蓝色LED光照对离体培养的柚子（Citrus grandis）果肉细胞中类胡萝卜素生物合成及基因表达的调控作用

《Journal of Plant Growth Regulation》：Blue LED Light and Stress-induced Modulation of Carotenoid Biosynthesis and Gene Expression in Juice Sacs of Pumelo (Citrus grandis) Cultured in Vitro

　　摘要
柑橘类植物中类胡萝卜素的生物合成受到发育信号和环境刺激的精细调控；然而，由于环境变化的复杂性，在植物体内阐明这些调控网络仍然具有挑战性。本研究利用来自‘Siam Red Ruby’和‘Benimadoka’两种柚子品种的果汁囊建立了一种体外培养系统，以在受控条件下研究环境因素对类胡萝卜素代谢的影响。在25°C的温度下进行为期四周的培养过程中，果汁囊表现出细胞增大但未形成愈伤组织的现象，并伴随着类胡萝卜素含量和基因表达的显著变化。蓝色LED光（470纳米峰值）、5%甘露醇和5%氯化钠的处理显著增强了主要类胡萝卜素的积累，如植醇、ζ-胡萝卜素、番茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、β-隐黄质、全反式 Violaxanthin 和 9-顺式 Violaxanthin。这些代谢变化伴随着类胡萝卜素含量和基因表达的显著变化，特别是关键合成基因（如 CitPSY、CitPDS、CitZDS、CitZISO 和 CitCRTISO）的上调。甘露醇和NaCl处理下的差异表达模式表明，可能存在不同的信号通路参与特定压力条件下类胡萝卜素代谢的调节。这种建立的体外系统为解析柚子类胡萝卜素生物合成的分子调控提供了可行的模型，并为通过环境调节提高类胡萝卜素含量和营养价值提供了宝贵的见解。

引言
类胡萝卜素是影响柚子（Citrus grandis）内部颜色的关键色素，其组成受多种因素影响，包括果实成熟度、生长地点和栽培期间的环境条件。这些因素导致不同柚子品种甚至不同柑橘物种之间的类胡萝卜素含量和组成存在显著差异（Kato等人，2004年）。在这些色素中，番茄红素在某些柑橘果实中赋予红色到粉红色的色调（Liu等人，2007年）。然而，仅有限数量的柑橘物种（如葡萄柚（Citrus paradisi）（Alquézar等人，2009年）和特定柚子品种（Tatmala等人，2020年）报告了显著的番茄红素积累。
‘Siam Red Ruby’柚子品种原产于泰国，并具有地理标志（GI）保护，以其深红色的果肉和独特的芳香特性而闻名。这种鲜艳的色素主要归因于番茄红素，其在完全成熟的果实中占总类胡萝卜素的93%以上。分子研究表明，这种强烈的番茄红素积累与关键类胡萝卜素合成基因（CitPSY、CitPDS、CitZDS、CitZISO 和 CitCRTISO）的表达上调以及分解基因（CitNCED2 和 CitNCED3）的表达下调有关（Tatmala等人，2020年）。另一个值得注意的品种‘Benimadoka’是‘Mato buntan’和‘Hirano buntan’（均属Citrus grandis Osbeck）的杂交种，同样具有红色的果肉（Yamada等人，1993年）。不同柚子品种的果肉颜色可以从淡粉色到深红色不等，这一特征直接影响其感官吸引力和商业价值。

植物中的类胡萝卜素生物合成是一个受严格调控的过程，受到发育阶段的影响，并对多种环境信号作出响应（Cazzonelli和Pogson，2010年）。在这些信号中，光照质量和糖分可用性已被确定为类胡萝卜素代谢途径的关键调节因素（Iglesias等人，2001年；Wu等人，2007年；Liu等人，2009年；Zhang等人，2012年）。先前的研究在柑橘物种（包括Satsuma mandarin、Valencia orange和Lisbon lemon）中表明，蓝光暴露和外源糖的应用可以增加果汁囊组织中的类胡萝卜素积累（Zhang等人，2012年）。此外，非生物胁迫（如盐处理，例如氯化钠）已被证明可以调节番茄和辣椒等园艺作物的类胡萝卜素水平（Bouvier等人，1998年；Fernández-García等人，2004年；Sá等人，2017年）。尽管取得了这些进展，但对于柚子类胡萝卜素代谢对这些环境因素的具体反应仍知之甚少，特别是在分子水平上。

