SDHI目标位点改变在Zymoseptoria tritici（小麦致病菌）群体中的传播及其导致的敏感性变化

《European Journal of Plant Pathology》：The spread of SDHI target site alterations and associated sensitivity shift in Zymoseptoria tritici population

　　**摘要**
本研究揭示了爱沙尼亚地区Zymoseptoria tritici种群中对SDHI类杀菌剂抗性动态的演变过程。虽然从2020年到2023年，该病原体对bixafen和fluxapyroxad的敏感性保持稳定，但在2024年出现了明显的敏感性下降趋势，这表现为EC50值中位数的上升以及具有SDH-C和SDH-B亚基有效突变的Z. tritici分离株数量的迅速增加。在爱沙尼亚的Z. tritici分离株中，C-N86S突变最为普遍，2023年的发生频率高达24.4%。其他三种SDH-C突变分别在2022年首次出现，其频率在2024年分别达到了C-T79N的17.1%、C-H152R的9.9%和C-W80S的3.9%。其中，C-H152R突变对fluxapyroxad和bixafen的敏感性影响最大。在SDH-B亚基中，B-T268I、B-I269V和B-N225T突变的发生频率较低。此外，还从爱沙尼亚的田间分离株中分离出了同时携带SDH-B和SDH-C突变的双重突变体。此类全面的长期监测至关重要，因为一旦抗性菌株形成，它们可能会获得选择优势并迅速在局部种群中占据主导地位，从而削弱有效的病害控制策略。研究结果进一步证实了欧洲的已有证据：尽管SDHI类杀菌剂在管理Septoria tritici叶斑病（STB）方面发挥着重要作用，但病原体的适应性增强正在降低这些杀菌剂的效力。

**引言**
由Zymoseptoria tritici引起的Septoria tritici叶斑病（STB）是小麦的主要叶部病害，尤其在北欧的温带气候条件下会造成显著的经济损失。在北欧的温带地区，由于Z. tritici导致的产量减少幅度可达到10%至40%，而在缺乏作物保护的情况下，这一比例可能更高（J?rgensen等人，2022年；Kildea等人，2023年）。除了农业措施和使用抗病品种外，主要依靠杀菌剂来控制Z. tritici。然而，欧洲各地Z. tritici种群中对杀菌剂抗性的出现使得未来的控制手段变得越来越困难。欧洲Z. tritici种群中杀菌剂抗性的空间分布和普遍程度存在差异，甚至在同一国家内部也存在地区性差异（Garnault等人，2019年；Heick等人，2017年；Kiiker等人，2021年；Kildea等人，2019年；Rehfus等人，2018年）。鉴于杀菌剂在控制STB中的关键作用，确保其持续有效性至关重要。

目前，大多数欧洲国家用于控制STB的杀菌剂策略主要针对14α-脱甲基酶抑制剂（DMI，如prothioconazole和mefentrifluconazole，属于FRAC 3组）、琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHI，属于FRAC 7组，如bixafen、fluxapyroxad、benzovindiflupyr和fluopyram）以及醌内抑制剂（QiI，属于FRAC 21组，目前仅有fenpicoxamid）。由于2000年代醌内抑制剂（QoI）的广泛使用，病原体细胞色素b中的G143A突变被选为抗性机制，这种突变阻止了QoI与真菌线粒体靶位点的有效结合（Fraaije等人，2005年）。如今，QoI抗性在整个西欧的Z. tritici种群中十分普遍（Garnault等人，2019年；Kildea等人，2019年）。

