在急性心肌梗死的大鼠中，TRPV1蛋白存在于骨骼肌中，能够介导通过刺激PC6穴位进行针灸治疗所带来的心脏功能改善作用

《Chinese Medicine》：TRPV1 in skeletal muscles mediates the improvement of cardiac function induced by acupuncture at the PC6 acupoint in rats with acute myocardial infarction

　　**摘要**

**背景**
穴位是针灸刺激的初始反应部位，穴位的变化会影响针灸的后续治疗效果。然而，针灸从这一初始部位的作用机制尚未明确。本研究基于在厥阴穴（PC6）进行针灸以干预急性心肌梗死（AMI）的实验模型，旨在：1）探讨PC6穴位处针灸诱导的局部肌肉收缩是否介导了针灸的治疗效果；2）从瞬时受体电位香草酸1（TRPV1）的角度探索针灸效果的启动机制。

**方法**
使用Sprague–Dawley（SD）大鼠通过结扎左前降支冠状动脉（LAD）建立AMI模型。
1. **确定介导针灸疗效的关键组织层**：将SD大鼠随机分为对照组、AMI组、AMI+肌肉层针灸组（ACU-M）和AMI+皮下层针灸组。使用小型动物超声成像系统评估心脏功能；通过2,3,5-三苯基四唑氯（TTC）染色测量心肌缺血面积，并使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测血清去甲肾上腺素（NE）水平。
2. **验证肌肉收缩的作用**：另一组SD大鼠被随机分为对照组+生理盐水（0.9%氯化钠，NaCl）组、AMI+生理盐水组、AMI+生理盐水+针灸组和AMI+琥珀胆碱氯化物（Scc，肌肉松弛剂）+针灸组。在AMI模型建立后进行针灸，使用与上述相同的疗效指标。此外，从每组收集PC6组织和C5–T1节段背根神经节（DRG）。利用免疫荧光（IF）染色和Western blot（WB）分析检测穴位肌肉层中的TRPV1表达以及DRG中的TRPV1阳性神经元活化情况。
3. **阐明TRPV1的作用**：在针灸前向PC6肌肉层微注射TRPV1抑制剂；测量TRPV1（穴位/DRG）、心脏功能、心肌缺血面积和血清NE的变化，以评估针灸效果与TRPV1之间的关系。

**结果**
无论是肌肉层还是皮下层的针灸都能改善AMI大鼠的心脏功能、减少心肌缺血面积并降低血清NE水平，但肌肉层针灸的调节作用在AMI大鼠中更为显著。PC6注射Scc后再进行针灸可逆转针灸对AMI大鼠的调节作用。Western blot和IF结果显示，与AMI组相比，穴位区域的肌肉层TRPV1阳性面积、蛋白质表达以及DRG中激活的TRPV1阳性神经元显著增加；而使用Scc后再进行针灸时，穴位区域的肌肉层TRPV1阳性表达及DRG中激活的TRPV1阳性神经元显著减少。肌肉层注射TRPV1抑制剂后再进行针灸，与注射生理盐水组相比，穴位区域的肌肉层TRPV1阳性表达及DRG中激活的TRPV1阳性神经元显著减少，同时抑制了针灸对AMI大鼠心脏功能和心肌缺血面积的改善作用。

**结论**
PC6穴位的肌肉层是介导AMI针灸治疗效果的主要组织。穴位处针灸诱导的肌肉收缩是这一效果的关键环节：它上调穴位肌肉层中的TRPV1表达并激活C5–T1 DRG中的TRPV1离子通道。向穴位肌肉层微注射TRPV1抑制剂可逆转针灸在AMI大鼠中的心脏保护作用，证明穴位肌肉层中的TRPV1是启动针灸效果的关键介质。

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**引言**
针灸是一种源于中医的诊断和治疗方法。大量高质量的随机对照试验（RCT）和临床实践指南已证明了针灸的明确临床疗效[1,2,3,4,5]，但其作用机制复杂，不能仅用单一机制来解释。总体而言，针灸的效果可以分为三个阶段：“感觉-传导-效果”，即穴位区域的激活（感觉）——沿复杂神经途径的传导和整合——靶器官的调节（效果）[6]。穴位是针灸刺激的初始反应部位。穴位区域的激活是整个针灸效果三阶段过程的起点。揭示这一初始部位的作用机制至关重要。

针灸可产生酸胀、麻木、沉重感和胀满感，这些被称为“得气”，被认为是针灸治疗效果的关键因素。江振宇等人发现，当受试者在LI4和LI10穴位处感受到得气感时，观察到显著的镇痛效果。其他研究表明，针灸引起的得气感能显著减少慢性紧张型头痛患者的平均头痛天数[7]。在SP6穴位进行具有得气感的针灸可显著减轻因寒湿瘀滞引起的原发性痛经患者的月经疼痛，而未产生得气感的针灸组则无明显治疗效果[8]；孙R等人发现，与无得气感的针灸组相比，有得气感的针灸组显著改善了功能性消化不良患者的症状[9]。上述研究表明，获得得气感时针灸效果更好。得气感是一种主观感觉，但也伴随着一些客观反应，例如得气时穴位处的局部肌肉电放电[10]以及针具拉伸力的增加[11]。得气时穴位区域的肌肉电放电表明针灸引起了局部肌肉收缩。当肌肉收缩时，肌肉纤维与针具之间的紧密度增加，导致肌肉与针具之间的摩擦增大。当针具向上拔出时，针具的拉力也随之增大。因此，得气过程中的客观反应都与肌肉收缩有关。卢凤燕的研究还表明，得气时伴随的主要感觉（如胀满感、钝痛和酸胀感）以及操作者的手部沉重感主要来自肌肉组织。患者的胀满感通常与操作者的手部沉重感同时发生[10]，这表明针灸引起的肌肉收缩可能与得气及针灸效果有关。