体外培养系统通过最小化外部变异性并允许精确调控培养基组成和环境参数，为在受控条件下研究植物发育提供了有价值的平台。先前的研究已经报道了使用各种组织类型成功培养柑橘物种（Mukai等人，2000年）。本研究使用来自‘Siam Red Ruby’和‘Benimadoka’两种柚子品种的果汁囊，探讨了特定环境信号对类胡萝卜素代谢的影响。值得注意的是，在这两种品种的果汁囊中观察到类胡萝卜素的积累，且没有引发愈伤组织的形成。该系统被用来评估蓝色LED光、甘露醇和氯化钠对类胡萝卜素组成及相关基因表达的影响。研究结果为理解柚子类胡萝卜素积累的调控机制提供了新的见解，并为通过针对性环境调节提高这种水果的营养价值提供了潜在的应用策略。

材料与方法
**植物材料**
本研究使用‘Siam Red Ruby’（Citrus grandis）和‘Benimadoka’（Citrus grandis Osbeck）柚子的果汁囊建立了体外培养系统。在果实坐果后150天，随机从柑橘树上采集直径在13至15厘米之间的未成熟果实。将样本运送到泰国Thaksin大学技术与社会发展学院的植物科学实验室。‘Benimadoka’柚子品种来自日本的Fujieda农场。对于每个果实，仔细将果肉与果皮和白色果芯分离，然后置于-80°C下保存，以保持类胡萝卜素化合物的稳定性和防止RNA降解。

**体外培养系统及处理**
培养过程采用Zhang等人（2012年）的方法进行。使用添加了10% w/v蔗糖和1% w/v琼脂（pH 5.7）的Murashige和Skoog（MS）培养基。从内果皮（包裹种子的果实内部部分）中取出果汁囊，直接放置于22 × 120 mm的培养管中的10 mL培养基中。这些果汁囊在25°C下，在50 μmol m?2 s?1的蓝色LED光照强度下培养四周，光照周期为16小时/8小时（光/暗）。

选择甘露醇和氯化钠作为胁迫因子，分别模拟渗透压和盐度胁迫条件，这些是在柑橘生产区域普遍存在的环境挑战。甘露醇被用作不可代谢的渗透剂，以区分渗透效应和糖信号作用。对于氯化钠（NaCl）处理，将内果皮侧暴露的果汁囊放置在添加了5% w/v NaCl的MS培养基上培养四周。 Similarly，对于甘露醇处理，将外植体放置在添加了5% w/v甘露醇的MS培养基上培养四周。在黑暗中培养四周的果汁囊作为对照组。每种处理后，果汁囊迅速用液氮冷冻，然后储存在-80°C直到进一步分析需要时。