在过去四十年中，DMI类杀菌剂在欧洲的广泛使用导致当代Z. tritici种群对这些药物的敏感性显著下降（Garnault等人，2019年；Heick等人，2017年；J?rgensen等人，2020年；Klink等人，2021年）。大多数情况下，抗性源于14α-脱甲基酶靶位点的变化。S524T突变是最近发现的突变之一，存在于高度抗性的单倍型中（Huf等人，2018年）。随着DMI和QoI效果的减弱，控制STB的主要依赖对象转向了SDHI类杀菌剂。自2006年boscalid商业化以来，SDHI类杀菌剂开始被积极用于Z. tritici的防治，并在2010年代初期推出了更多同类产品。自此，这些杀菌剂成为欧洲谷物病害控制的重要组成部分（Rehfus等人，2018年；Turner等人，2021年；Yamashita & Fraaije，2018年）。所有商业化的SDHI类杀菌剂都作用于琥珀酸脱氢酶（SDH）复合体（复合体II或琥珀酸泛醌氧化还原酶）中的同一泛醌结合位点，该酶是三羧酸循环和线粒体电子传递链的关键组成部分（Avenot & Michailides，2010年）。SDH复合体由四个亚基组成：SDH-A、SDH-B、SDH-C和SDH-D（Ackrell，2000年）。抗性突变主要发生在SDH-B和SDH-C亚基中（FRAC，2025年）。长期使用特定类型的杀菌剂（如SDHI类）可能导致抗性菌株的产生，最终导致杀菌剂效力的快速下降。自引入以来，SDHI抗性一直受到持续监测。与唑类杀菌剂的情况类似，对SDHI类杀菌剂的依赖性增加逐渐促进了抗性Z. tritici菌株的选择和传播（Dooley等人，2016年；Hellin等人，2021年；Kildea等人，2025年）。2012年，法国和英国首次报告了Z. tritici对SDHI类杀菌剂失去敏感性的现象，德国在2013年也有类似报道，爱尔兰在2014年也有记录（FRAC，2025年）。类似地，其他植物病原真菌（如Botrytis cinerea、Alternaria alternata、Ramularia collo-cygni和Pyrenophora teres f. teres）也表现出对SDHI类杀菌剂的抗性，这些现象由不同SDH亚基中的突变引起（Avenot & Michailides，2010年；FRAC，2020年）。

对于Z. tritici而言，实验室和田间分离株中已发现多种导致SDH亚基氨基酸变化的突变，这些突变可引发SDHI抗性（Fraaije等人，2012年；Scalliet等人，2012年；Skinner等人，1998年）。FRAC发布的SDHI监测数据显示，2012年首先在法国和英国发现了对某些SDHI类杀菌剂具有中度抗性的单个分离株（C-T79N和C-W80S突变），随后在德国（C-N86S突变）和爱尔兰（B-N225T突变）也有发现（FRAC，2025年）。其中C-T79N和C-N86S突变在大多数受影响菌株中赋予了中等程度的抗性（Hellin等人，2021年；Rehfus等人，2018年）。这些突变对SDHI类杀菌剂田间效果的影响取决于其在每个种群中的普遍程度（J?rgensen等人，2022年）。C-H152R突变被发现可导致对所有主要SDHI类杀菌剂的完全抗性，其在Z. tritici田间种群中的出现频率较低：最初于2015年在爱尔兰被发现，随后在英国和法国北部、德国、荷兰也有零星发现，并向东扩散（Dooley等人，2016年；Gutiérrez-Alonso等人，2017年；Hellin等人，2020年，2021年；Kildea等人，2025年；Rehfus等人，2018年）。如果C-H152R突变在Z. tritici种群中占据主导地位，可能会导致基于SDHI的防治措施完全失效。然而，在2010年新一代SDHI类杀菌剂上市之前，多个地区就发现了高度抗性的菌株，这表明除了SDH蛋白靶位点突变外，其他非靶点抗性机制（如外排泵的过表达）也可能促进抗性的传播（Yamashita & Fraaije，2018年）。为了减缓Z. tritici种群中抗性的扩散，建议仅在病害造成经济损失时才施用叶面杀菌剂。在田间长期不当使用SDHI类杀菌剂可能会选择性地促进某些特定抗性菌株的增殖，并使其对多种SDHI类杀菌剂产生交叉抗性，从而复杂化病害管理。

根据爱沙尼亚农村研究与知识中心（METK）每年进行的冬小麦品种栽培试验，由Z. tritici引起的STB和由Pyrenophora tritici-repentis引起的褐斑病是爱沙尼亚冬小麦的主要叶部病害。STB的发生严重依赖于适宜的天气条件（最佳温度范围为15°C至25°C以及长时间的高湿度），2020年、2023年和2024年的生长季节这种条件尤为明显。本研究旨在分析2020年至2024年间爱沙尼亚Z. tritici种群对关键SDHI类杀菌剂敏感性的变化情况。在这五年期间，研究人员系统地从主要种植区收集了Z. tritici分离株。由于冬小麦频繁发生STB疫情及大量使用杀菌剂，该地区成为监测Z. tritici杀菌剂敏感性变化的代表区域。此类全面的长期监测至关重要，因为一旦抗性菌株形成，它们可能会获得选择优势并迅速在局部种群中占据主导地位，从而破坏有效的病害控制策略。

