RNA结合蛋白LIN28A介导神经元分化过程中的染色质动态变化

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：The RNA binding protein LIN28A mediates chromatin dynamics during neuronal differentiation

　　

胚胎干细胞（ESC）从多能状态向谱系定向的转变受染色质重塑以及转录和转录后过程的复杂调控机制支配。近期研究强调了这些机制之间的相互作用，揭示了需要进一步阐明的多层调控网络。本研究揭示了RNA结合蛋白LIN28A与ESC分化的表观遗传调控之间的新联系。LIN28A在神经定向的早期阶段上调，并在分化时经历从细胞核到细胞质的亚细胞定位转移。Lin28a基因敲除（KO）ESC的产生和分析显示，尽管这些细胞可以自我更新，但它们在向神经前体细胞分化时表现出明显的缺陷。然而，Lin28a KO细胞的中胚层和内胚层分化正常进行，表明LIN28A具有神经元特异性功能。蛋白质组学分析揭示了动态的、情境依赖的LIN28A相互作用组，在ESC和分化细胞中具有不同的推定相互作用伴侣集合。在ESC特异性的推定相互作用伴侣中，研究人员验证了LIN28A与Polycomb抑制复合物2（PRC2）成分的RNA依赖性关联，PRC2是一种负责沉积抑制性组蛋白修饰H3K27me3的关键染色质修饰复合物。染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）表明，LIN28A的缺失导致发育基因启动子上PRC2的持续占据，伴随着PRC2结合与H3K27me3沉积之间的部分解偶联。Lin28a KO导致的分化缺陷不能被PRC2酶活性的药物抑制所挽救，这表明LIN28A独立于H3K27me3沉积调节PRC2的染色质动力学。此外，研究人员鉴定了LIN28A与长链非编码RNA Neat1之间的相互作用，这可能作为促进PRC2从染色质上移除的支架。综上所述，研究结果揭示了LIN28A在调节PRC2介导的染色质动力学中的先前未被识别的作用，并强调了其在神经元分化表观遗传控制中的重要性。

该研究针对RNA结合蛋白LIN28A在胚胎干细胞（ESC）向神经元分化过程中的作用机制进行了深入探索。尽管已知LIN28A参与干细胞的多能性维持及代谢调控，但其是否直接参与表观遗传层面的染色质动态调控，特别是在神经谱系特化中的具体功能尚不明确。现有的研究多集中于LIN28A对microRNA（如let-7）的加工调控或其翻译调节功能，而关于其如何通过蛋白质相互作用影响染色质重塑的机制仍存在空白。为了阐明这一问题，研究人员利用CRISPR-Cas9技术构建了Lin28a基因敲除（KO）ESC模型，结合血清置换胚状体（SFEB）分化体系，发现Lin28a KO细胞虽能正常维持多能性，但在向神经前体细胞分化时出现显著阻滞，表现为神经标志物（如Sox1、Pax6）无法上调而多能性基因（如Oct4、Nanog）持续表达。这一表型具有谱系特异性，因为中胚层和内胚层的分化未受影响。进一步的分析表明，LIN28A在分化过程中发生核质转位，并在未分化ESC中与Polycomb抑制复合物2（PRC2）的核心及辅助亚基（如EZH2、SUZ12、JARID2）存在RNA依赖性的物理相互作用。染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）数据显示，LIN28A的缺失导致PRC2在发育基因启动子区域的异常滞留，且这种占据并不完全依赖于H3K27me3的沉积酶活性。通过RNA免疫沉淀（RIP）和邻近连接实验（PLA），研究人员证实长链非编码RNA Neat1作为分子支架介导了LIN28A与PRC2的关联。该研究最终构建了一个模型，即LIN28A通过与Neat1及其他RNA分子的协作，调控PRC2在染色质上的招募与解离平衡，从而确保在分化过程中发育基因能够被适时激活。此项研究揭示了RNA结合蛋白跨界调控表观遗传机器的新范式，发表于《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》。

