减毒活的Toxoplasma gondii RhΔtkl1和PruΔpp2a-c突变体是具有良好前景的疫苗候选者，能够在猪身上提供保护作用

《Infectious Diseases of Poverty》：Live attenuated RHΔtkl1 and PruΔpp2a-c mutants of Toxoplasma gondii are promising vaccine candidates conferring protection in pigs

　　**摘要**
**背景**
弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种顶复门寄生虫，几乎可以感染所有温血动物和人类，导致人畜共患的弓形虫病。感染了弓形虫的猪肉被认为是人类感染的重要来源。目前全球尚无针对猪弓形虫病的商业疫苗，因此迫切需要一种安全有效的疫苗。本研究评估了两种弓形虫基因敲除减毒菌株（RHΔtkl1和PruΔpp2a-c）在猪体内的免疫保护作用。

**方法**
将1×10^7个RHΔtkl1或PruΔpp2a-c减毒菌株的速殖子通过肌肉注射接种到猪体内，接种后28天（dpv）通过口服方式给猪接种1,000个孢子化的卵囊，随后在70 dpv时通过腹腔注射给予1×10^7个Pru菌株的速殖子进行二次攻击。监测临床症状，并使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测弓形虫特异性抗体水平。通过分析病理病变、病理评分、寄生虫负荷、脑囊肿负担以及小鼠生物测定来评估保护效果。使用GraphPad Prism软件进行对数秩（Mantel Cox）检验、Student’s t检验和单因素方差分析（ANOVA）。

**结果**
接种RHΔtkl1或PruΔpp2a-c的猪仅表现出轻微的发热。结合病理变化和病理评分，这些结果表明这两种菌株具有中等安全性。接种RHΔtkl1或PruΔpp2a-c并在随后接受弓形虫卵囊和速殖子攻击的猪体内，弓形虫特异性抗体水平显著升高，并持续了5周（P<0.01）。免疫后病理病变得到缓解，包括大脑、腓肠肌、背阔肌、腰大肌和膈肌在内的组织中的寄生虫负荷显著减少（P<0.01）。此外，脑囊肿负担也显著下降（P<0.0001）。小鼠生物测定结果证实，与未免疫组相比，接种后受到攻击的小鼠脑组织中弓形虫基因组DNA阳性的比例显著降低（P<0.0001）。

**结论**
这两种活减毒菌株RHΔtkl1和PruΔpp2a-c在猪体内表现出中等安全性、免疫原性和保护效果，使其成为潜在的猪弓形虫病候选疫苗。

**图形摘要**
弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种顶复门寄生虫，几乎可以感染所有温血动物和人类，导致人畜共患的弓形虫病。感染了弓形虫的猪肉被认为是人类感染的重要来源。目前全球尚无针对猪弓形虫病的商业疫苗，因此迫切需要一种安全有效的疫苗。本研究评估了两种弓形虫基因敲除减毒菌株（RHΔtkl1和PruΔpp2a-c）在猪体内的免疫保护作用。脑组织匀浆液首先被转移至一个15毫升的离心管中，然后沿着管壁小心地加入等体积的Ficoll-Paque? PREMIUM (1.084)（Merck KGaA，GE17-5446-02，德国）密度梯度介质。离心速度为1,750×g，持续30分钟。含有弓形虫囊囊的底层物质被小心吸出。通过显微镜检查并计数，以计算每个猪脑样本中的囊囊负担量[37]。

通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测弓形虫B1基因

使用TIANamp基因组DNA试剂盒（Tiangen Biotech，DP304-03，北京，中国）提取组织（包括大脑、心脏、腓肠肌、背长肌、腰大肌和膈肌）的基因组DNA以及弓形虫速殖子DNA。将溶解在蒸馏水中的DNA样本用于通过RT-qPCR扩增高度保守的B1基因来定量弓形虫DNA[38]。RT-qPCR使用正向引物F5′-AGGGACAGAAGTCGAAGGGG-3′和反向引物R5′-GCAGCCAAGCCGGAAACATC-3′[38]，扩增出164个碱基对的B1基因片段，使用SYBR Premix Ex Taq（Takara，大连，中国）进行扩增。扩增程序如下：95°C下预热10分钟，然后95°C条件下进行40个循环，每个循环15秒（变性），62°C下45秒（退火），72°C下30秒（扩增）。样本DNA通过使用SYBR Premix Ex Taq进行标准化处理，以获得CT值。随后，基于Lg（速殖子数量）和不同梯度速殖子的相应CT值，通过标准曲线分析确定寄生虫负荷量。

