL-2、10 μg/mL抗CD3ε和10 μg/mL抗CD28的RPMI-1640完全培养基中。CFSE标记的CD8+T细胞（5 × 10^5）与MDSCs（也用SSG血清预处理）以1:1的比例在96孔板中共培养72小时。72小时后，收集细胞并使用流式细胞术测量CD8+T细胞的CFSE稀释度以确定细胞增殖情况（CFSE荧光降低表示细胞分裂）。

**凋亡测定**：使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（BD Biosciences，目录号556,547）在CD8+T细胞与MDSCs共培养后评估其凋亡情况。CD8+T细胞和MDSCs在Transwell装置中共培养24小时（CD8+T细胞在下层孔，MDSCs在上层插片中）。24小时后，收集CD8+T细胞，用冷PBS洗涤，然后重新悬浮在500 μL的结合缓冲液中。细胞用5 μL的Annexin V–FITC和5 μL的propidium iodide（PI）染色，并在室温下孵育30分钟。通过流式细胞术分析CD8+T细胞的早期和晚期凋亡情况。

**细胞计数Kit-8**：按照“MDSCs和CD8+ T细胞的分离”部分描述的富集方法后，计数MDSCs，然后将其接种到96孔板中，最外层孔填充PBS以消除边缘效应，随后在细胞培养箱中孵育。根据细胞大小和生长率优化接种密度，每个组重复三个孔。将SSG含药血清与1640完全培养基混合以制备六个浓度梯度（5%、10%，等），并建立空白血清组（10%空白大鼠血清）和胎牛血清组（10% FBS）作为对照。MDSCs用上述培养基处理24小时后，向每个孔中加入10 μL的CCK-8溶液（Servicebio，G1613-1ML）再孵育1小时。使用微孔板读数器测量450 nm（OD450）的吸光度，并通过数据分析计算细胞活力。

**SSG的网络药理学分析**：从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）检索Ginsenoside Rg1、Ginsenoside Rb1、Ginsenoside Rd和Notoginsenoside R1的SMILES结构，并在Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch）、Targetnet（http://targetnet.scbdd.com/）和SEA（https://sea.bkslab.org/）数据库中筛选它们的相应靶标，阈值设置为Prob > 0。从ImmPort数据库（https://www.immport.org/）收集与免疫相关的基因。与此同时，为了提高数据可靠性，研究人员从OMIM（http://www.omim.org/）和GeneCards（https://www.genecards.org/）中筛选目标基因，采用基于相关性的两轮中值截断方法对目标基因进行筛选，并通过合并两个数据库中的目标基因生成最终基因集。将化合物预测的目标基因与免疫相关基因及LUAD相关基因进行 intersect操作，以识别共同目标基因。使用Venny 2.1.0软件确定SGG化合物、免疫相关基因和LUAD相关基因之间的重叠目标，并通过Cytoscape软件v3.7.1构建药物-目标-蛋白质-蛋白质（PPI）网络。随后利用STRING数据库（http://string.embl.de/）构建共同目标的PPI网络，设定的置信度为0.15，并选择人类作为研究物种。采用度量算法对网络中的基因进行排序，筛选出前5个核心目标基因。接着进行基因本体（GO）和京都基因组学百科全书（KEGG）通路分析，以阐明与这些目标基因相关的生物功能和通路[23]。上述分析均进行了假发现率（FDR）的校正。

**分子对接研究**
为了评估关键活性SGG化合物与网络分析中识别出的高优先级蛋白质目标之间的潜在相互作用，进行了分子对接实验。目标蛋白质的晶体结构从uniqort/PDB数据库中获取，并使用PyMOL去除水分子后进行处理。主要活性成分的化学结构通过Chem3D软件进行绘制和优化至低能量的三维构象。然后使用AutoDock Vina v1.5.6将每个化合物对接到相应的目标蛋白质上，并记录最低结合自由能的结合构象以供进一步分析。

**统计分析**
在分析之前先评估数据的正态性和方差同质性。对于具有相同方差的正态分布参数，数据以均值±标准差表示，并采用参数化的单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，事后比较通过假发现率（FDR）进行调整。当正态性或方差假设不成立时，数据以中位数（四分位距）表示，并使用Kruskal-Wallis检验（ANOVA的非参数等效方法）进行分析，随后进行Dunn的事后比较。所有统计分析均使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software，美国）软件完成，统计显著性标准设定为双尾P<0.05。