**材料与方法**
**田间采样与分离株收集**
从生长阶段为BBCH 71–83的商用冬小麦田中采集带有STB病斑的叶片样本。叶片样本随后风干并保存在室温下的纸封袋中，以待进一步处理。这些田块中施用了主要含有prothioconazole、tebuconazole、mefentrifluconazole、bixafen、fluxapyroxad、azoxystrobin和pyraclostrobin等成分的杀菌剂，剂量均达到产品标签推荐范围。采样区域覆盖了爱沙尼亚大部分小麦种植区（图1）。

**菌株保存与处理**
叶片样本被放置于含有湿润滤纸的Petri培养皿中，无需预先表面消毒。在室温下孵育24小时后，使用无菌针头将单个孢子囊的孢子转移到含有0.01%链霉素的土豆葡萄糖琼脂培养基上。20°C下、12:12光照-黑暗周期条件下孵育3–4天后，出现菌落。单个孢子囊分离株被保存在-80°C的20%甘油溶液中。2020年至2024年的五年期间，共收集并分析了915株Z. tritici分离株。

**杀菌剂敏感性测试**
使用FLX（fluxapyroxad）和BIX（bixafen）两种SDHI类杀菌剂的活性成分对Z. tritici种群进行了敏感性测试（LGC Dr. Ehrenstorfer，德国奥格斯堡）。孢子悬浮液通过刮取6天龄的Z. tritici孢子制备，然后将其转移到10毫升无菌去矿物质水中，并在15毫升Falcon试管中涡旋混合10分钟以实现均匀分布。孢子浓度调整至2.5×10^4个孢子/毫升。FLX和BIX分别用2×土豆葡萄糖培养基稀释至以下最终浓度：30、6、1.2、0.24、0.048、0.01、0.002、0毫克/毫升以及10、3.3、1.1、0.37、0.12、0.041、0.014、0毫克/毫升。每个96孔微孔板的每个孔中加入等量的Z. tritici孢子悬浮液和杀菌剂溶液（各100微升）。每个分离株进行两次重复实验。荷兰Z. tritici分离株IPO323被纳入每个测试中，作为对杀菌剂敏感的参考菌株（Kema & Silfhout, 1997）。微量滴定板用铝箔包裹，并在20°C的黑暗环境中培养六天。光密度（OD620）使用Tecan Sunrise?吸光度读取器（Tecan，M?nnedorf，瑞士）进行测量。每种杀菌剂的半最大有效浓度（EC50）通过GraphPad Prism版本9.0.2（GraphPad Software，La Jolla，CA，美国）进行非线性回归（曲线拟合）来确定。

**识别杀菌剂靶基因的突变**

为了提取DNA，将每个分离株的孢子在-50°C下使用FreeZone 2.5 L Benchtop Freeze Dryer（Labconco，堪萨斯城，美国）冻干20小时，然后在含有两颗3毫米玻璃珠的2毫升试管中，使用TissueLyzer II（Qiagen，杜塞尔多夫，德国）以24 Hz的频率均质化1分钟。DNA提取按照Qiagen的QIAcube? HT DNA提取器和DNeasy mericon 96 QIAcube HT Kit的制造商说明书进行（Qiagen – Kits手册）。

**sdhB和sdhC亚基的扩增和测序**

根据Fraaije等人（2012年）和Rehfus等人（2018年）的研究方法，使用相应的引物对sdhB和sdhC亚基进行扩增和测序。PCR扩增使用1 U DreamTaq DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，美国）、1× DreamTaq PCR缓冲液（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州）、0.2 mM dNTP、每种引物0.2 μM以及大约10 ng的模板DNA。扩增条件为：95°C加热5分钟，然后是35个循环，每个循环包括95°C 60秒、sdhB 53°C或sdhC 53°C 30秒、72°C 90秒，最后在72°C下延伸5分钟。PCR产物使用相同的引物通过Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer在塔尔图大学基因组学核心设施中进行测序。获得的色谱图经过手动整理，并使用Nucleotide BLAST（blastn）工具与GenBank数据库中的序列进行比较。本研究中鉴定出的所有爱沙尼亚Z. tritici sdhB和sdhC变体的序列已提交至GenBank（补充表1）。