小鼠生物试验

G1、G3和G5组的小鼠用于生物试验的组织被分不同的组别。根据组织类型，收集的组织被分为以下几组：“大脑”（50克大脑）、“食物”（包含12.5克切块肉、腰部肉、左侧三头肌和左侧半腱肌的混合样本）以及“其他”（包含12.5克膈肌、心脏、舌头和咬肌的混合样本）[16]。这些组织使用之前描述的方法用酸/胃蛋白酶消化[39]。组织匀浆液在1,200×g下离心10分钟后，轻轻倒出上清液，将最终的沉淀物重新悬浮在3毫升无菌盐水中（其中含有400 μg/mL青霉素和400单位/mL链霉素）。六只小鼠每只腹腔注射400 μL的接种物。

在6周的生物试验结束后，存活的小鼠被安乐死。大脑被单独储存在含有1毫升PBS的无菌小瓶中，用于提取DNA。所有参与生物试验的存活小鼠的DNA均经过提取和PCR处理。如前所述[31]，通过针对弓形虫B1基因的PCR来确定小鼠大脑中是否存在弓形虫。

统计分析

实验数据为三次生物学重复实验的结果，使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software Inc，美国加利福尼亚州）进行分析。使用双尾非配对Student’s t检验来检验两组之间的差异显著性，包括抗体水平和寄生虫负荷量。Mantel-Cox对数秩检验用于确定生存曲线的差异。P<0.05被认为具有统计学显著性，P<0.01、<0.001、<0.0001表示不同程度的显著性。

通过免疫后和感染后的临床反应评估弓形虫敲除菌株在猪体内的保护效果

用弓形虫基因敲除减毒菌株RHΔtkl1和PruΔpp2a-c的速殖子免疫后，猪表现出轻微的厌食和嗜睡症状，持续两天，随后出现持续的低度发热（体温超过39°C），这种症状在整个14天的观察期内持续存在，而对照组则保持临床正常状态，精神状态良好，食欲正常，体温不超过39°C（图2A）。RHΔtkl1和PruΔpp2a-c敲除菌株在猪体内通常安全且耐受性良好，仅伴随短暂且轻微的不良反应。当用Pru菌株的卵囊感染后，G1、G3和G5组的猪在感染后两周内均出现了发热反应，表现为直肠温度超过39°C，其中最高温度超过了40°C（图2B）。

图2

此图像的替代文本可能由AI生成。

各实验组疫苗接种后和感染后的平均体温。灰色虚线表示猪的正常直肠温度。A. 用RHΔtkl1或PruΔpp2a-c速殖子接种后各实验组的平均猪体温。B. 用Pru弓形虫卵囊感染后各实验组的平均猪体温。