**结果**
**SGG在异种移植小鼠模型中抑制肿瘤生长**
我们首先使用LLC异种移植小鼠模型评估不同剂量SGG对肿瘤生长的影响。SGG治疗以剂量依赖的方式显著抑制肿瘤生长，剂量越高，肿瘤抑制效果越明显（图2A-C）。在整个21天的治疗期内，SGG耐受性良好：所有小鼠组的体重均保持稳定，对照组与SGG处理组之间没有显著差异（图2D）。肿瘤组织的组织学检查显示，高剂量SGG显著降低了异常形状（不规则）肿瘤细胞的比例（图2E）。IHC染色结果显示，高剂量SGG组肿瘤的CD34（血管内皮细胞标记物）和Ki-67（增殖标记物）表达明显低于对照组肿瘤（图2F）。这些发现表明SGG在体内具有抗肿瘤作用，且高剂量SGG最能有效抑制肿瘤生长和肿瘤细胞增殖。因此，选择高剂量SGG方案用于后续实验。

**SGG增强抗PD-1疗法在肿瘤小鼠中的疗效**
接下来我们研究了SGG是否能够增强PD-1阻断的治疗效果。在LLC肿瘤小鼠中，单独使用SGG即可显著抑制肿瘤生长，而SGG与抗PD-1抗体联合使用则导致肿瘤抑制效果最为显著（图3A-C）。实验结束时，SGG+抗PD-1联合治疗组的小肿瘤体积最小。治疗期间，我们监测小鼠的体重变化作为系统效应的指标。从第14天起，接受SGG或SGG+抗PD-1治疗的小鼠体重略有下降，到第21天时体重略低于对照组（图3D）。然而，体重差异并未伴随明显的毒性或不适症状。

**SGG在体内增强PD-1阻断的抗肿瘤疗效并减少T细胞耗竭**
进一步研究表明，SGG联合PD-1阻断显著提高了抗肿瘤效果。SGG+抗PD-1组合治疗组的小肿瘤体积最小（图3A-C）。治疗后，SGG+抗PD-1组肿瘤组织的H&E染色显示肿瘤细胞形态更为均匀（图3E），且T细胞耗竭标志物PD-1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3的表达显著降低（图3F）。这些数据表明SGG可以增强PD-1免疫疗法的效果，从而更有效地抑制肿瘤生长并改善肿瘤免疫环境。

**SGG改善PD-1疗法中的T细胞浸润并减少T细胞耗竭**
为了评估SGG对PD-1疗法中T细胞的影响，我们对治疗小鼠的免疫细胞群体和细胞因子进行了分析。流式细胞术显示，单独使用抗PD-1抑制剂会略微增强某些免疫反应，但同时又导致脾脏中CD8+T细胞比例下降（可能反映了T细胞的重新分布或负反馈）。相比之下，接受SGG治疗的小鼠脾脏中CD8+T细胞比例显著升高，SGG与抗PD-1联合使用后CD8+T细胞的频率接近对照组水平（尽管略低于对照组）。SGG处理小鼠（尤其是与PD-1联合使用时）的Th1型细胞因子水平显著升高（图4D）。血清（或脾脏匀浆液）的ELISA结果显示，SGG和SGG+抗PD-1组中的IL-2、TNF-α和IFN-γ浓度高于对照组，联合治疗组的细胞因子水平最高（图4D）。这些数据表明SGG通过扩增CD8+T细胞池、缓解T细胞耗竭并促进促炎细胞因子的产生，从而增强体内抗肿瘤免疫。

**SGG减少体内T细胞耗竭**
我们进一步研究了SGG对PD-1疗法中T细胞的影响。流式细胞术分析显示，SGG处理小鼠的脾脏中CD8+T细胞比例增加（图4A）。SGG与抗PD-1联合使用后，CD8+T细胞表面PD-1和TIM-3的抑制性受体表达显著降低（图4B和C）。这些结果表明SGG可以增强PD-1免疫疗法的效果，通过扩大CD8+T细胞池、缓解T细胞耗竭并促进促炎细胞因子的产生来增强抗肿瘤免疫。