**瞬时受体电位香草酸1（TRPV1）**最初被鉴定为一种温度敏感的离子通道，可被多种物理和化学刺激激活，如高温（T > 43°C）、质子（pH < 5.9）、催产素和多种炎症介质[12]。后续研究表明，机械刺激（如拉伸）也能激活该通道[13]。由于TRPV1位于细胞膜上，机械刺激可以改变脂质双层的张力，从而改变细胞膜的张力和TRPV1通道的开放状态，说明TRPV1是一种多感觉离子通道。研究显示，TRPV1主要分布于检测有害信号的Aδ和C纤维的神经末梢[14]，并在支配骨骼肌的IV型传入纤维中高度表达[15]。作为一种机械物理刺激，针灸可以诱导多种化学物质的局部释放[16]，如神经肽P[17]、前列腺素[18]、ATP[19]和IL-1β[20]。这些化学物质激活TRPV1通道，从而进一步传递针灸刺激信号并影响针灸的治疗效果。一些研究表明，在完全弗氏佐剂（CFA）诱导的小鼠中敲除TRPV1会减弱针灸的镇痛效果[21]；相反，其他研究发现向穴位区域注射TRPV1激动剂可模拟针灸的镇痛效果[22, 23]。这些研究表明，穴位区域的TRPV1介导了针灸的镇痛效果。然而，TRPV1在穴位处的局部作用是否普遍仍不明确，研究这一问题有助于阐明针灸 therapy 共同机制的底层原理。

**冠心病**是指由冠状动脉动脉粥样硬化引起的心脏病，导致血管狭窄或阻塞，进而引发心肌缺血、缺氧或坏死[24]。具体来说，急性心肌梗死（AMI）是这种疾病的严重形式，其特征是由于冠状动脉急性阻塞导致的心肌组织缺血和坏死[25]。患者通常表现为胸痛，常伴有呼吸急促、恶心和出汗。此外，AMI可导致一系列严重并发症，如心力衰竭、心源性休克和恶性心律失常，是临床实践中最常见的危及生命的心血管疾病之一[26]。针灸在治疗AMI方面显示出潜力。例如，针灸可以显著减少严重心绞痛患者发作的频率[27]，并且对PC6（内关）穴进行15分钟的针灸可以显著提高冠心病患者的左心室射血分数（LVEF）[28]；在心脏瓣膜置换手术前连续5天进行电针灸预处理（EAP）可以减轻心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）的严重程度[29]；针灸还可以降低经皮冠状动脉介入治疗后的心肌梗死发生率[30]。本研究将利用PC6穴的针灸平台来改善AMI大鼠的心脏功能，探索针灸过程中PC6肌层中TRPV1的作用。这将为TRPV1在穴位区域介导的效应提供来自另一种疾病模型的证据，同时也证明了其普遍作用。我们假设，由于“得气”感觉是在肌层产生的，因此对肌层的针灸比对皮下层的针灸具有更好的治疗效果。基于这一证据，我们认为TRPV1在肌层中更为活跃，从而增强了针灸信号的传递，并改善了AMI大鼠的心脏功能。

**材料与方法**

**实验动物**
6-7周大的雄性SD大鼠，体重190±20克，由北京 Vital River 实验动物技术有限公司提供[许可证号：SYXK (Tianjin) 2020–0005]。这些大鼠被安置在实验动物中心的动物护理设施中，处于受控条件下：温度维持在25±2°C，相对湿度为50-60%，并提供12小时的明暗周期。所有大鼠在实验前都接受了为期一周的单独适应。实验期间，大鼠可以自由摄取标准的实验室饲料和饮用水，并在卫生条件下生活。本研究严格遵循《实验室动物护理和使用指南》进行，并获得了天津中医大学的动物伦理委员会的批准（伦理批准号：TCM-LAEC2019062）。

**实验设计**

**实验1：**
由于对肌层的针灸更可能引发“得气”感觉，我们首先旨在调查针灸效果是否与这种差异相对应。使用Sprague–Dawley (SD) 大鼠建立AMI模型，并随机分成四组（每组6-7只）：(1) 对照组[仅进行假手术，不进行针灸]；(2) AMI组[进行AMI建模，不进行针灸]；(3) AMI+ACU-M组[进行AMI建模，并在PC6的肌层进行针灸]；(4) AMI+ACU-S组[进行AMI建模，并在PC6的皮下层进行针灸]。干预7天后，通过小型动物超声成像系统观察心脏功能的变化，通过2,3,5-三苯基四氮唑氯（TTC）染色检测心肌缺血面积，并使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测量去甲肾上腺素（NE）含量。这些评估旨在比较两种针灸干预方法的疗效。