**类胡萝卜素提取与定量**
类胡萝卜素水平通过高效液相色谱（HPLC）在三次独立实验中测定，遵循Kato等人（2004年）描述的方法。我们量化了三种不同柑橘物种果汁囊中的多种类胡萝卜素，包括植醇、ζ-胡萝卜素、番茄红素、β-胡萝卜素、β-隐黄质、全反式 Violaxanthin、9-顺式 Violaxanthin、α-胡萝卜素和叶黄素。为此，将果汁囊样本用己烷、丙酮和乙醇（体积比50:25:25）的混合物研磨，然后加入碳酸镁进行离心处理（4,000 rpm，20分钟），分离出含有色素的己烷层并干燥。
干燥后的提取物用含有0.1% w/v丁基化羟基甲苯（BHT）的 ether重新溶解，并在20% w/v甲醇KOH存在下过夜皂化。皂化后，使用NaCl饱和水去除提取物中的水溶性物质。随后，使用乙醚从无水Na2SO4中洗脱类胡萝卜素化合物，然后蒸发乙醚至干。剩余的类胡萝卜素化合物用TBME（叔丁基甲基醚）和甲醇（体积比1:1）溶液溶解，其中也含有0.5% w/v BHT。
对于HPLC分析，每种样品取20 μL注入反相HPLC系统（Jasco），配备YMC Carotenoid S-5柱（250 × 4.6 mm，Waters，Milford，MA），流速为1 mL/min。使用光二极管阵列检测器（MD-910，Jasco）监测洗脱过程。根据Kato等人（2004年）描述的方法，应用三种梯度洗脱程序来鉴定样品中的类胡萝卜素。通过比较保留时间和吸收光谱与标准品来识别峰，浓度以每克鲜重的微克数表示。

**RNA提取**
从不同发育阶段的‘Siam Red Ruby’柚子（Citrus grandis）冻干果肉组织中提取总RNA，采用基于Ikoma等人（1996年）的改进方案。简要来说，将0.5 g样品在液氮中研磨，然后在酚：氯仿：3-甲基-1-丁醇（体积比25:24:1）和含有0.5 M EDTA及1.5 M Tris-borate的裂解缓冲液中均质化。将均质液在4°C下以3,000 × g离心30分钟。回收水相，并用相同的有机溶剂重新提取两次，以确保彻底去除蛋白质和其他污染物。随后，将澄清的水相与0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5 M醋酸钾混合，再与等体积的氯仿：3-甲基-1-丁醇（体积比49:1）混合以去除残留的酚。然后使用3 M氯化锂（LiCl）在-20°C下过夜沉淀总RNA。收集RNA沉淀物，洗涤后重新悬浮在无核酸酶的DEPC处理水中。为了进一步纯化和去除潜在的基因组DNA污染，根据制造商说明书使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，Hilden，德国）处理RNA样本。

**基因表达分析**
使用TaqMan?逆转录试剂（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）和随机六聚体引物，从2 μg总RNA中合成第一链cDNA，遵循制造商的方案。逆转录反应在37°C下进行60分钟，总体积为20 μL。定量实时逆转录PCR（qRT-PCR）使用StepOnePlus? Real-Time PCR系统（Applied Biosystems）进行三次重复实验。使用的基因特异性引物和TaqMan? MGB探针针对CitPSY、CitPDS、CitZISO、CitZDS、CitCRTISO、CitLCYb1、CitLCYb2、CitLCYe、CitHYb、CitHYe、CitZEP和CitNCED2及CitNCED3，具体方法如Ma等人（2013年；2016年）所述。每个20 μL反应混合物包含900 nM的每个引物、250 nM的相应TaqMan? MGB探针和合成的cDNA模板。热循环条件如下：初始变性在95°C下10分钟，随后进行40个循环，每循环95°C 15秒和60°C 60秒。使用StepOnePlus?软件量化基因表达水平，并以18S核糖体RNA基因作为内部参考进行归一化。

**统计分析**
所有数据以三次独立实验的平均值±标准误差（SE）表示。统计分析使用Tukey的诚实显著差异（HSD）检验在P<0.05的水平上进行，以比较均值。计算工作使用的是JMP软件（SAS Institute，卡里，北卡罗来纳州）。

结果
“Siam Red Ruby”和“Benimadoka”柚子汁囊在体外培养条件下的形态和生理变化
为了研究蓝光LED、5% NaCl和5%甘露醇对类胡萝卜素积累的影响，将“Siam Red Ruby”和“Benimadoka”柚子品种的汁囊在25°C下置于不同的处理条件下培养四周。如图1所示，两种品种在整个培养期间都表现出明显的组织膨胀，且没有形成愈伤组织。到了第二周和第四周，暴露于蓝光LED、NaCl或甘露醇的汁囊颜色比对照组更深粉，而对照组则保持较浅的粉色调。
图1
（此图像的替代文本可能是通过AI生成的。）