**SGG减少肿瘤组织中的MDSC积累并抑制其免疫抑制功能**
SGG处理后，肿瘤组织中的MDSC（CD11b+Gr-1+细胞）数量显著减少（图6A）。SGG与抗PD-1联合使用进一步降低了PD-L1和Gal-9的水平，表明SGG不仅减少了MDSC的数量，还削弱了MDSC的免疫抑制能力（图6D）。此外，SGG处理组肿瘤组织中的PD-L1和Gal-9蛋白水平也显著降低（图6C）。这些结果表明SGG通过调节T细胞和抑制性髓系细胞，有助于改善肿瘤微环境的免疫效应。ELISA检测结果显示，经SSG处理的鼠来源的MDSCs分泌的IL-10和TGF-β这两种强效免疫抑制细胞因子的量显著低于对照组鼠的MDSCs（图6E）。同样，SSG与抗PD-1联合使用效果最佳，几乎将这两种细胞因子的水平恢复到基线水平。这些结果共同表明，SSG能够减弱体内MDSCs的数量和抑制活性，这可能有助于改善T细胞反应和抗肿瘤效果。

图6
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
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SSG在体内抑制MDSC的积累和功能（n=8）。
(A) 通过流式细胞术测量的每组脾脏中MDSCs（CD11b+Gr-1+细胞）的频率（*P<0.05，**P<0.01 vs 对照组）。
(B) 脾脏MDSCs上PD-L1和Gal-9的表达（MFI值）；**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，联合使用组显示显著降低。
(C) 肿瘤组织中MDSC相关酶（Arg-1，IDO，iNOS）的Western blot；SSG，特别是与抗PD-1联合使用时，显著减少了这些蛋白质。
(D) 每组肿瘤组织中消耗配体（PD-L1，Gal-9）的Western blot，SSG+抗PD-1组的水平最低。
(E) 通过ELISA测量的每组血清（或肿瘤微环境）中的IL-10和TGF-β浓度（*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001）。统计分析使用了未配对的t检验（未进行多重比较校正）。

在含有SSG的血清中鉴定出的化学成分
为了便于进行体外实验，我们制备了含有SSG的血清，并确认了血清中存在关键活性化合物。根据中国药典（2015年版）的指南，使用UPLC-MS/MS方法验证了制备的血清中含有药典标准中的预期人参皂苷。为了确保血清成分分析的可靠性，在本研究中，通过HPLC–MS/MS获得了含有SSG的血清的总离子色谱图（Fig. S1）。该色谱图显示所有成分在1.0–12.0分钟的保留时间范围内得到了有效分离。基于此，HPLC–MS/MS分析确定了含有SSG的血清的主要成分，每种化合物的代表性MRM色谱图显示在图7中。生成了标准曲线（表4）用于定量，并通过将色谱峰面积与这些标准曲线关联来确定血清中主要人参皂苷的浓度。如表5所总结的，SSG处理过的鼠的血清中含有约12.92 ng/mL的人参皂苷Rg1，1723.06 ng/mL的人参皂苷Rb1，412.56 ng/mL的人参皂苷Rd和13.37 ng/mL的加压皂苷R1。这些数据证实，口服SSG会导致其活性成分（至少是代谢物形式）在全身暴露，这为我们使用含有药物的血清进行体外实验提供了依据。虽然使用SSG处理过的动物的血清使体外发现更具生理相关性，但应注意的是，这里没有进行详细的药代动力学研究。在未来的研究中，对SSG成分进行更全面药代动力学分析将有助于将特定成分水平与生物学效应关联起来，从而指导剂量优化和转化前景。

图7
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空白血清与含有SSG的血清的MRM色谱图。
(A) 人参皂苷Rg1的色谱图；
(B) Rb1；
(C) Rd；
(D) 加压皂苷R1。这些轮廓确认了处理过的鼠血清中存在SSG的主要人参皂苷（峰值由箭头指示）

表4 含有SSG的血清中主要成分的标准曲线测定结果
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含有SSG的血清在体外抑制MDSC的免疫抑制活性并逆转T细胞耗竭
我们模拟了体外MDSCs与T细胞之间的相互作用，以进一步剖析SSG的作用机制。MDSCs源于小鼠骨髓培养（纯度大于95%的CD11b+Gr-1+细胞，图8A），然后用含有SSG的血清处理。这种处理显著减弱了MDSCs的免疫抑制特性。具体来说，暴露于SSG处理的血清后，MDSCs中Arg-1，IDO和iNOS的表达显著降低（图8B）。流式细胞术还显示，SGS血清处理后MDSCs表面的PD-L1和Gal-9表达大幅减少（图8C）。相应地，MDSCs释放到培养基中的IL-10和TGF-β量也显著减少（通过ELISA测量，图8D）。这些结果与我们的体内观察结果一致，表明SSG可以直接削弱MDSC衍生的抑制因子。MDSC裂解物的Western blot进一步证实：用含有SSG的血清处理的MDSCs中的PD-L1和Gal-9蛋白水平低于对照组MDSCs（图8E）。