通过用RHΔtkl1和PruΔpp2a-c菌株免疫，猪体内产生了强烈的体液免疫应答

实验开始时，所有猪的弓形虫IgG抗体检测结果均为阴性。用RHΔtkl1菌株的速殖子免疫后，G1和G2组的猪血液中的抗弓形虫IgG抗体水平缓慢上升，并在最初的4周内保持阴性（图3A）。在疫苗接种后的第4周用Pru菌株的卵囊感染后，G1组的弓形虫特异性IgG水平急剧上升至阳性，在第6周达到峰值，并维持高水平2周，随后在第9周急剧下降并转为阴性（图3A）。在疫苗接种后的第10周用Pru菌株的速殖子进行加强免疫后，G1组的弓形虫特异性IgG水平在第12周达到极高水平，并在第17周仍保持高水平（图3A）。相比之下，G5组的抗体水平从第7周开始呈上升趋势。在疫苗接种后的第10周用Pru菌株的速殖子进行加强免疫后，抗体水平在第13周上升并转为阳性，并在第15周继续上升（图3A）。空白对照组G6在整个观察期间始终维持非常低且稳定的抗体水平（图3A）。用PruΔpp2a-c菌株的速殖子免疫后，G3和G4组的猪血液中的抗弓形虫IgG抗体水平上升，并在第4周检测呈阳性（图3B）。在疫苗接种后的第4周用Pru卵囊感染后，G3组的弓形虫特异性IgG水平继续上升，在第7周达到峰值，然后从第7周开始下降（图3B）。在疫苗接种后的第10周用Pru菌株的速殖子进行加强免疫后，G3组的弓形虫特异性IgG水平在第12周达到极高水平，并在第17周仍保持高水平（图3B）。值得注意的是，在第二次用Pru菌株的速殖子感染后，G1和G3组的弓形虫特异性IgG抗体峰值显著高于G5组（P<0.01）（图3）。

图3

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图3

疫苗接种和弓形虫感染期间猪血清中的IgG水平。ELISA用于检测用RHΔtkl1或PruΔpp2a-c速殖子接种后1-11周猪体内的弓形虫特异性IgG抗体水平。带箭头的垂直虚线表示猪被感染1,000个Pru弓形虫卵囊的时间点。水平虚线表示动物被分类为弓形虫血清阳性的时间点。A. 用RHΔtkl1速殖子接种的猪各实验组的弓形虫特异性IgG抗体水平。B. 用PruΔpp2a-c速殖子接种的猪各实验组的弓形虫特异性IgG抗体水平。

疫苗接种后猪体内产生的强体液免疫应答

实验开始时，所有猪的弓形虫IgG抗体检测结果均为阴性。用RHΔtkl1菌株的速殖子免疫后，G1和G2组的猪血液中的抗弓形虫IgG抗体水平缓慢上升，并在最初的4周内保持阴性（图3A）。在疫苗接种后的第4周用Pru菌株的卵囊感染后，G1组的弓形虫特异性IgG水平急剧上升至阳性，在第6周达到峰值，并维持这一高水平2周，随后在第9周急剧下降并转为阴性（图3A）。在疫苗接种后的第10周用Pru菌株的速殖子进行加强免疫后，G1组的弓形虫特异性IgG水平在第12周达到极高水平，并在第17周仍保持高水平（图3A）。相比之下，G5组的抗体水平从第7周开始上升。在疫苗接种后的第10周用Pru菌株的速殖子进行加强免疫后，抗体水平在第13周上升并转为阳性，并在第15周继续上升，到第17周仍在上升（图3A）。空白对照组G6在整个观察期间始终维持非常低且稳定的抗体水平（图3A）。用PruΔpp2a-c菌株的速殖子免疫后，G3和G4组的猪血液中的抗弓形虫IgG抗体水平上升，并在第4周检测呈阳性（图3B）。在疫苗接种后的第4周用Pru卵囊感染后，G3组的弓形虫特异性IgG水平继续上升，在第7周达到峰值，然后从第7周开始下降（图3B）。在疫苗接种后的第10周用Pru菌株的速殖子进行加强免疫后，G3组的弓形虫特异性IgG水平在第12周达到极高水平，并在第17周仍保持高水平（图3B）。值得注意的是，在第二次用Pru菌株的速殖子感染后，G1和G3组的弓形虫特异性IgG抗体峰值显著高于G5组（P<0.01）（图3）。

图3

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图3

疫苗接种和弓形虫感染期间猪血清中的IgG水平。ELISA用于检测用RHΔtkl1或PruΔpp2a-c速殖子接种后1-11周猪体内的弓形虫特异性IgG抗体水平。带箭头的垂直虚线表示猪被感染1,000个Pru弓形虫卵囊的时间点。水平虚线表示动物被分类为弓形虫血清阳性的时间点。A. 用RHΔtkl1速殖子接种的猪各实验组的弓形虫特异性IgG抗体水平。B. 用PruΔpp2a-c速殖子接种的猪各实验组的弓形虫特异性IgG抗体水平。