**实验2：**
为了探讨正常的肌肉收缩功能是否影响针灸效果，在穴位局部施用肌肉松弛剂以诱导肌肉收缩力的丧失，随后观察其对针灸效果的影响，并同时检测局部穴位区域TRPV1的变化。SD大鼠被随机分成四组（每组6-7只）：(1) 对照+溶媒组[仅进行假手术，并在PC6注射0.9% NaCl，不进行针灸]；(2) AMI+溶媒组[进行AMI建模，并在PC6注射0.9% NaCl，不进行针灸]；(3) ACU+溶媒组[进行AMI建模，并在PC6注射0.9% NaCl，同时进行针灸]；(4) ACU+Scc组[进行AMI建模，并在PC6注射琥珀胆碱（Scc，肌肉松弛剂，0.75 mg/ml），并在PC6进行针灸]。假手术和AMI建模成功后，每组大鼠在PC6注射20 μl相应溶液。在注射后10分钟，在第(3)组和(4)组进行针灸。干预7天后，评估所有组的心脏功能并测量心肌缺血面积。此外，从每组收集PC6穴位区域和C5-T1节段背根神经节（DRG）的组织样本。使用免疫荧光（IF）和Western blotting（WB）检测PC6穴位区域和C5-T1 DRG中TRPV1的变化。

**实验3：**
本实验旨在评估穴位区域的TRPV1是否介导了针灸对AMI大鼠心脏功能的改善作用。SD大鼠被分成三组（每组10只）：(1) AMI+DMSO组[进行AMI建模，并在PC6注射二甲基亚砜（DMSO，TRPV1抑制剂）对照组，不进行针灸]；(2) AMI+DMSO+ACU组[进行AMI建模，并在PC6注射DMSO，随后进行针灸]；(3) AMI+CPZ+ACU组[进行AMI建模，并在PC6注射卡帕西嗪（CPZ，TRPV1抑制剂，0.5 mg/ml），随后进行针灸]。假手术和AMI建模成功后，每组大鼠在PC6注射20 μl相应溶液。注射后10分钟在PC6进行针灸。干预7天后，测量与实验2相同的指标，包括心脏功能、心肌缺血面积、PC6穴位区域和C5-T1 DRG中的TRPV1表达。

**动物模型**
手术前，大鼠禁食并禁水8小时。将它们放入麻醉诱导箱中，调节气体麻醉机中的异氟烷浓度至3-4%，氧气浓度约为2%。大鼠完全麻醉后，将其固定在手术台上，佩戴麻醉面罩。然后将异氟烷浓度维持在1.5%-2%。剃除胸部毛发，并用碘消毒位于心跳最强处的中线左侧约0.5厘米的位置。在该位置做一个长约1厘米的横向切口。钝性分离胸大肌和胸小肌以暴露肋骨。轻轻将弯曲的血管夹插入第四和第五肋骨之间，直到感觉到阻力消失，然后小心扩宽肋间隙以观察跳动的心脏。迅速暴露心脏，暴露左心房附肢和肺锥。在从左心房附肢到肺动脉的连线上，距离基部三分之一处确定结扎点。使用5-0号缝合针在大约0.1厘米深度和0.2厘米宽度处结扎心肌。在整个实验过程中使用标准II导联心电图（ECG）监测心脏活动。成功的模型建立可以通过观察心脏结扎段的变白、脉搏减弱以及ECG上ST段的显著向上弓形变化来确认[31]。然后迅速将心脏放回胸腔。移除麻醉面罩，一旦恢复自发的心跳和呼吸，缝合肌肉和皮肤层。

**针灸干预**
为了能够在清醒状态下进行针灸，设计了一种专门的大鼠固定背心以改善固定效果。本研究中针对的穴位是PC6，位于掌长肌和桡侧腕屈肌的肌腱之间，大约在手腕远端皱褶上方两个寸的位置[32]。PC6位置的底层肌肉包括桡侧腕伸肌、尺侧腕伸肌和共同指伸肌。建立AMI模型后，固定大鼠，并暴露双侧PC6穴位并用碘消毒。使用细针（0.25×13毫米；北京中岩泰和医疗设备有限公司）进行针灸。在AMI+ACU-M组中，针插入深度约为0.4厘米。当出现“得气”感觉时——操作者感觉到针周围的紧张感[33]，通过扭转技术操作针。每次扭转的幅度为360°，具体包括顺时针扭转360°后逆时针扭转360°。这样的双向运动称为一个扭转周期，扭转操作的频率为每分钟120周期。操作2分钟后保持针10分钟；这个过程重复一次，总针保留时间为20分钟。该治疗每天进行一次，连续7天。对于AMI+ACU-S组，针仅在皮下插入，不进行更深入的操作；其他所有程序与AMI+ACU-M组相同。对照组和AMI组的大鼠不接受针灸治疗。为了控制非治疗因素，这些动物也使用定制的背心固定20分钟，与针灸组处理方式一致。

**心电图记录**
麻醉大鼠后，将其置于仰卧位。设置PowerLab生理信号采集系统以监测心电图（ECG）。按标准II肢导联配置连接电极：将正极连接到左后踝，负极连接到右前肢腕部，GROUND电极连接到右后踝。在建模程序前后24小时都应记录ECG。ST段抬高≥0.2 mV被视为AMI建模成功。

**穴位注射药物**
**实验2**中使用的肌肉松弛剂是Scc，这是一种快速作用的去极化神经肌肉阻滞剂。它通过靶向神经肌肉接头的突触后膜上的烟碱型乙酰胆碱受体起作用，导致去极化阻滞。Scc常用于手术、支气管镜检查和食道镜检查等临床环境中。然而，大鼠高剂量皮下注射可能会对心脏、肾脏和肺等器官造成组织病理学损伤[34]。根据先前的毒性研究，大鼠的中位致死剂量（LD50）为1.59 mg/kg[35]，将Scc粉末溶解在0.9% NaCl中以达到0.75 mg/ml的浓度，每个部位注射20 μl。**实验3**中选择的TRPV1受体通道阻断剂是CPZ，这是一种竞争性辣椒素拮抗剂，也是影响感觉神经元的兴奋性化合物的合成类似物。剂量根据先前的小鼠研究转换为大鼠的等效肌肉注射剂量[36]。最终注射浓度为0.5 mg/ml，每个部位注射20 μl。