图8
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含有SSG的血清在体外降低MDSC的免疫抑制活性（n=8）。
(A) 流式细胞术点图显示MDSCs（CD11b+Gr-1+）在扩增前后的百分比，确认纯度大于95%。
(B) 通过Western blot或流式细胞术量化MDSCs中的Arg-1，IDO和iNOS的表达；SSG显著降低了这三种蛋白。
(C) 处理后MDSCs表面的PD-L1和Gal-9水平（流式细胞术MFI），**P<0.01，****P<0.0001 vs 未处理的MDSCs。
(D) 通过ELISA测量的MDSCs分泌的IL-10和TGF-β；****P<0.0001。
(E) Western blot确认用SSG血清处理的MDSCs中PD-L1和Gal-9蛋白降低（代表性条带）。统计分析使用了未配对的t检验（未进行多重比较校正）。

接下来，我们研究了这些MDSCs的变化是否能够缓解T细胞耗竭。纯化的CD8+ T细胞与MDSCs在Transwell系统中共培养。在MDSCs预先用含有SSG的血清处理的共培养中，我们观察到T细胞指标明显改善（图9A）。流式细胞术显示，与未处理的MDSCs共培养的CD8+ T细胞相比，与SSG处理的MDSCs共培养的CD8+ T细胞表面的PD-1和TIM-3水平显著降低（图9B）。相应地，这些CD8+ T细胞的Western blot分析表明，当T细胞受到SSG处理的MDSCs的影响时，其他耗竭标志物（CTLA-4，BTLA，LAG-3）的表达也降低（图9C）。功能上，存在SSG处理的MDSCs时，T细胞更活跃：这些共培养物中关键的抗肿瘤细胞因子（IL-2，IFN-γ，TNF-α）的产生更高（图9D）。此外，与对照组MDSCs共培养的CD8+ T细胞相比，与SSG处理的MDSCs共培养的CD8+ T细胞显示出较低的凋亡率和更高的增殖率（分别通过Annexin V/PI染色和CFSE稀释证明）（图9E，F）。总的来说，这些体外发现表明，SSG（通过含药物血清中的成分）可以通过抑制MDSC的抑制机制和保护T细胞免于耗竭来缓解MDSC引起的T细胞抑制，从而恢复T细胞的增殖能力和存活率。

图9
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SSG处理的MDSCs在共培养中缓解T细胞耗竭。
(A) 从小鼠脾脏中分离CD8+ T细胞的流式细胞术分选（预分选和分选后的纯度图）。
(B) 与MDSCs±SSG处理共培养后CD8+ T细胞上的PD-1和TIM-3表达（*P<0.05，**P<0.01 vs 与未处理的MDSCs共培养）。
(C) 共培养后CD8+ T细胞上的PD-L1和LAG-3的Western blot分析，显示与SSG处理的MDSCs共培养时水平较低。
(D) 共培养上清液中的IL-2，IFN-γ和TNF-α水平，反映在SSG处理的MDSCs存在下细胞因子的产生增强（*P<0.05，****P<0.0001）。
(E) 共培养24小时后CD8+ T细胞的凋亡率，当MDSCs预先用SSG处理时Annexin V+细胞显著减少（**P<0.01）。
(F) 72小时共培养后CD8+ T细胞的增殖率（CFSE稀释），显示与SSG处理的MDSCs共培养时增殖指数增加（***P<0.001）。统计分析使用了未配对的t检验（未进行多重比较校正）。