猪组织的病理变化

在G5组中，肝脏组织表现出肝细胞坏死和局灶性窦状血管充血（图4A）；多个肾小管出现轻度扩张，含有嗜酸性铸型和脱落的上皮细胞（图4B）；肺泡出现肺气肿，并在肺泡壁有粒细胞浸润（图4C）； hilar淋巴结的髓质显示广泛的淋巴细胞耗竭（附加文件1：图S1A）；脾脏组织显示血管平滑肌变性和窦状血管扩张（附加文件1：图S1B）；脑膜和脑实质显示轻度血管充血，许多神经元核呈现皱缩和染色加深（附加文件1：图S1C）。G1和G3组的组织病理学病变较轻微。G1、G3、G5和G6组猪的肝脏、肾脏、肺、 hilar淋巴结和脑组织的组织病理学评分显示在附加文件2：表S1-S6中。

图4

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图4

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猪器官和组织的组织病理学结果。这些器官（肝脏、肾脏和肺）是评估实验猪全身健康和病理变化的标准面板。A. 肝脏组织的组织病理学变化：黄色箭头表示轻度脂肪变性；紫色箭头表示炎症细胞浸润；红色箭头表示窦状血管充血；黑色箭头表示肝细胞坏死。B. 肾脏组织的组织病理学变化：黄色箭头表示Bowman囊内的嗜酸性物质；蓝色箭头指向肾小管上皮细胞的水肿性变性；紫色箭头显示肾小管内的嗜酸性物质和脱落的上皮细胞；黑色箭头表示肾小管的轻度扩张。C. 肺组织的组织病理学变化：紫色箭头表示炎症细胞浸润；蓝色箭头指向肺泡壁内的颗粒细胞浸润；橙色箭头显示肺泡壁增厚和肺泡间隔增宽；红色箭头表示间质血管充血；棕色箭头表示细支气管上皮细胞的变性。

用RHΔtkl1或PruΔpp2a-c免疫后脑囊形成的显著减少

对G1、G3和G5组猪的脑组织进行显微镜检查后，发现存在组织囊囊（图5A）。平均脑囊负担量分别为G1组250±10个，G3组230±11个，G5组575±13个。与未免疫的G5组相比，G1和G3组的平均脑囊数量显著减少（P<0.0001）（图5B）。

图5

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图5

各组猪脑组织中的脑囊以及囊囊计数的统计分析。A. 分别来自G1、G3和G5组的猪脑囊。B. 与未接种但感染的G5组相比，G1组（用RHΔtkl1速殖子免疫并感染）和G3组（用PruΔpp2a-c速殖子免疫并感染）的猪脑囊平均数量显著减少（****P<0.0001）。

用RHΔtkl1或PruΔpp2a-c免疫的猪体内弓形虫负荷量的有效减少

与未免疫的G5组相比，G1和G3组的脑组织中的弓形虫负荷量显著减少（P<0.01），并且使用RT-qPCR分析，G1组的弓形虫负荷量显著低于G3组（P<0.01）（图6A）。在心脏组织中，G1和G3组的弓形虫负荷量也显著低于未免疫的G5组（P<0.05），其中G1组的负荷量显著低于G3组（P<0.05）（图6B）。在腓肠肌组织中，G1和G3组的弓形虫负荷量显著低于未免疫的G5组（P<0.05）（图6C）。在背长肌组织中，G1和G3组的弓形虫负荷量显著低于未免疫的G5组（P<0.05）（图6D）。在腰大肌组织中，G1组的弓形虫负荷量显著低于G5组（P<0.05）（图6E）。在膈肌组织中，G1和G3组的弓形虫负荷量显著低于未免疫的G5组（P<0.05）（图6F）。

图6

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图6

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用1×10^7个RHΔtkl1或PruΔpp2a-c速殖子免疫的猪在感染后第120天，通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测脑（A）、心脏（B）、腓肠肌（C）、背长肌（D）、腰大肌（E）和膈肌（F）中的寄生虫负荷量。****P<0.0001，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05