研究人员主要采用以下关键技术方法：利用CRISPR-Cas9构建Lin28a KO ESC模型；基于质谱的蛋白质组学分析用于解析LIN28A在不同细胞状态下的相互作用组；染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）检测PRC2催化亚基EZH2及组蛋白修饰H3K27me3在全基因组范围内的分布；RNA免疫沉淀（RIP）结合实时定量PCR验证特定RNA与蛋白的结合；邻近连接实验（PLA）在空间上验证蛋白质间的相互作用；以及细胞分级分离和Western blot分析蛋白的亚细胞定位与修饰水平。

Lin28a在ESC分化过程中发生重新定位

研究人员首先分析了Lin28a在三种胚层分化过程中的表达谱。结果显示，在神经分化（SFEB法）过程中，LIN28A表达量在第4天达到峰值，随后下降，且其亚细胞定位从未分化ESC的核仁为主转变为分化细胞的胞质为主。细胞分级实验证实了这一核质分布的逆转。相比之下，在中胚层和内胚层分化过程中，LIN28A表达呈进行性下降趋势。这表明LIN28A的动态表达和定位可能与神经谱系形成有关。

Lin28a KO损害神经元分化

通过CRISPR-Cas9生成的Lin28a KO ESC在未分化状态下表现出正常的自我更新能力和多能性标志物表达。然而，在诱导其形成SFEBs时，KO细胞表现出严重的神经分化缺陷，表现为神经前体标志物（Sox1、Pax6）无法有效上调，且多能性因子（Oct4、Nanog）持续表达。免疫荧光显示KO SFEBs中Sox1阳性细胞比例显著降低。重要的是，外源性回补LIN28A能够挽救这一分化缺陷，且该表型具有谱系特异性，因为KO细胞的体外中胚层和内胚层分化能力未受显著影响。

LIN28A在未分化ESC中与PRC2相互作用

利用FLAG标签亲和纯化结合质谱分析，研究人员发现LIN28A在未分化ESC和分化SFEBs中具有截然不同的相互作用组。在未分化ESC中，LIN28A特异性地与染色质组织和重塑相关的蛋白簇相互作用，其中包括PRC2复合物的核心亚基（EZH2、SUZ12）和辅助亚基（JARID2、AEBP2）。Co-IP和PLA实验进一步验证了内源性LIN28A与PRC2各组分的直接相互作用。值得注意的是，这种相互作用依赖于RNA，RNase处理破坏了两者的结合。

LIN28A可以调节分化过程中PRC2与染色质的结合

研究人员探究了LIN28A缺失对PRC2功能的影响。Western blot显示Lin28a KO细胞中整体H3K27me3水平升高，但H3K4me3和H2AK119ub等其他表观标记物未受影响。ChIP-seq分析揭示，尽管Lin28a KO导致EZH2在分化细胞发育基因启动子处的占据显著增加，但H3K27me3的沉积与EZH2的结合并未完全耦合。使用PRC2特异性抑制剂GSK126处理未能挽救KO细胞的分化缺陷，表明LIN28A主要通过调节PRC2的染色质动力学而非其酶活性来发挥作用。

LIN28A与PRC2的相互作用是RNA依赖性的

进一步的机制研究表明，LIN28A与PRC2的关联需要RNA的参与。RNase处理消除了LIN28A对PRC2的共沉淀能力。研究人员还发现长链非编码RNA Neat1能够与LIN28A结合，且在Neat1沉默的条件下，LIN28A与PRC2亚基EED的空间邻近信号显著减弱。这提示Neat1可能作为分子支架，促进LIN28A-PRC2复合物的组装。

讨论部分总结指出，本研究揭示了LIN28A在ESC向神经元分化过程中的一个先前未知的功能，即通过RNA依赖的方式与PRC2互作，调节其在染色质上的动态分布。在野生型细胞中，当诱导分化时，EZH2会进行重新分布，从而允许发育基因被及时激活；相反，Lin28a KO ESC在多能性条件下表现出受限的EZH2占据，可能是由于破坏了解离/招募动态平衡。在分化过程中，这种失衡导致EZH2在发育基因启动子上的持续结合和广泛的异常招募，造成基因抑制并最终损害细胞正常分化。这一模型强调了RNA结合蛋白通过调节表观遗传机器的染色质动力学来精确控制细胞命运决定的重要性。