SSG对于LUAD的潜在治疗靶点
选择人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1，人参皂苷Rd和加压皂苷R1进行网络药理学分析。在选择了47个活性成分的靶点后，我们确定了11个在47个活性化合物的靶点、3,257个免疫相关基因和4,970个LUAD相关基因中重叠的公共靶点（图10A）。GO富集分析显示这些公共靶点与炎症免疫信号的调节、细胞分泌和物质运输以及信号分子的结合和活性介导有关（图10B）。就KEGG途径而言，它们主要参与诸如细胞信号转导（例如PI3K-Akt，HIF-1途径）、肿瘤药物耐药性（例如EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性）和免疫检查点调节（例如肿瘤中的PD-L1表达和PD-1检查点途径）等功能（图10C）。其中，PI3K-Akt和HIF-1途径中富集基因的数量（Count）和富集显著性（padj）相对较高。

图10
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SSG的免疫相关机制的网络药理学分析。
(A) SSG化合物靶点、肺腺癌（LUAD）靶点和免疫相关基因之间的重叠（维恩图）。
(B) SSG的草药-成分-靶点-疾病交互网络。
(C) 公共靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络（最小置信度分数0.7）。
(D) SSG靶点富集的前20个KEGG途径。
(E) SSG靶点的GO富集结果（生物学过程，分子功能，细胞成分）。统计分析使用了超几何检验，并使用Benjamini-Hochberg（BH）方法调整了P值以进行多重比较校正。
(F) 关键SSG化合物与核心靶点的分子对接（一个化合物-靶点对的示意图）

为了更直观地说明公共靶点、活性成分和LUAD之间的靶向关系，构建了一个化合物-靶点-疾病网络来可视化这些相互作用（图10D），其中节点代表草药、化学成分、靶点或疾病，边表示它们之间的关系。接下来我们采用了0.15的低置信度阈值来表征公共靶点之间的相互作用，并通过度算法对基因进行排名，选出了前5个枢纽靶点，包括IL2，STAT3，HSP90AA1，LGALS3和FGF2，这些可能在SSG的药理学效应中起核心作用（图10E）。

分子对接模拟为这些网络发现提供了额外支持。人参皂苷Rg1与5个枢纽靶点进行了对接。对接结果显示了有利的结合相互作用；例如，预测人参皂苷Rg1与LGALS3的结合非常强（估计结合自由能=-7.0 kcal/mol）（图10F，表6）。

表6 人参皂苷Rg1与5个枢纽靶点的分子对接

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通过Western blot验证枢纽基因表达和PI3K-Akt信号通路
为了探索SSG在治疗LUAD中的潜在途径，我们用不同浓度的含有SSG的血清处理MDSCs 24小时，并通过CCK-8方法检测细胞活力。结果显示，含有20% SSG药物的血清组的细胞活力达到峰值，因此被用于后续的验证实验（图11A）。随后，通过Western blot检测了MDSCs中枢纽靶点的蛋白表达水平。结果表明，内部参考蛋白的表达正常，但未检测到IL2蛋白。与对照组相比，含有药物的血清处理组中HSP90AA1，LGALS3和FGF2的蛋白表达水平显著降低（图11B）。

图11
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通过Western blot验证枢纽靶点和PI3K-Akt通路蛋白。
(A) 含有不同浓度药物的血清中MDSCs的细胞活力（ns表示无显著性，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
(B) 枢纽靶点的Western blot结果（ns表示无显著性，*P<0.05）。
(C) PI3K-Akt通路蛋白的Western blot结果（ns表示无显著性，*P<0.05，**P<0.01）。

鉴于SSG活性成分的公共靶点、免疫相关基因和LUAD相关基因在PI3K-Akt通路中显著富集，我们进一步使用Western blot检测了SSG处理组中与该通路相关的蛋白表达差异。结果显示，与对照组相比，含有药物的血清处理组中p-PI3K和p-Akt的蛋白表达水平显著下调（图11C）。这些结果进一步表明，PI3K-Akt通路可能介导SSG的调节效应。