“Siam Red Ruby”和“Benimadoka”柚子品种汁囊在体外培养条件下的形态变化

蓝光LED和压力处理对“Siam Red Ruby”和“Benimadoka”汁囊中类胡萝卜素积累的影响
在本研究中，从“Siam Red Ruby”和“Benimadoka”柚子品种的汁囊中鉴定出了九种类胡萝卜素，包括植烯、ζ-胡萝卜素、番茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、β-隐黄质、全反式 Violaxanthin 和 9-顺式 Violaxanthin 以及叶黄素。在整个实验期间，每两周监测一次类胡萝卜素的水平和谱型。如图2和图3所示，与对照组相比，在蓝光LED、5% NaCl和5%甘露醇处理下，大多数类胡萝卜素的积累量都有所增加，包括植烯、ζ-胡萝卜素、番茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、β-隐黄质、全反式 Violaxanthin 和 9-顺式 Violaxanthin。相比之下，叶黄素含量在这些处理下略有下降。在所有测试条件下，蓝光LED处理诱导了最高的总类胡萝卜素积累，并且使得“Siam Red Ruby”和“Benimadoka”柚子的类胡萝卜素谱型更加多样化。
图2
（此图像的替代文本可能是通过AI生成的。）

不同条件下“Siam Red Ruby”柚子汁囊中类胡萝卜素含量和组成的体外分析：平均值±标准误差（SE），统计显著性在P<0.05水平

蓝光LED和非生物胁迫处理下“Siam Red Ruby”和“Benimadoka”柚子汁囊中类胡萝卜素生物合成基因表达的调控
为了研究蓝光LED和非生物胁迫诱导的类胡萝卜素积累背后的转录反应，使用实时定量RT-PCR技术评估了参与类胡萝卜素生物合成（CitPSY、CitPDS、CitZISO、CitZDS、CitCRTISO、CitLCYb1、CitLCYb2、CitLCYe、CitHYb、CitHYe 和 CitZEP）和降解（CitNCED2 和 CitNCED3）的关键基因的表达谱型。如图4和图5所示，与对照组相比，“Siam Red Ruby”和“Benimadoka”柚子汁囊中CitPSY、CitPDS、CitZISO、CitZDS和CitCRTISO的表达水平在所有处理条件下均显著升高。此外，响应蓝光LED、5% NaCl和5%甘露醇处理时，CitLCYb2、CitHYb、CitHYe、CitZEP、CitNCED2和CitNCED3的表达同时上调。值得注意的是，NaCl处理特别增强了CitLCYe的表达，而甘露醇处理导致两种品种的CitZDS表达显著增加。这些发现表明，生物合成和分解途径都受到环境信号的转录调控，从而影响了类胡萝卜素含量的变化。
图4
（此图像的替代文本可能是通过AI生成的。）

不同条件下“Siam Red Ruby”柚子汁囊中类胡萝卜素代谢途径的基因表达谱型：数据显示为三次重复实验的平均值±标准误差（SE），不同字母表示统计显著性（P<0.05）

不同条件下“Benimadoka”柚子汁囊中类胡萝卜素代谢途径的基因表达谱型：数据显示为三次重复实验的平均值±标准误差（SE），不同字母表示统计显著性（P<0.05）