**超声心动图分析**
使用小型动物超声成像系统评估大鼠的心脏功能。将大鼠置于麻醉状态下，仰卧在成像平台上。剃除胸部毛发并涂抹超声耦合凝胶。最初选择B模式。将探头放置于心尖搏动区域，调整位置直至清晰显示心脏尖端和左心室流出道。然后切换到M模式，调整参考线以优化左心室前壁和后壁的可视化。参考线位于腱索和乳头肌之间，通过选择“SAVE CLIP”保存图像。这种超声心动图检查允许评估左心室舒张末期和收缩末期容积的变化，以及计算LVEF和左心室分数缩短（LVFS）。

**TTC染色**
干预7天后，对大鼠实施安乐死，迅速取出心脏并放入预标记的培养皿中，保持标准化方向。然后将培养皿转移到-20°C冷冻室中冷冻30分钟以固定心脏结构。随后，将样本储存在-80°C冷冻室中直至进一步处理。分析时，从-80°C冷冻室取出心脏组织，从心脏尖端到结扎部位均匀切成五片，每片厚度约0.2厘米。将切片浸泡在37°C的TTC染色溶液中20分钟，每隔5分钟轻轻搅拌一次。染色后，将切片取出并固定过夜。将固定的心脏切片按照从尖端到基部的顺序排列在黑色卡片上，保持均匀间距和一致的方向。使用智能手机在充足的光照下拍摄照片并保存以供分析。使用Image-Pro Plus分析软件评估心脏的缺血面积。缺血面积的计算公式为：（每个切片的缺血面积/同一切片的总心肌面积）× 100%。

**血清NE检测**
按照NE酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（泉州瑞鑫生物技术有限公司）的说明书进行具体操作。

**免疫荧光染色**
**穴位组织免疫荧光：**干预7天后，对大鼠实施麻醉并成功灌流4%的甲醛。使用无菌手术刀，从PC6穴位区域切取一块面积为0.5厘米×0.5厘米×0.5厘米的组织块，包括皮肤、皮下组织和肌肉层。将样本置于4%的组织固定液中，并存放在4°C下。DRG组织取样：同样，在干预后第七天，对大鼠进行麻醉并灌注4%的甲醛。确定C5到T1的脊柱节段，并收集相应的DRG组织。这些组织被放入4%的福尔马林溶液中，并在4°C下保存直至包埋。穴位组织和DRG组织均用石蜡包埋，切成0.7厘米厚的切片，干燥后脱蜡，并进行抗原修复。首先应用自动荧光淬灭溶液A处理30分钟，然后用蒸馏水清洗三次，每次5分钟。接着用5%的BSA封闭切片30分钟。应用一级抗体——抗TRPV1（1:400）和抗c-FOS（1:600），并在4°C下孵育过夜。第二天，将切片加热至室温30分钟，然后用PBS清洗五次，每次5分钟。之后应用二级抗体——山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor? 488，1:400）和山羊抗鼠IgG H&L（Alexa Fluor? 594，1:400），在暗处孵育50分钟，再清洗五次PBS。最后进行DAPI染色8分钟，然后用PBS清洗五次（每次5分钟）。加入适量的抗褪色封片剂，放置盖玻片。使用Leica荧光显微镜获取图像。使用ImageJ软件进行分析：量化穴位区域TRPV1的阳性表达面积，并计算共表达TRPV1和c-FOS的DRG神经元的比例，公式为（TRPV1?和c-FOS?神经元的数量）/（TRPV1?神经元的数量）×100%。所有统计分析均使用ImageJ计数工具完成。

**Western blot**穴位组织分析：干预后第七天，对大鼠施以安乐死。使用无菌手术刀从PC6穴位区域切取一块面积为0.5厘米×0.5厘米×0.5厘米的组织块，包括皮肤、皮下组织和肌肉层。将样本储存在-80°C下待后续分析。为了提取蛋白质，将穴位组织样本在蛋白质裂解缓冲液中均质化。使用BCA试剂测定总蛋白浓度。随后，将每个蛋白质样本的10 μL与5 μL的蛋白质梯度混合，并进行电泳。分离后，将蛋白质转移到膜上，然后用快速封闭缓冲液封闭10分钟并清洗。将膜在4°C下与一级抗体孵育过夜，接着用TBST清洗三次。应用二级抗体并在室温下孵育1小时，之后再用TBST清洗三次。使用ECL化学发光底物可视化蛋白质条带。使用ImageJ软件量化目标条带的灰度值。

**统计分析**数据使用SPSS 26.0统计软件进行分析。首先，对于组内配对比较（例如，同一组大鼠中的Pre-AMI与AMI），如果数据呈正态分布，则使用Paired t检验；否则，使用Wilcoxon符号秩检验。对每个实验组的每个结果变量进行正态性检验。对于组间比较（例如，Sham组、AMI组和针灸干预组之间的比较），在确认数据符合正态分布标准后，使用单因素方差分析（ANOVA）。进行方差同质性检验；如果方差同质，则使用LSD检验进行事后比较；如果方差异质，则使用Dunnett’s T3检验。P值小于0.05视为统计显著，P值小于0.01视为高度统计显著。