讨论
将中药配方与免疫检查点抑制剂（ICIs）结合在多个癌症模型中显示出协同潜力。含有Panax quinquefolius（美国人参）、Panax notoginseng和Cordyceps sinensis的SSG已在临床上用作辅助治疗以改善治疗耐受性。已知人参皂苷和cordycepin可以增强免疫力并表现出抗肿瘤效果[24, 25]。我们之前报告过SSG通过干扰MDSC分化来抑制肺癌转移[18]。本研究扩展了这些观察结果，表明SSG不仅减少了T细胞耗竭的标志物，还提高了PD-1阻断的疗效，有效重塑了肿瘤微环境，使其朝着免疫介导的控制方向发展。值得注意的是，接受高剂量SSG的小鼠在治疗效果接近尾声时表现出体重减轻的趋势。尽管这种变化并不显著，也没有伴随明显的毒性反应，但这一观察结果表明长时间或高剂量暴露可能会引发轻微的代谢改变——这强调了剂量优化的重要性。确定最佳治疗窗口（在保持疗效的同时将不良反应降到最低）对于SSG的临床应用至关重要，未来的研究应评估降低剂量或缩短疗程是否能够在不影响疗效的同时减轻副作用。在实际临床应用中，当将SSG与免疫检查点抑制剂（ICIs）联合使用时，剂量递增试验以及对体重和整体健康状况的密切监测将是必不可少的。作为一种复杂的中国中药制剂，SSG包含多种生物活性成分，因此我们无法将观察到的免疫调节和抗肿瘤效果归因于任何单一成分。相反，这些效果很可能是由于多种人参皂苷及活性成分之间的协同或叠加作用共同调节了肿瘤的免疫微环境，而不是通过单一主导机制起作用的。

我们的研究进一步强调了骨髓来源的抑制性免疫细胞（MDSCs）在免疫治疗抵抗中的作用。MDSCs数量升高与非小细胞肺癌（NSCLC）患者对PD-1/PD-L1抑制剂的反应不佳有关[26]。这些细胞通过限制T细胞活化并促进其他免疫抑制亚群的生成来创建一个抑制性环境[27]。我们重点关注了由MDSCs产生的介质——精氨酸1（Arg-1）、INDO（吲哚丁酸酯）（IDO）、iNOS（诱导型一氧化氮合酶）、PD-L1（程序性死亡受体1）和半乳凝集素-9（Galactin-9），因为它们是主要的抑制机制。Arg-1和IDO会消耗T细胞增殖所需的氨基酸[28, 29]，而iNOS产生的二氧化氮则会损害T细胞功能[30]。同时，PD-L1和Gal-9与PD-1和TIM-3等抑制性受体相互作用，加剧T细胞耗竭[31]。MDSCs还会分泌TGF-β（转化生长因子-β）、IL-10（白细胞介素-10）和IDO等因子，这些因子增强了效应T细胞的免疫抑制活性，促进了免疫逃逸，并导致了T细胞耗竭[32,33,34,35]。我们的研究发现SSG能够减少这些介质，表明它可以破坏MDSCs驱动的多个抑制层次。

重要的是，SSG治疗不仅减少了免疫抑制因子，还增加了CD8? T细胞（如IL-2、IFN-γ、TNF-α）的分泌。CD8? T细胞能够杀死肺腺癌（LUAD）细胞并调节肿瘤生长，其浸润程度与抗PD-1/PD-L1免疫疗法的效果正相关[36]。同样，华森蝴蝶草（Hirsutella sinensis，HSF）是SSG的主要成分之一的替代品，它通过上调CCRL2表达来促进巨噬细胞的M1极化，从而激活CD8? T细胞的抗肿瘤活性，最终抑制肺癌进展[17]。值得注意的是，三芪口服液（Sanqi Oral Liquid）也是一种含有三七（Panax notoginseng）的草药制剂，但在成分兼容性和服用剂量上与SSG不同，已有研究表明它可以降低CD8? T细胞的表达水平[37]。当我们通过检测其表面的关键抑制性受体来评估CD8? T细胞的耗竭状态时，发现SSG治疗减少了耗竭标志物的表达，而SSG与抗PD-1疗法的联合使用则产生了协同效应，进一步降低了PD-1和TIM-3的表达水平。T细胞耗竭标志物（PD-1、TIM-3）的变化表明T细胞的功能可能有所恢复[38]。综合这些结果，SSG作为肺癌腺癌的辅助治疗手段具有潜力，因为它可以优化CD8? T细胞的功能，并与免疫检查点抑制剂产生协同作用，同时也凸显了草药制剂设计在癌症免疫治疗中的重要性。