讨论
植物中的类胡萝卜素生物合成是一个高度调控且动态的过程，受到发育信号和环境因素的共同影响（Cazzonelli和Pogson 2010）。由于自然条件的变异性和体内系统的复杂性，在田间种植的水果中进行这类研究具有挑战性。为了克服这些限制，本研究利用体外培养系统在明确且可控的环境条件下研究了柚子汁囊中的类胡萝卜素积累。这种方法能够分离出特定的因素，如光照和渗透胁迫，同时将外部变异性降到最低。
在该系统中，“Siam Red Ruby”和“Benimadoka”两种柚子的汁囊都表现出逐渐的组织扩张和类胡萝卜素的积累，且在培养期间没有观察到愈伤组织的形成。受控环境使得可以详细监测类胡萝卜素成分随时间的变化。四周后，发现两种品种之间的番茄红素含量存在显著差异，“Siam Red Ruby”积累的番茄红素（25.5 μg g?1 FW）明显多于“Benimadoka”（9.13 μg g?1 FW）。这种显著差异表明，品种特异性的调控机制参与了类胡萝卜素生物合成途径的调节。
“Siam Red Ruby”中较高的番茄红素水平可能反映了早期类胡萝卜素生物合成的增强或番茄红素转化为下游黄酮类化合物的减少。先前的研究表明，随着柑橘类水果的成熟，类胡萝卜素的组成倾向于从β,ε-胡萝卜素转变为β,β-黄酮类化合物，如Violaxanthin和Zeaxanthin，尤其是在果肉和汁囊中（Kato等人2004；Alquézar等人2008）。 “Siam Red Ruby”中番茄红素的持续存在可能是由于番茄红素β-环化酶的活性或表达降低，这种酶负责将番茄红素转化为环状类胡萝卜素。
这些基因型依赖的类胡萝卜素谱型不仅影响了柚子果肉的色素特性，还对其营养价值和消费者吸引力具有潜在影响。“Siam Red Ruby”柚子中番茄红素的积累不仅提升了水果的视觉质量，还因其代谢产物的生物活性而具有潜在的健康益处（Lindshield等人2007）。更全面地理解类胡萝卜素生物合成网络中的转录调控和酶活性对于解释这种多样性至关重要。这样的见解可以通过选择性育种或优化栽培技术来促进柚子果实中类胡萝卜素的积累。
本研究证明，暴露于蓝光（峰值波长：470 nm）增强了“Siam Red Ruby”和“Benimadoka”柚子品种的总类胡萝卜素积累。在其他物种中也记录了类似的光响应模式；例如，Wu等人（2007）观察到豌豆幼苗在蓝光处理后β-胡萝卜素水平升高。同样，在番茄果实中，光照被证明可以刺激番茄红素的合成并增加总类胡萝卜素含量（Liu等人2009；Schofield和Paliyath 2005）。类胡萝卜素生物合成的光调控性质部分由光敏色素信号介导，特别是影响植烯合成酶（PSY）的表达，该酶催化类胡萝卜素生物合成途径的第一步（Alba等人2000；Von Lintig等人1997）。支持这一点的是，Bohne和Linden（2002）报告称蓝光有效上调了Chlamydomonas reinhardtii中的PSY表达，而红光则影响较小。在当前实验中也观察到了类似的调控趋势：蓝光显著诱导了两种柚子品种（“Siam Red Ruby”和“Benimadoka”）中CitPSY的表达，这与观察到的类胡萝卜素含量增加一致。这表明蓝光可能通过转录激活CitPSY来促进柚子中的类胡萝卜素生物合成。