生物试验后从小鼠大脑中检测到弓形虫DNA

所有接种组织消化物的小鼠都存活到了6周实验结束。在接种了G5组猪组织的小鼠中，有68.1%（49/72，95%置信区间57.3–78.8）的脑组织中检测到了弓形虫（T. gondii）DNA（见表2）；而接种了G1组猪组织的小鼠中仅12.5%（9/72，95%置信区间4.9–20.1）的脑组织检测到了弓形虫DNA，接种了G3组猪组织的小鼠中这一比例为19.4%（14/72，95%置信区间10.3–28.6），显著低于G5组（P<0.0001）（见表2）。表2显示了接种猪组织消化物后不同组小鼠脑内弓形虫DNA的流行率和变化情况。

讨论：猪肉是人类感染弓形虫的重要来源之一，这凸显了开发针对猪的弓形虫病疫苗的紧迫性，这类疫苗应专注于减少组织囊肿的负担[40]。本研究表明，使用活的减毒弓形虫菌株（RHΔtkl1或PruΔpp2a-c）进行疫苗接种可以成功且显著地减少免疫猪体内的感染性组织囊肿。此外，小鼠生物测定包括来自三个不同组织类别的接种——“食物”组织组（切块肉、里脊肉、左侧三头肌和左侧半腱肌）、“脑”组织组以及其他组织组（膈肌、心脏、舌头和咬肌），因为这些组织是人类最常食用的。小鼠生物测定一直是评估弓形虫组织囊肿活力的“黄金”标准[39, 41]。在之前的关于猪疫苗减少组织囊肿的研究中，小鼠生物测定是一个极其关键的研究组成部分。这些研究主要集中在显微镜下识别组织囊肿以及检测用于生物测定的小鼠体内的寄生虫DNA[8, 17, 42, 43, 44]。Burrells等人的一项研究中，结合使用小鼠生物测定和分子检测弓形虫DNA的方法，评估了使用不完整的S48菌株接种后，疫苗在减少猪体内组织囊肿负担方面的有效性。生物测定结果显示，所有接种了疫苗并随后受到M4菌株卵囊挑战的猪都存活了下来，而仅接种了未接种疫苗并受到挑战的猪中只有51.1%存活[16]。在我们的研究中，小鼠生物测定结果显示，接种了RHΔtkl1或PruΔpp2a-c疫苗的猪，并随后受到挑战的小鼠脑组织中的弓形虫DNA比例显著低于那些接种了未接种疫苗但受到挑战的小鼠（P<0.001）。Burrells等人的另一项研究表明，猪体内弓形虫的主要嗜好部位是大脑和高度血管化的肌肉（如舌头、膈肌、心脏和咬肌），而肉块（如切块肉、里脊肉、左侧三头肌和左侧半腱肌）中的弓形虫组织囊肿负担较低[16]。我们的研究结果进一步证实了这一发现，即在接种了未接种疫苗但受到挑战的猪的脑组织中检测到了最高比例的弓形虫DNA。在本研究中，尽管用Pru卵囊对猪进行挑战后，猪体内的弓形虫特异性IgG抗体并未达到阳性水平，这表明Pru卵囊挑战的效果并不理想。因此，小鼠生物测定的结果是基于用Pru速殖子对猪进行二次挑战得出的。

猪感染弓形虫后出现的临床症状因猪的品种和年龄、接种的弓形虫数量及其发育阶段以及弓形虫的接种途径而异[45]。感染弓形虫后，猪表现出发热、厌食和整体状况不佳等症状[46]。在本研究中，接种了Pru卵囊的猪出现了高烧，直肠温度超过40°C；而接种了减毒RHΔtkl1或PruΔpp2a-c菌株的猪则出现了低烧，伴随短暂的厌食和嗜睡，但症状很快消失。此外，根据组织病理变化和病理评分，与未接种疫苗但接种了Pru卵囊和速殖子的对照组相比，接种疫苗后再次接种Pru卵囊和速殖子的组在某些组织中的病理变化显著缓解。因此，减毒的RHΔtkl1和PruΔpp2a-c菌株在猪体内表现出一定的安全性和耐受性。