为了探索SSG对LUAD效应的潜在分子机制，我们预测了其核心功能靶点并进行了功能富集分析。GO和KEGG富集分析的结果表明，这些共同靶点在PI3K-Akt信号通路中显著富集，提示该通路可能在SSG调控LUAD进展中起关键作用。PI3K/Akt信号通路通过在细胞存活、增殖、迁移和凋亡中的调节，对肿瘤发生起到关键作用，其异常激活会引发肿瘤的发生和转移[39]。在我们的研究中，SSG组的p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平显著低于对照组，表明SSG可能通过抑制PI3K/Akt通路发挥治疗效果。该通路在MDSCs的功能、迁移和代谢中也起着关键作用[40]。先前的研究显示，在黑色素瘤的治疗中，青蒿素（ARTs）通过激活p70 S6K/mTOR信号通路并抑制PI3K/Akt和MAPK通路来调节MDSCs的功能极化[41]。在动物模型中，青蒿素的使用不仅抑制了MDSCs的活性，还增强了CD3?和CD8? T细胞向肿瘤微环境的浸润，从而产生了强烈的抗肿瘤效果[41]。此外，证据表明抑制PI3Kδ有助于扩增TCF-1+前体样耗竭T细胞（Tpex）亚群[42]。总体而言，这些结果表明PI3K/AKT通路可能是SSG抗LUAD效应的潜在机制。鉴于PI3K/AKT通路在调节MDSCs功能、CD8? T细胞浸润以及TCF-1+前体样耗竭T细胞生成中的关键作用，我们推测SSG也可能通过调节这些免疫成分来引发抗肿瘤免疫。

最后，我们的研究发现具有重要的转化意义。MDSCs越来越被认作是NSCLC免疫治疗结果的预测生物标志物，其数量升高与对PD-1/PD-L1阻断治疗的不良反应相关[22, 31]。我们的研究表明，SSG不仅减少了MDSCs的数量，还降低了它们的抑制性介质，这表明SSG不仅可能增强免疫检查点抑制剂（ICIs）的效果，还可以支持将MDSCs水平作为预测生物标志物来指导患者分型。这种双重治疗和诊断潜力加强了将草药辅助剂（如SSG）与免疫检查点疗法结合用于肺癌治疗的合理性。

目前的研究在安全性评估方面存在明显局限。由于缺乏对关键器官的病理检查和血清生化分析，高剂量SSG组中体重减轻的潜在原因——尤其是其与治疗相关毒性的关联——仍需进一步澄清。需要进一步的系统研究，包括全面的安全性评估，以填补这一知识空白。本研究使用体外诱导分化的骨髓来源MDSCs进行了实验，但尚未直接探讨SSG干预对肿瘤浸润MDSCs对CD8? T细胞功能的影响。SSG诱导的PI3K-Akt通路抑制（通过Western blot确认）与其免疫调节效应（减轻MDSCs抑制、缓解T细胞耗竭）之间的功能和因果关系仍然是间接和推测性的，需要通过Transwell共培养实验进一步验证机制。此外，本研究没有明确SSG中不同生物活性成分对整体免疫调节效应的单独贡献。作为一种多组分草药制剂，SSG可能是通过其成分之间的复合和协同作用发挥作用的，而不仅仅是单一关键化合物。未来的研究需要使用分离的单体或针对特定成分的调节方法，以确定主要活性成分及其单独或协同作用。此外，LLC同源小鼠肿瘤模型无法完全模拟人类LUAD的异质性特征，这可能在一定程度上影响研究结果的临床应用。基于此，后续研究将引入患者来源的异种移植模型（PDX）和3D类器官培养系统，以进一步验证SSG在具有人类LUAD异质性特征的肿瘤中的免疫调节效果和治疗潜力，旨在将研究成果转化为临床实践。

总之，本研究提供了实验证据，证明双神颗粒（SSG）通过调节肿瘤微环境增强了肺腺癌（LUAD）模型的抗肿瘤免疫力。SSG降低了MDSCs的数量和抑制性介质，减轻了T细胞耗竭，并提高了抗PD-1检查点疗法的效果。根据本研究的结果，我们发现SSG可以通过调节肿瘤免疫微环境来增强抗PD-1疗法的效果，为LUAD的治疗提供了新的见解（图12）。这些发现突显了同时针对髓系免疫抑制和T细胞功能障碍以克服免疫治疗抵抗的治疗潜力。SSG代表了一种有前景的辅助策略，尽管未来的研究仍有必要确定关键活性成分，明确它们的协同或叠加效应，优化安全有效的剂量方案，并进一步在临床环境中验证这些免疫机制。

图12

**SSG通过调节肿瘤免疫微环境增强LUAD中抗PD-1疗法效果的机制**