埃克托因（Ectoine）可减轻小麦中的镍胁迫，并增强其抗氧化防御机制

《Journal of Plant Growth Regulation》：Ectoine Reduces Nickel Stress and Boosts Antioxidant Defences in Wheat

　　摘要
本研究旨在确定细菌可兼容溶质ectoine（ET）是否能够减轻镍（Ni）对小麦植物的毒性影响。实验中分别设置了50 ppm和75 ppm的镍浓度，并施加了5 mM和10 mM浓度的ET。结果表明，镍胁迫显著增加了植物组织中的镍积累量（从对照组的348 ppb增加到50 ppm镍处理下的17.203 ppb），同时降低了叶绿素含量（从1.38降低到1.01）。然而，施用10 mM浓度的ET有效缓解了这些不良影响，使镍含量降至6.610 ppb（改善了61.56%），并使叶绿素含量增加到1.22（改善了20.79%）。镍暴露还会升高氧化应激标志物（如过氧化氢和丙二醛（MDA）的水平，并增加抗氧化酶的活性。联合使用ET可以降低这些氧化应激指标并调节酶活性，其中10 mM浓度的ET显示出最强的保护效果。通过对接研究发现，ET与抗氧化酶的结合亲和力范围为?6.3至-4.6 kcal/mol。研究还发现，ET与抗氧化酶的相互作用主要发生在这些酶的谷氨酰胺和赖氨酸残基上。这些发现表明，ET作为兼容溶质的作用在于稳定细胞结构、减少活性氧（ROS）的积累并增强抗氧化防御机制，显示出其在缓解植物重金属胁迫方面的潜在效果。

引言
镍（Ni）是地壳中自然存在的金属，通过采矿、冶金、电池生产、颜料制造和不锈钢生产等工业活动不断释放到环境中（Iyaka 2011；Janas等人2018）。虽然镍因其物理和化学性质而受到重视，但它在某些微生物和植物中也具有重要的生物学作用（Polacco等人2013；Boer等人2014；Brazzolotto等人2016）。在植物中，镍主要作为尿素酶的微量营养因子，该酶负责催化尿素的分解（Polacco等人2013）。镍缺乏会导致尿素积累、氮代谢紊乱以及植物生长和产量下降（Brown等人1990；Gerendas和Sattelmacher 1997）。尽管镍在微量情况下是必需的，但在高浓度下会变得有毒（Tveito等人1989；Brown等人1990；Gad等人2007；Dudek-Adamska等人2021）。镍通过自然过程（如火山活动、风尘）和人为活动（如采矿、化石燃料燃烧、肥料或粪肥施用）进入土壤（Kumar和Subrahmanyam 2021）。一旦进入土壤，镍可以在植物中积累并随后进入食物链，对昆虫、动物和人类健康构成威胁（Wang等人2020；Heidari等人2020）。人体暴露于高浓度镍（无论是通过食用含镍食物、在镍加工行业工作还是生活在工业污染源附近）都与肾脏、肺部、心血管系统、神经系统疾病以及皮肤问题和相关癌症风险增加有关（Tveito等人1989；Dudek-Adamska等人2021）。这些毒性效应主要是由于过氧化物（如超氧阴离子O??）、过氧化氢（H?O?）和羟基自由基（•OH）的过量产生（Gajewska和Sk?odowska 2007；Wu等人2012）。在植物中，镍主要通过根系通过主动运输或被动扩散吸收（Yusuf等人2011）。吸收后，镍通过木质部输送到地上部组织，其迁移受到镍结合蛋白和金属-配体复合物（包括有机酸、组氨酸和烟酰胺）的调控（Chen等人2009；Ahmad和Ashraf 2011；Yusuf等人2011）。高浓度的镍会干扰细胞过程，包括细胞分裂受阻、生长受阻、铁和其他必需微量元素的吸收减少、发芽抑制以及光合作用效率下降（Matraszek和Hawrylak-Nowak 2010；Le?ková和Araya 2019；Jahan等人2020）。叶片出现黄化和坏死等症状会直接导致品质和产量下降（Sun 1998；Matraszek和Hawrylak-Nowak 2010）。谷物是全球粮食安全的重要支柱，因此它们的生产意义重大。全球小麦、水稻和玉米的种植面积合计超过5亿公顷（FAOSTAT 2012）。尽管从2012年到2020年人口有所增长，但2012年小麦的种植面积为2.17亿公顷，根据2020年的数据略有增加（Pe?a-Bautista等人2017；FAO 2018；FAOSTAT 2020）。因此，解决包括镍毒性在内的重金属胁迫导致的产量损失至关重要。田间和温室研究表明，镍污染会显著降低作物产量。例如，加拿大的一项温室实验发现，在受镍污染的土壤中种植的作物产量减少了25%（Kukier和Chaney 2004）。在埃及，种植在富含镍的土壤中的小麦和水稻积累了更多的镍，这与生长受阻相关（Badawy等人2023）。类似地，在废水灌溉的田地中也观察到小麦组织中镍积累增加以及产量下降（Gajewska等人2006；Singh等人2012b；Nawaz等人2021）。由于人类在多种行业中依赖镍，且镍对某些生物体的代谢也必不可少，其重要性显而易见。然而，在高浓度下，镍对许多生物（包括人类）具有毒性，并可能通过抑制植物生长造成重大经济损失。ET是一种源自微生物的化合物，已被证明对多种大分子（包括蛋白质、核酸和膜脂质）具有保护作用，并且在各种环境和生理胁迫条件下（如高盐度、极端温度、脱水和氧化应激）表现出保护效果。基于这一背景，本研究旨在探讨ET是否能够减轻镍的毒性影响，特别关注对人类营养至关重要的小麦。为此，研究了在水培系统中生长的小麦植物的各种参数，包括不同镍浓度下的抗氧化酶水平、H2O2和MDA含量。此外，还进行了对接研究，以探讨ET与抗氧化酶之间的潜在相互作用，从而阐明其在ROS调节和抗氧化防御中的作用。