**统计分析**

在分析之前，EC50值进行了对数转换，以近似正态分布并稳定方差。使用Q-Q图（Wilk & Gnanadesikan, 1968）评估转换后的数据的正态性。计算每个处理组的几何平均值和标准差。使用Levene检验（Levene, 1960）评估方差的齐性。使用Welch的t检验（Welch, 1947）进行组间几何平均值的成对比较。为了控制多重比较的家族错误率，使用Holm-Bonferroni顺序校正方法调整p值，统计显著性设为α=0.05（Holm, 1979）。对于野生型和SDH突变株分布的年度比较，也采用了Welch的t检验。然而，由于每一年都代表一个独立的种群采样事件，这些时间比较未应用多重检验校正。所有统计分析均在R语言（版本R-4.4.1，R Core Team，2024）中完成。

## 结果

### Z. tritici的杀菌剂敏感性

通过微量滴定板测定法评估了2020年至2024年间Z. tritici分离株对bixafen和fluxapyroxad的敏感性。2020年至2023年间，对bixafen和fluxapyroxad的敏感性保持稳定。然而，2020年首次出现bixafen的EC50值超过5 mg L^-1的异常值，而fluxapyroxad则是在2022年（图2）。与2020年至2023年相比，2024年的SDHI敏感性明显发生变化（图2）。2020年至2023年间收集的分离株的fluxapyroxad的几何平均EC50值范围为0.06至0.07 mg L^-1，而2024年这一值增加了8.3倍，达到0.49 mg L^-1（p<0.0001，平均值及相关统计数据见补充表2，每年杀菌剂敏感性分布见补充图1）。对于bixafen，2020年至2023年间收集的分离株的几何平均EC50值范围为0.06至0.11 mg L^-1，2024年增加到0.4 mg L^-1（从2023年增加了5.5倍，p<0.0001）。这些结果表明，与往年相比，2024年这两种杀菌剂的耐受性明显提高。

### 爱沙尼亚Zymoseptoria tritici分离株对SDHI杀菌剂的敏感性分布

图2展示了2020年至2024年间爱沙尼亚Zymoseptoria tritici分离株对SDHI杀菌剂（FLX：fluxapyroxad；BIX：bixafen）的敏感性分布。分离株根据EC50值（导致50%生长抑制的有效浓度）进行排序。数据显示了2020年至2024年的分离株数据。

### SDHI交叉抗性模式

通过绘制所有研究分离株的fluxapyroxad EC50值与相应的bixafen EC50值的图表（图3），分析显示bixafen和fluxapyroxad敏感性之间存在强烈的正相关（R2=0.9），表明Z. tritici群体中存在这两种杀菌剂之间的交叉抗性关系。

### SDHI靶位点改变的流行情况

对sdhB和sdhC基因进行测序，并分析可能影响杀菌剂敏感性的氨基酸改变。在爱沙尼亚Z. tritici分离株中最普遍的改变是SDHC-N86S，它在每个测试年份中都存在，频率在1.7%至24.4%之间（图4）。其他三种SDH-C的改变首次出现在2022年，其频率在2024年分别增加到C-T79N的17.1%、C-W80S的3.9%和C-H152R的9.9%（图4）。SDH-B中的改变B-T268I和B-I269V分别于2021年首次被检测到，并且在接下来的三年中这两种改变都有所增加，B-T268I从1.2%增加到5.5%，B-I269V从1.7%增加到3.3%（分别增加了4.3%和1.6%）。B-N225T的替代频率从2023年的0.5%增加到2024年的3.3%（图4）。