Burrells等人使用卵囊对猪进行挑战，两周后，这些猪的弓形虫IgG呈阳性[16]。在我们的研究中，接种了Pru卵囊的猪在随后的6周内弓形虫特异性IgG抗体一直呈阴性。这表明感染效果并不理想，可能归因于卵囊的毒力、实验程序或个体差异。随后，在实验的第10周，我们对猪进行了第二次弓形虫速殖子的挑战感染。第二次挑战后的第三周，弓形虫特异性抗体开始阳性。接种RHΔtkl1疫苗并在第4周再次接种Pru卵囊后，弓形虫特异性IgG抗体持续增加，在第6周达到峰值。相比之下，接种PruΔpp2a-c疫苗的猪在第七周IgG水平持续上升至峰值。在G1和G3组中，再次接种Pru速殖子后，弓形虫特异性抗体呈持续上升趋势，并保持高水平直到第17周。值得注意的是，尽管接种了RHΔtkl1疫苗的猪的弓形虫特异性IgG水平呈上升趋势，但在实验的前四周内抗体水平一直保持阴性。猪通过从活的弓形虫感染中恢复，表明它们产生了良好的保护性免疫力[47]。这与寄生虫菌株的生物学特性、敲除基因的功能差异以及猪的免疫反应特征有关[47]。弓形虫I型菌株RH在猪体内繁殖迅速但存活时间有限，导致组织囊肿形成较少，抗原刺激短暂，这可能影响了抗体的产生[47, 48]。此外，RHΔtkl1菌株倾向于诱导Th1型免疫反应，其特征是快速的细胞免疫反应，而体液免疫反应可能相对延迟[35]。尽管之前的猪弓形虫疫苗接种研究没有记录组织囊肿的显微镜观察结果[47, 49]，但在本研究中，在猪的脑组织中观察到了组织囊肿。而且，接种疫苗的组与仅接受挑战组的相比，脑囊肿数量显著减少（P<0.0001）。这一结果直接证明了疫苗接种能有效减少猪体内的组织囊肿形成。

通过针对弓形虫B1基因的RT-qPCR定量分析各种猪组织中的弓形虫负荷显示，G1和G3免疫组的弓形虫负荷显著低于未免疫的G5组。特别是在脑组织（P<0.01）和心脏组织（P<0.05）中，G1组的寄生虫负荷进一步显著降低。对于腓肠肌、背长肌和膈肌，G1和G3组相对于G5组的弓形虫负荷都有显著下降（P<0.05）。值得注意的是，只有G1组在腰大肌中的弓形虫负荷显著低于G5组（P<0.05）。RT-qPCR结果表明，减毒的RHΔtkl1菌株比PruΔpp2a-c菌株更有效。这两种菌株在减少猪体内组织囊肿形成方面都显示出显著效果。通过小鼠生物测定和组织囊肿定量比较评估表明，RHΔtkl1菌株在减少猪体内弓形虫负荷方面比PruΔpp2a-c菌株更为有效。

本研究存在一些局限性。首先，实验设计的一个局限性是在初次用Pru卵囊挑战后，未能实现预期的感染结果，这从弓形虫特异性IgG抗体反应中可以看出来。因此，随后进行了二次用Pru速殖子挑战。其次，使用有限的指标和参数评估了接种减毒弓形虫菌株后猪的体液和细胞免疫反应；更广泛和全面的指标和参数组合将有助于更全面地评估候选疫苗株的免疫效果。针对猪弓形虫病的疫苗研究面临许多挑战，包括弓形虫复杂的生命周期、其免疫逃避机制、菌株多样性、佐剂选择以及其他病原体的共感染问题。理想的猪弓形虫病疫苗应具有绝对的安全性、高效力，并能诱导持久的免疫反应。

结论：我们的研究表明，两种活的减毒弓形虫菌株RHΔtkl1和PruΔpp2a-c相对安全、具有免疫原性，并能显著保护猪免受Pru菌株卵囊和速殖子的挑战。抗体水平、病理变化、病理评分、寄生虫负荷、脑囊肿数量以及小鼠生物测定的数据共同表明，这两种活的减毒弓形虫菌株是潜在的猪弓形虫病候选疫苗。