**结果**针灸在PC6的肌肉层对AMI大鼠的心脏功能改善效果优于皮下层针灸。为了确认AMI模型的成功建立，使用PowerLab生理记录系统收集大鼠的心电图（ECG）信号并进行后续定量分析。AMI模型建立后立即收集的ECG（图1A-B）显示，与AMI诱导前的基线ECG信号相比，ST段幅度明显升高。统计分析验证了ST段的升高是显著的，这符合成功建立AMI模型的标准，从而验证了本研究中使用的模型的可靠性。

**图1**
- PC6肌肉层针灸与皮下针灸对AMI大鼠心脏功能的优越效果。A. AMI前后大鼠的心电图代表图像。
- B. AMI前后大鼠ECG数据的分析（n=19，配对分析）。
- C. 大鼠心脏的超声心动图代表图像。
- D. 各组LVEF值的比较（n=6–7每组）。
- E. 各组LVFS值的比较（n=6–7每组）。
- F. 大鼠心肌缺血区域的代表图像。
- G. 不同干预方法对大鼠心肌缺血区域的影响（n=6–7每组）。
- H. 不同干预方法对大鼠血清NE水平的影响（n=5–7每组）。*P<0.05，**P<0.01

根据超声心动图（图1C）的结果，干预7天后，Sham组的大鼠左心室前壁增厚，收缩和舒张功能正常。与Sham组相比，AMI组左心室前壁明显变薄，收缩功能减弱。与AMI组相比，AMI+ACU-M组左心室前壁厚度显著增加，心室功能明显恢复。相比之下，AMI+ACU-S组左心室收缩和舒张功能有所恢复，但程度不如AMI+ACU-M组明显。

根据超声心动图（图1D-E）、TTC染色（图1F-G）和ELISA测定试剂盒（NE）检测的血清NE水平（图1H）的结果，干预7天后，AMI组的LVEF值和LVFS值显著降低，心肌缺血面积显著增加，血清NE水平升高；与AMI组相比，AMI+ACU-M组的LVEF值和LVFS值显著增加，心肌缺血面积显著减少，血清NE水平降低；与AMI组相比，AMI+ACU-S组的LVEF值增加，LVFS值没有显著变化，心肌缺血面积显著减少，血清NE水平没有显著变化。PC6的针灸改善了大鼠的心脏功能和心肌梗死面积，其中AMI+ACU-M组的表现更为显著。肌肉层针灸降低了AMI大鼠的血清NE水平并抑制了交感神经系统的兴奋性，而皮下针灸没有表现出这些效果。这表明针灸效果的关键部位是肌肉层。

**Scc穴位注射**
Scc穴位注射对正常大鼠和AMI大鼠的心脏功能、心肌缺血面积等没有影响（见附加文件1）。基于这一发现，超声心动图（图2A）显示，干预7天后，Sham+Vehicle组的左心室前壁厚度增加，收缩和舒张功能正常。与Sham+Vehicle组相比，AMI+Vehicle组的左心室前壁明显变薄，收缩和舒张功能受损。与AMI+Vehicle组相比，AMI+Vehicle+ACU组的左心室前壁厚度显著增加，心室收缩和舒张功能明显恢复。与AMI+Vehicle+ACU组相比，AMI+Scc+ACU组的左心室前壁明显变薄，收缩和舒张功能显著减弱。

**图2**
- Scc消除了针灸在AMI大鼠中的心脏保护作用。A. 针灸干预的AMI大鼠心脏的超声心动图代表图像。
- B. Scc穴位注射对AMI大鼠LVEF值的影响（n=6–7每组）。
- C. Scc穴位注射对AMI大鼠LVFS值的影响（n=6–7每组）。
- D. Scc穴位注射对AMI大鼠心肌缺血区域的影响（n=6–7每组）。
- E. Scc穴位注射对针灸治疗的AMI大鼠血清NE水平的影响（n=4–7每组）。*P<0.05，**P<0.01

根据超声心动图（图2B-C）、TTC染色（图2D-E）和ELISA测定试剂盒（NE）检测的血清NE水平（图2F）的结果，干预7天后：与Sham+Vehicle组相比，AMI+Vehicle组的LVEF和LVFS值显著降低，心肌缺血面积显著增加，血清NE水平升高；与AMI+Vehicle组相比，AMI+Vehicle+ACU组的LVEF和LVFS值显著增加，心肌缺血面积显著减少，血清NE水平趋势性降低；与AMI+Vehicle+ACU组相比，AMI+Scc+ACU组的LVEF和LVFS值显著降低，心肌缺血面积显著增加，血清NE水平趋势性降低。总体而言，这些结果表明Scc穴位注射可以逆转针灸对AMI大鼠心脏功能和心肌缺血面积的有益效果，以及针灸对交感神经兴奋性的抑制作用。

**Scc穴位注射后7天的干预**
- PC6区域的IF染色（图3A, B）、WB分析（图3C, D）和C5-T1段DRG的IF染色（图3E–G）显示以下结果：与Sham+Vehicle组相比，AMI+Vehicle组在穴位区域的肌肉层TRPV1蛋白表达没有显著变化。在DRG中，AMI+Vehicle组在C6段的TRPV1阳性神经元激活增加，C5或C7-T1段没有显著变化，DRG中TRPV1阳性细胞的总百分比也没有显著差异。与AMI+Vehicle组相比，AMI+Vehicle+ACU组在穴位区域的肌肉层TRPV1蛋白表达显著增加。在DRG中，这一组的C5-C8段TRPV1阳性神经元激活显著增加，TRPV1阳性细胞的总百分比也显著增加。与AMI+Vehicle+ACU组相比，AMI+Scc+ACU组在穴位区域的肌肉层TRPV1蛋白表达显著降低，穴位区域的肌肉层TRPV1阳性细胞的总百分比也显著降低。这些发现表明，在PC6穴位注射肌肉松弛剂可以逆转AMI大鼠穴位区域TRPV1的上调以及DRG中TRPV1的激活。