### SDHI抗性机制

随着时间的推移，Z. tritici分离株中SDH氨基酸替代的流行程度有所不同。然而，到2024年，超过一半的分离株携带有与抗性相关的替代基因（图4）。研究了SDH突变株数量的增加是否导致群体平均敏感性的变化（图2）。在Z. tritici野生型群体中（即没有导致敏感性降低的sdh基因突变的分离株），不同年份之间SDHI杀菌剂敏感性的最大显著差异为2.61倍（2023年和2024年的fluxapyroxad，p=0.003，所有年度比较见补充表3和补充表4）。当根据SDH蛋白中的改变进行分组时，2023年和2024年之间的分离株对bixafen（几何平均值变化10.9倍，p<0.0001）和fluxapyroxad（几何平均值变化14.2倍，p<0.0001）的敏感性出现了明显变化（图6）。

### 分析结果与野生型sdhB/sdhC基因变异体（Wt）和sdhB/sdhC基因变异体（Mut）的分离株比较

图6比较了2020年至2024年间具有野生型sdhB/sdhC基因变异体（Wt）的分离株与具有sdhB/sdhC基因变异体（Mut）的分离株的fluxapyroxad（A）和bixafen（B）敏感性。靠近标记的数字表示该组中的分离株数量。星号标记表示野生型组和突变组之间的统计学显著差异。

#### 对fluxapyroxad和bixafen敏感性影响最大的改变是C-H152R

C-H152R的改变对fluxapyroxad和bixafen的敏感性影响最大，其几何平均EC50值分别为14.31 mg L^-1和9.49 mg L^-1，与未改变变体的几何平均值相比，杀菌剂耐受性分别增加了272倍和137倍（图7，p值<0.0001，补充表5）。

#### B-T268I和B-I269V的改变

2023年和2024年分别有五个分离株同时携带B-T268I和B-I269V的改变。分析显示，这两个改变导致分离株对fluxapyroxad的敏感性降低（几何平均EC50分别为9.37 mg L^-1和3.42 mg L^-1，与野生型相比，杀菌剂耐受性分别增加了178倍和49倍）。两个携带B-I269V改变的分离株对fluxapyroxad的敏感性也降低（几何平均EC50分别为8.63 mg L^-1和50倍，但这种差异未能得到统计学验证）。携带C-T79N序列变体的分离株对两种测试的SDHI杀菌剂都更耐受。C-T79N序列变体的分离株对fluxapyroxad的耐受性提高了7.87倍，对bixafen的耐受性提高了3.04倍（分别与野生型相比，p<0.0001）。同样，携带C-W80S序列变体的分离株在fluxapyroxad和bixafen的敏感性上也表现出明显差异。

#### 其他改变

在我们的分离株集合中发现了三种SdhB改变（图4）。分析显示，B-T268I（几何平均EC50=0.73 mg L^-1）和B-I269V（几何平均EC50=0.47 mg L^-1）的改变导致对fluxapyroxad的敏感性降低。B-T268I突变体对fluxapyroxad的敏感性比野生型高272倍，B-I269V突变体对bixafen的敏感性高137倍（图7）。B-N225T的改变在两个分离株中同时出现，导致对fluxapyroxad的敏感性降低，但对bixafen的敏感性降低幅度较小（分别为164倍和50倍，但这种差异未得到统计学验证）。携带C-W80S序列变体的分离株对fluxapyroxad的耐受性提高了5.95倍（p=0.0358）。

#### 并发改变的组合

在我们的分离株集合中，有三个分离株同时携带B-N225T和C-T79N（2022年和2023年各2个分离株，2024年3个分离株）或B-T268I和C-N86S（2022年1个分离株）或B-I269V和C-N86S（2024年2个分离株）的改变。携带氨基酸突变C-H152R的Z. tritici分离株最初于2022年在爱沙尼亚种群中被发现（本研究），并在Kildea等人的研究（2025年）中得到报道，该研究从2022年的冬小麦叶片样本中鉴定出了抗性等位基因。值得注意的是，在这三年的时间里，C-H152R突变的传播率几乎增加了8倍，并且蔓延迅速（图4）。这些分离株对bixafen和fluxapyroxad表现出高度的抗性（图7），这突显了SDHI抑制剂在调控穗枯病（STB）方面的效力所面临的紧迫威胁。尽管C-H152R突变最初较为罕见，并被认为会带来适应性代价（Dooley等，2016年；Rehfus等，2018年），但其在比利时和爱尔兰多个田地中被频繁检测到的事实表明，在强烈的病害压力和杀菌剂选择作用下，这种适应性的代价可能会得到缓解（Hellin等，2021年；Kildea等，2025年）。本研究还发现了五种新的双突变体，它们同时具有SDH-B和SDH-C亚基的突变特征。2023年发现了两个携带B-T268I + C-N86S突变的分离株，2024年发现了分别携带B-N225T + C-T79N和B-I269 + C-N86V突变的分离株。所有这些双突变体对bixafen和fluxapyroxad的敏感性均有所降低。据我们所知，这是首次在欧洲田间种群中描述这类突变组合的研究。2015年，从爱尔兰的试验田中发现了两个携带C-H152R + D-R47W突变的分离株，它们对所有SDHI抑制剂都表现出极强的抗性，只有fluopyram除外（Dooley等，2016年）。然而，这些具有复杂SDH突变特征的分离株属于特例，目前尚未对病害管理构成显著威胁。