材料与方法
植物材料及生长条件
Triticum aestivum cv. Y?ld?r?m种子首先用3%次氯酸钠溶液进行表面消毒5分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗五次。消毒后，种子置于装有膨胀粘土颗粒（hydrotons）的网状盆中，在26±2°C下发芽4天。为了确定适当的镍胁迫浓度，进行了初步试验，使用不同浓度的NiCl?（10、20、30、40、50和75 ppm）。虽然小麦幼苗在30和40 ppm浓度下表现出明显的胁迫症状，但在50和75 ppm浓度下观察到显著的生长抑制。准备了一个NiCl?储备溶液，并按适当体积加入2升容器中，以达到所需的最终浓度。在整个实验过程中，每两天更换一次添加了镍和ET的Hoagland溶液，以防止营养素和补充剂的耗尽。因此，选择了这两个浓度用于后续实验。确定有效的镍浓度后，确定了ectoine的浓度（纯度≥95.0%，粉末形式；产品代码81619，Sigma-Aldrich，美国）。然后称量所需的ectoine量，并直接溶解在Hoagland营养液中后使用。测试了不同的ET浓度（0.5、1、5、10和15 mM），发现0.5和1 mM几乎没有缓解效果，而15 mM并未比10 mM带来更好的效果。因此，将0.5、1和15 mM的ET从实验组中排除；后续实验仅使用了5 mM和10 mM的ET。新的实验按照上述方法进行发芽处理。发芽后，植物在控温培养箱中的水培系统中接受镍、ET及其组合的处理，使用的是半浓度的Hoagland营养液。每个处理组使用四个网状盆。光照周期设置为16小时光照/8小时黑暗，光照强度为200 μmol m?2 s?1。在整个光照和黑暗阶段保持恒定的26±2°C温度，相对湿度保持在60–70%。Hoagland营养液包含以下成分（mg/L）：K?SO?, 146.5；CaCl?·2 H?O, 73.5；MgSO?·7 H?O, 51.5；KNO?, 18.05；NaH?PO?·2 H?O, 2.51；H?BO?, 0.47；FeSO?·7 H?O, 1.66；MnCl?·4 H?O, 0.19；ZnSO?·7 H?O, 0.04；CuSO?·5 H?O, 0.015；H?MoO?, 0.11，调整pH至6.0（Orhan等人2022, 2023）。