**图3**
- Scc抑制了AMI大鼠穴位和DRG中TRPV1的上调。A. PC6中TRPV1阳性表达的免疫荧光代表图像（比例尺：100μm，放大倍数：10×）。白色箭头表示肌肉层中的TRPV1阳性表达。
- B. Scc穴位注射对接受针灸治疗的AMI大鼠穴位区域TRPV1阳性表达的影响（n=4每组）。
- C. PC6注射对PC6中TRPV1蛋白表达的Western blot代表图像。
- D. Scc肌肉松弛剂注射对接受针灸治疗的AMI大鼠穴位区域TRPV1蛋白表达的影响（n=4–6每组）。
- E. DRG C5–T1段TRPV1和c-Fos的免疫荧光共染代表图像（比例尺：50μm，放大倍数：20×）。白色箭头表示TRPV1和c-Fos的共标记。PC6穴位注射Scc对AMI大鼠C5-T1段DRG中TRPV1神经元的影响（每组n=4）；Scc注射到穴位区域对接受针灸治疗的AMI大鼠DRG中TRPV1神经元的影响（每组n=4）。*P<0.05，**P<0.01

CPZ注射到PC6肌肉层会拮抗针灸对AMI大鼠心脏功能的改善作用。在穴位区域注射CPZ 7天后，与AMI + DMSO组相比，AMI + DMSO + ACU组在穴位区域的肌肉层中TRPV1蛋白表达显著增加（通过IF染色（图4A-B）和WB（图4C-D）确定），同时C5-T1段DRG中激活的TRPV1神经元比例及其总数也显著增加（图4E-G）。相比之下，与AMI + DMSO + ACU组相比，AMI + CPZ + ACU组在穴位区域的TRPV1蛋白表达显著降低（图4A-B染色和WB（图4C, D））。在C5-T1 DRG中，TRPV1阳性神经元的比例显著减少（图4E–F），激活的TRPV1神经元总数也显著减少（图4G）。这些结果表明，在PC6穴位注射CPZ可以逆转AMI大鼠DRG中TRPV1表达的上调及TRPV1神经元的激活。

图4：此图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像

CPZ抑制针灸诱导的穴位和DRG中TRPV1的上调。A. PC6穴位TRPV1阳性表达的代表性免疫荧光图像（比例尺：100um，放大倍数：10×）。B. CPZ注射到PC6对接受针灸治疗的AMI大鼠穴位区域TRPV1阳性表达的影响（每组n=4）。C. PC6中TRPV1蛋白表达的代表性Western blot。D. CPZ注射到PC6对接受针灸治疗的AMI大鼠穴位区域TRPV1阳性表达的影响（每组n=5–6）。E. C5–T1段DRG中TRPV1（绿色）和c-Fos（红色）的代表性免疫荧光共染图像（比例尺：50um，放大倍数：20×）。白色箭头表示TRPV1和c-Fos的共标记。F. CPZ注射到PC6对接受针灸治疗的AMI大鼠C5-T1段DRG中TRPV1神经元的影响（每组n=4）。G. CPZ注射到穴位区域对接受针灸治疗的AMI大鼠DRG中TRPV1神经元的影响（每组n=4）。*P<0.05，**P<0.01

根据超声心动图（图5A–F），与AMI + DMSO组相比，AMI + DMSO + ACU组的左心室前壁厚度显著增加，LVEF和LVFS值也显著升高。同时，心肌缺血面积百分比显著减少，血清NE水平显著下降，这表明了针灸对AMI的治疗效果。相比之下，与AMI + DMSO + ACU组相比，AMI + CPZ + ACU组的左心室前壁厚度变薄，LVEF和LVFS值降低，心肌缺血面积百分比增加，而血清NE水平没有显著变化。这些发现表明，在穴位注射TRPV1抑制剂可以逆转针灸对AMI大鼠心脏功能和心肌缺血面积的有益效果，但不影响针灸诱导的交感神经兴奋性的抑制。

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CPZ部分逆转了针灸在AMI大鼠中的心脏保护作用。A. 大鼠心脏的代表性超声心动图。B. CPZ注射到PC6对接受针灸治疗的AMI大鼠LVEF值的影响（每组n=10）。C. CPZ注射到PC6对接受针灸治疗的AMI大鼠LVFS值的影响（每组n=10）。D. 大鼠心肌缺血区域的代表性图像。E. CPZ注射到PC6对接受针灸治疗的AMI大鼠心肌缺血区域的影响（每组n=6）。F. CPZ注射到PC6对接受针灸治疗的AMI大鼠血清NE水平的影响（每组n=6）。*P<0.05，**P<0.01

讨论

穴位是针灸效果最初发生的部位，并调节随后的针灸效果。从局部穴位的角度探索针灸作用的机制有助于理解针灸疗法的共同特征，并为创新的穴位刺激方法提供见解。在这项研究中，我们比较了针灸对AMI大鼠皮下结缔层和肌肉层对心脏功能的改善效果，发现针灸对肌肉层的效果更显著。随后发现，针灸在PC6穴位可以上调TRPV1蛋白表达并激活DRG中的TRPV1神经元。然而，在穴位注射肌肉松弛剂琥珀胆碱（Scc）后进行针灸时，观察到TRPV1通路的激活减弱，针灸效果消失。进一步地，在穴位肌肉层注射TRPV1抑制剂CPZ后进行针灸，针灸效果也消失了。这表明穴位处正常骨骼肌的收缩功能是针刺刺激激活穴位区域TRPV1通道的必要条件。这一过程介导了PC6针灸对AMI大鼠心脏功能的改善作用，是穴位激活的机制之一。