长期以来，人们一直认为糖类与促进柑橘类果实中类胡萝卜素的积累和加速颜色发展有关（Huff 1983；Iglesias等人2001）。除了作为代谢底物外，糖类现在也被认为是影响基因表达和调节植物多种生理过程的信号分子（Foyer等人1997；Loreti等人2005）。然而，糖相关化合物调节柑橘类植物中类胡萝卜素代谢的分子机制尚未完全了解。在本研究中，甘露醇处理导致“Siam Red Ruby”和“Benimadoka”柚子汁囊中CitPSY的表达显著上调，同时总类胡萝卜素含量也相应增加。这一发现与之前的研究结果一致，即在番茄中，糖处理增强了PSY表达和类胡萝卜素生物合成（Télef等人2006）。此外，CitLCYb2也是一个关键基因，在甘露醇处理下也显著上调，该基因引导类胡萝卜素途径向β,β-黄酮类分支的代谢流动（Alquézar等人2009）。CitPSY和CitLCYb2的同时上调表明甘露醇可能在途径的多个调控点调节类胡萝卜素生物合成。
有趣的是，甘露醇处理还触发了分解基因CitNCED2和CitNCED3的表达增加，这些基因参与脱落酸（ABA）的生物合成。这些基因编码9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCEDs），已知它们对非生物胁迫条件高度敏感（Iuchi等人2000；Burbidge等人1997；Schwartz等人1997；Qin和Zeevaart 1999）。由于甘露醇在植物组织培养中既作为碳源又作为渗透压调节剂，因此观察到的CitNCED2和CitNCED3的上调可能反映了渗透压胁迫的响应，而不是直接的糖信号效应。这些发现表明，甘露醇诱导的柚子类胡萝卜素积累可能是通过生物合成和胁迫响应基因网络的协调调控实现的。提出的分子调控机制总结在图6中。
理解植物如何响应和适应盐胁迫仍然是一个具有挑战性的研究领域，因为涉及的防御机制具有多重性。植物对盐分的耐受性在很大程度上取决于它们调整代谢和生理过程的能力，以在不利条件下维持细胞稳态和生存。在自然环境中，植物常常同时受到多种非生物胁迫的影响，这促进了复杂适应策略的进化，包括能够抵抗多重胁迫的交叉耐受机制。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的转录组研究表明，高盐条件下有超过190个基因被激活，突显了盐胁迫下发生的广泛重编程（Boudsocq和Laurière 2005）。在不同物种和培养系统中也观察到了盐对植物生长的类似抑制效应。例如，盐胁迫已被证明会影响马铃薯（Solanum tuberosum L.）的体外发育（Chaves等人2009；Rahman等人2008）、田间条件下的鳄梨（Bernstein等人2004）以及李属（Prunus）物种的体外培养（Andreu等人2011）。这些发现突显了不同植物系统对盐分的敏感性，并表明反应既依赖于物种也依赖于具体环境。NaCl和甘露醇对类胡萝卜素积累的诱导效应表明，非生物胁迫信号与类胡萝卜素生成途径之间存在复杂的相互作用。在本研究中，NaCl处理对CitLCYe的特异性增强和甘露醇对CitZDS的增强表明，虽然这两种处理都模拟了渗透胁迫，但它们可能触发不同的调控节点。NaCl诱导的盐胁迫通常会导致活性氧（ROS）的产生，这可以信号传导抗氧化色素如类胡萝卜素的上调作为保护机制。相反，甘露醇在我们的体外系统中作为一种不可代谢的渗透压调节剂，有效地将渗透压驱动的转录变化与初级糖代谢分开。这通过同时上调CitNCED2和CitNCED3得到证实，这两个基因通常与缺水条件下的脱落酸（ABA）生物合成相关。未来研究应该超越光和渗透压胁迫，识别影响柚子类胡萝卜素积累的其他环境因素，如温度波动、湿度和养分可用性。研究不同光谱（包括红光和紫外线）之间的相互作用，可能进一步优化类胡萝卜素的谱型以用于商业目的。为了完全解码本研究中确定的复杂调控网络，应用先进的功能基因组学工具，如转录组分析和CRISPR/Cas9基因编辑将是必要的。