目前，在爱沙尼亚的Z. tritici种群中最常见的SDH突变是C-T79N和C-N86S，2024年分别有17%和18%的分离株携带这些突变（图4）。杀菌剂敏感性测试结果显示，C-T79N和C-N86S突变对降低bixafen和fluxapyroxad的敏感性具有相似的影响。C-T79N和C-N86S突变早在2016年就已在欧洲的Z. tritici田间分离株中出现（Rehfus等，2018年），但在爱沙尼亚，C-N86S首次被发现是在2019年（Kiiker等，2021年），C-T79N则是在2022年（本研究）。C-T79N和C-N86S突变是欧洲最常见的SDH突变类型，尤其在爱尔兰和英国的种群中频率最高，并且通常与对SDHI抑制剂的适度抗性相关（Hellin等，2021年；J?rgensen等，2022年；Kildea等，2025年；Rehfus等，2018年；Samils等，2021年）。地区性的病害压力、气候条件、农艺实践和杀菌剂使用方式的差异可能是导致爱沙尼亚Z. tritici种群中这两种突变频率不同于其他欧洲国家的原因。杀菌剂敏感性测试证实，尽管爱沙尼亚的Z. tritici种群总体上仍对SDHI抑制剂敏感，但随着抗性分离株比例的上升，未来这些抑制剂在田间的实际效果将受到威胁。这一趋势还得到了SDH-C突变类型区域差异的支持，这表明病原体可能已发生局部适应性进化。虽然抗性较低的分离株比例较低，但杀菌剂在田间的实际效果并未受到影响。

与SDH-C亚基的突变相比，SDH-B亚基中的B-N225T、B-T268I和B-I269V突变更为少见，但也导致了SDHI抑制剂的敏感性下降。B-N225T和B-T268I突变在其他国家也仅有零星报道（Rehfus等，2018年；Samils等，2021年），而B-T269V突变在其他欧洲Z. tritici种群中尚未被记录到。总的来说，这些发现为了解Z. tritici种群中SDHI抗性动态的变化提供了重要的区域性见解，为更广泛的欧洲流行病学研究提供了宝贵数据。这些发现进一步印证了先前的研究结果，即尽管SDHI抑制剂在面对广泛的唑类和QoI类抗性时仍发挥着关键作用，但适应性强的病原体种群正在不断挑战其效力。我们的数据表明，无论C-H152R突变或SDH-B + SDH-C突变组合可能带来的适应性代价如何，如果继续使用SDHI抑制剂，尤其是在持续的选择压力下以较低剂量施用，这些突变的传播率很可能会继续上升。建议每次喷洒时使用具有两种相同作用机制的杀菌剂混合物。由于bixafen和fluxapyroxad之间存在高度交叉抗性，轮换使用这两种杀菌剂并不能有效延缓抗性的产生。在高病害压力下，建议采用免耕或少耕种植方式来降低田间病害水平。这些结果强调了在整个爱沙尼亚和北欧地区实施综合抗性管理的紧迫性，包括合理使用杀菌剂、轮换作用机制以及采取全面的农业管理措施。未来的研究应进一步阐明抗性突变的适应性代价和非靶标位点抗性机制，以便为设计更加稳健、可持续的抗性管理框架提供依据。