众所周知，穴位的结构是三维的，包括皮肤、皮下筋膜、肌肉、神经、血管及相关细胞[37]。骨骼肌是穴位的重要组成部分，55%的穴位位于骨骼肌较厚的区域[38]。在针灸过程中，在穴位产生局部麻木、沉重和胀满感称为“得气”，这对实现治疗效果至关重要[39]。陆凤燕的研究表明，针灸在肌肉层产生的得气感比在皮下层更明显[40]。鉴于得气对治疗效果至关重要，这提出了一个重要问题：针灸在肌肉层的效应是否先于在皮下结缔组织层的效应。因此，在这项研究中，我们比较了针灸在不同组织层（皮下层和肌肉层）对AMI大鼠的治疗效果。超声心动图评估和心肌缺血面积定量数据显示，两种组织层都在不同程度上改善了AMI大鼠的心脏功能，其中肌肉层的针灸效果更为显著，这表明肌肉层是介导针灸效果的关键层。

收缩是肌肉的基本和核心功能。无论是骨骼肌、心肌还是平滑肌，这些肌肉类型的主要生理特性之一都是通过收缩产生力量或运动，从而实现各种生理功能[41]。针灸过程中的“得气”感觉引起的肌电信号是针灸的重要主观体验，也是其治疗效果的关键因素[10, 42]。一个关键问题是：如果肌肉收缩功能在针灸前受损，这是否会影响针灸的效果？为了解决这个问题，我们使用肌肉松弛剂Scc来松弛大鼠PC6处的骨骼肌。在这种肌肉松弛状态下进行针灸时，我们发现其改善AMI大鼠心脏功能的效果完全消失了。这一结果表明，穴位区域正常的骨骼肌收缩是介导针灸效果的关键因素。这是首次研究穴位局部肌肉的收缩功能与针灸效果之间的关系。同时，还检查了C5-T1 DRG中TRPV1阳性神经元的激活情况，观察到针灸增加了表达TRPV1的神经元的激活。DRG是躯体感觉神经元细胞体的所在地，而针灸刺激部位位于周围神经末梢。因此，DRG神经元的激活表明周围神经末梢被针灸刺激激活。这些发现表明，穴位区域的TRPV1离子通道是由针对肌肉层的针灸激活的。WB结果也显示穴位区域TRPV1表达增加。与此一致，Western blot分析也揭示了穴位区域TRPV1蛋白表达的增加。在针灸前预先在穴位注射Scc显著降低了DRG中表达TRPV1的神经元的激活。这一观察结果证实，正常的骨骼肌收缩是针灸诱导TRPV1激活的必要前提——即使在肌肉松弛的情况下，针灸也无法有效激活TRPV1。

为了进一步验证TRPV1在穴位肌肉层中的核心作用，进行了后续实验来探讨调节该区域TRPV1对AMI大鼠针灸治疗效果的影响。发现将TRPV1抑制剂CPZ微注射到穴位肌肉层可以部分逆转针灸对AMI大鼠心脏功能的改善效果。这一结果表明，穴位肌肉层中的TRPV1可能是触发针灸治疗效果的关键因素之一。

TRPV1是一种多感官离子通道，最初被鉴定为对热敏感的，后来发现它也对化学刺激有反应；它还被认为可以被机械敏感离子通道激活[13]。TRPV1主要表达在神经纤维的末端，并且还在多种细胞类型中表达[14]，包括平滑肌细胞、上皮细胞、血管内皮细胞和炎症细胞[43]。与单独针灸相比，在注射Scc后进行针灸会导致TRPV1激活显著降低，这证实了正常的肌肉收缩是针灸促进TRPV1激活的重要前提。从机制上讲，针灸引起的穴位区域骨骼肌的适当收缩增加了针灸针与周围骨骼肌之间的摩擦。在针灸过程中的针捻转或提插操作（针灸的关键手法）中，对周围组织施加的机械力（例如牵引和压缩）被放大。同时，肌肉收缩触发了几种化学分子的释放，这些分子增强了TRPV1通道的激活，尤其是ATP和H?。研究表明，肌肉收缩可以诱导骨骼肌细胞释放ATP[44]。释放的ATP直接作用于痛觉神经末梢，并与TRPV1的细胞内ankyrin重复结构域（ARD）结合，作为正变构调节剂降低TRVP1通道对其配体的激活阈值[45]。此外，ATP可以激活位于神经末梢的P2X3受体，从而启动下游Gq-PLC-PKC信号级联。这一途径使TRPV1通道磷酸化并使其对机械和化学刺激敏感[46,47,48]。此外，肌肉收缩还会导致局部氢离子（H?）的释放，使间质液pH值降低[49]。酸性环境是TRPV1的经典内源性激活条件。先前的研究已经证实H?离子可以直接与TRPV1通道 pore区域内的特定氨基酸残基相互作用，从而显著增加其开放概率[50]。基于这些发现，我们推测这种级联可能是针灸引起的肌肉收缩促进TRPV1通道激活的机制。