此外，研究脱落酸（ABA）和乙烯等植物激素在非生物胁迫下调节这些途径的作用也值得进一步探索。最终，通过实地试验验证这些体外研究结果仍然是优化柚子果实在自然生长条件下的品质和营养价值的关键步骤。NaCl和甘露醇对柚子果汁囊中类胡萝卜素积累的诱导效应表明，非生物胁迫信号传导与类胡萝卜素生成途径之间存在复杂的相互作用。在柑橘类植物中，已知盐度和干旱等非生物胁迫会触发特定类胡萝卜素生物合成基因的表达，作为一种对抗光氧化损伤的保护机制（Alquézar等人，2009年）。我们的结果显示，这两种处理均显著上调了CitPSY基因的表达，而CitPSY是该途径中的主要限速步骤，这与先前的研究结果一致，即渗透胁迫会增强多种柑橘品种中PSY的表达（Kato等人，2004年；Zhang等人，2012年）。有趣的是，只有NaCl处理能够特异性地增强CitLCYe基因的表达，而甘露醇处理则没有这种效果，这表明盐度胁迫对类胡萝卜素生物合成途径有特定的调节作用。有研究表明，盐胁迫可能特异性地调节该途径中的$\epsilon, \beta$-分支，以产生稳定质体膜的叶黄素（Fanciullino等人，2014年）。此外，甘露醇诱导的渗透胁迫下CitNCED2和CitNCED3基因的强烈上调与这些基因在缺水条件下参与脱落酸（ABA）生物合成的已知作用相符（Iuchi等人，2000年）。ABA的积累可能进一步触发一个反馈机制，促进上游类胡萝卜素基因的表达，这在其他柚子品种的研究中也有所观察到（Ma等人，2015年）。关于其他代谢方面的评估，尽管我们的研究重点在于类胡萝卜素，但果汁囊的生理状态本质上与总可溶性糖和有机酸等初级代谢物密切相关。已有研究表明，甘露醇带来的高渗透压会改变液泡中柠檬酸和蔗糖的积累情况，而这些物质对维持果汁囊的内部pH值和渗透势至关重要（Hirai等人，2003年）。这种微环境的变化可能会影响类胡萝卜素在色素体中的酯化效率和储存情况。未来包含这些参数的研究将能够更全面地了解柚子在环境刺激下的代谢重组过程。此外，还需要进一步探讨类胡萝卜素生物合成在应激处理下调节的机制途径。虽然基因表达分析已经确定了关键的类胡萝卜素生物合成基因，但未来的研究可以使用转录组分析或CRISPR/Cas9基因编辑等更先进的技术来揭示控制类胡萝卜素积累的精确调控网络。研究脱落酸（ABA）和乙烯等植物激素在非生物胁迫下对类胡萝卜素生物合成调节的作用也可能会提供有价值的见解。另一个未来的研究方向是探索这些发现如何在体内改善柚子果实品质。结合控制光照处理或渗透胁迫的田间研究，可以更全面地了解在自然条件下果实成熟过程中类胡萝卜素含量的变化。此外，研究这些处理对果实其他品质参数（如风味、质地和保质期）的影响对于开发实用的农业应用至关重要。最后，将研究范围扩展到更多柚子品种，有助于识别类胡萝卜素生物合成中的遗传变异，并改进旨在提升柚子果实营养价值的育种计划。

**结论**
本研究探讨了蓝光LED和渗透胁迫处理（甘露醇和氯化钠）对柚子果汁囊中类胡萝卜素积累和基因表达的影响。结果表明，蓝光LED有效提高了‘Siam Red Ruby’和‘Benimadoka’品种中的类胡萝卜素水平，尤其是番茄红素。此外，甘露醇和氯化钠处理也促进了类胡萝卜素的积累，尽管是通过不同的调节机制实现的。基因表达分析显示，关键类胡萝卜素生物合成基因（CitPSY、CitPDS、CitZISO、CitCRTISO）的表达显著上调，说明光照和渗透胁迫都影响柚子中的类胡萝卜素代谢。这一体外系统为研究类胡萝卜素生物合成涉及的分子途径提供了一个可靠的平台，并为通过环境调控提高柚子营养价值提供了见解。未来的研究应探讨其他影响柚子类胡萝卜素含量的环境因素，并考虑将这些发现应用于田间栽培实践中。这可能有助于开发优化柚子果实类胡萝卜素积累的方法，从而提高其营养价值和市场吸引力。

**图6**
该图像的替代文本可能是通过人工智能生成的。
**蓝光LED和非生物胁迫对柚子果汁囊中类胡萝卜素生物合成调节的示意图**