在当前研究中，我们没有测量穴位区域的ATP和H?水平，因此上述机制仍有待完全证实。在未来的研究中，我们将进行体内实验，通过测量针灸前后以及肌肉松弛剂注射前后穴位区域的ATP和H?浓度来验证针灸是否诱导肌肉收缩并随后触发ATP和H?的释放。还将进行体外实验，分离DRG神经元，研究ATP/H?对这些神经元钙流入的影响，以确定ATP/H?是否在DRG神经元中激活TRPV1。最后，通过基因敲除或敲低策略结合外源性ATP和H?灌注，或进行结合ATP降解和H?中和的针灸干预，我们将研究它们对DRG中TRPV1阳性神经元激活的影响以及与针灸相关的行为反应。这些实验将共同阐明针灸引起的肌肉收缩是否通过ATP和H?介导的信号通路促进TRPV1激活。

在心肌缺血期间，交感神经活动作为补偿机制被上调，导致心脏电传导紊乱[51]。这种兴奋状态的特点是在心肌缺血和心力衰竭的过程中，交感神经张力持续升高[52]。针刺PC6穴位已被证明可以改善急性心肌梗死（AMI）的心脏功能，这与抑制交感神经过度活跃有关[53,54,55]。与此机制一致，我们的研究发现，针刺PC6可以降低AMI大鼠的血清去甲肾上腺素水平。PC6在解剖学上位于手腕的掌侧（距离远端横纹2英寸处，介于掌长肌和桡侧腕屈肌腱之间）[32]。在大鼠中，PC6下方的肌肉（桡侧腕伸肌、尺侧腕伸肌和指总伸肌）由正中神经支配，这些神经纤维起源于C5–T1脊髓节段[56]。针刺诱发的肌肉收缩随后激活C5-T1背根神经节（DRG）中的TRPV1表达神经元，传入信号首先传递到脊髓背角，然后上升至脑干核团（包括孤束核[NTS]和腹外侧延髓[RVLM]）和下丘脑核团，从而重新平衡交感神经和副交感神经的张力[57]。最近的一项研究[58]表明，皮质-丘脑回路也参与了HT7穴位电针刺激后心肌梗死后交感神经功能的调节，而HT7穴位在解剖学上与PC6非常接近。此外，心脏的交感神经节前神经元分布于C8–T6脊髓节段，这与支配PC6的脊髓节段有部分重叠。因此，针刺诱发的传入信号可能通过脊髓内的信号转导直接调节心脏自主神经系统活动[59]。然而，这一机制仍缺乏直接的证实证据。

为了探讨穴位区域中的TRPV1通道是否介导针灸效应，此前已经进行了大量的相关研究：在完全弗氏佐剂（CFA）诱导的炎症疼痛小鼠中，TRPV1基因敲除显示针灸的镇痛效果减弱[21]；同时，其他研究表明向穴位注射TRPV1激动剂可以模拟这种镇痛效果[22, 23, 60]。这些主要集中在针灸引起的镇痛效应上的研究共同表明，穴位区域的TRPV1是针灸效应的关键介导因子。在本研究中，我们使用AMI大鼠作为实验对象，进一步证实了穴位骨骼肌中表达的TRPV1在针灸的心脏保护效应中起核心调节作用。基于上述研究，我们可以推断针灸引起的穴位区域TRPV1激活是针灸治疗效果的启动机制，并且这种机制在至少针灸引起的镇痛和心肌保护方面表现出一定的普遍性。

本研究存在几个局限性。首先，尽管本研究阐明了PC6穴位区域肌肉层中的TRPV1通道介导了针灸刺激后AMI心脏功能的改善，但TRPV1的上游和下游调节网络仍需进一步阐明[880]。第三，我们的结果表明，针对肌肉层的针灸在改善AMI相关的心脏损伤方面比针对筋膜层的针灸更有效，这可能为临床针灸治疗提供关于针灸深度的参考。然而，我们标准的针灸方案（连续七天每天一次）并未探讨不同刺激参数（如频率、持续时间和不同的针刺手法）对治疗效果的影响。这一限制制约了当前发现直接应用于个性化临床针灸方案的可行性。此外，本研究仅评估了7天观察窗口内的短期治疗效果，没有评估针灸对长期心脏功能恢复、心肌纤维化程度、存活率或AMI相关并发症（如心律失常）的影响。因此，观察到的治疗效果的长期稳定性和持久性及其临床适用性仍有待确定。未来的研究将进一步阐明TRPV1的上游和下游信号通路，有助于明确针灸信号如何在穴位局部启动，然后通过神经系统改善心脏功能。我们将进行参数优化研究，探讨不同刺激频率和针刺停留时间的组合如何调节TRPV1激活和心脏功能的改善，从而确定最佳的AMI针灸参数方案。此外，还将采用更长的观察周期来系统评估针灸的长期治疗效果。

总之，目前的研究表明，针对PC6（内关）穴位肌肉层的针灸在改善AMI模型大鼠的心脏功能方面比针对同一穴位皮下层的针灸更为有效。从机制上讲，本研究确定了两个介导针灸心脏保护效应的关键因素：首先，穴位肌肉层中TRPV1通道的激活是针灸疗效的核心中介；其次，穴位骨骼肌的正常收缩功能是这种TRPV1激活的必要前提。我们的发现为阐明穴位肌肉层中TRPV1介导穴位激活的机制提供了实验支持（图6）。进一步结合现有的关于TRPV1介导的炎症疼痛针灸效应的研究，这些结果表明，TRPV1介导的针灸疗效在不同疾病模型中表现出一定的普遍性，至少在针灸引起的镇痛和心肌保护方面是如此。

图6：穴位肌肉层中TRPV1介导的针灸效应激活机制（使用BioRender.com生成）