处理方法
在确定重金属和缓解剂的浓度后，实验分为七组：对照组（0Ni0ET，无镍无ET）、50 ppm镍（50Ni0ET）、50 ppm镍加5 mM ET（50Ni5ET）、50 ppm镍加10 mM ET（50Ni10ET）、75 ppm镍（75Ni0ET）、75 ppm镍加5 mM ET（75Ni5ET）和75 ppm镍加10 mM ET（75Ni10ET）。这些组旨在评估不同镍浓度和ET组合的效果。为了确保Hoagland培养基中的营养素均匀分布和植物根部获得最佳氧气供应，整个实验过程中水培系统持续通气。定期加水以防止蒸发蒸腾造成的水分损失。每个处理重复三次以确保统计可靠性。发芽后第10天，测量了根和茎的长度以及植物的总鲜重。收集的植物样本随后被分析以确定抗氧化酶的活性、MDA和H?O?的水平。

**测量与分析**

**镍含量测定**
为了测定镍含量，植物样本先用自来水清洗，再用蒸馏水冲洗，并在40°C下烘干三天。干燥后，仔细称量每个样本，取500毫克放入聚四氟乙烯容器中，使用微波系统（Milestone Start D）与HNO?和H?O?进行酸消化。每个样本的镍含量通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS，Thermo Scientific X Series II）在两阶段微波消化和稀释后进行测量，方法参照Orhan和Ceyran（2024）的描述。

**叶绿素含量测定**
植物组织中的光合色素含量采用了一种改进的先前描述的方法（Knudson等人，1977年）来确定。取200毫克叶片样本浸泡在20毫升95%乙醇中提取色素，然后使用分光光度计在470、649和665纳米处测量提取物的吸光度。根据Lichtenthaler和Wellburn（1983年）提供的公式计算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的浓度。

**H?O?含量测定**
在H?O?定量评估过程中，对先前建立的方法（Velikova等人，2000年）进行了少量修改。从每个实验组中取新鲜采集的植物组织（200毫克），与2毫升0.1%三氯乙酸（TCA）混合以实现充分均质化。均质化后，混合物在4°C下以11,000转/分钟的速度离心20分钟。离心后，取每个样本的上清液200微升与200微升磷酸钾缓冲液（10 mM，pH 7.20）混合。接着加入500微升1 M碘化钾，然后在4°C下记录390纳米处的吸光度。为了建立校准曲线，使用0.1% TCA制备了八个不同浓度的标准H?O?溶液，范围从0.0125到5 nM。之后根据校准曲线确定每个样本的H?O?含量。

**脂质过氧化（MDA）测定**
植物组织中的MDA含量采用了一种先前描述的方法（Razinger等人，2008年）进行测定，并进行了一些修改。具体步骤是：从每个实验组中取300毫克植物组织，在包含3毫升0.01%丁基羟基甲苯、15% TCA、0.25 M盐酸和0.37%硫代巴比妥酸（TBA）的溶液中仔细均质化。均质化后，样品在90°C下孵育30分钟。随后立即在冰上冷却，然后在4°C下以11,000转/分钟的速度离心15分钟。接着将上清液与0.3 mM TCA以1:1（体积比）混合。之后以12,000转/分钟的速度离心10分钟，通过测量532和600纳米波长的吸光度来确定MDA含量。后者（600纳米）的值减去前者以校正非特异性浑浊。根据Landi（2017年）的方法计算每克鲜重（FW）的MDA当量。

**酶的提取**
每个样本包含200毫克新鲜植物组织，在冷研钵中使用2毫升100 mM冷磷酸钾缓冲液（pH 7.0）进行充分均质化。缓冲液中含有1%聚乙烯吡咯烷酮和0.1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）。在4°C下以14,000转/分钟的速度离心15分钟后，收集每个样本的上清液，用于测定相关酶。

**超氧化物歧化酶（EC1.15.1.11）活性**
超氧化物歧化酶（SOD）的活性通过监测硝基蓝四唑（NBT）的光化学还原抑制来评估（Beauchamp和Fridovich，1971年）。取每组20微升上清液与1500微升反应混合物混合。每个处理组的20微升上清液与1500微升反应混合物混合。反应混合物包括300微升750 μM NBT、300微升130 mM甲硫氨酸、300微升20 μM核黄素、300微升100 μM EDTA-Na?和300微升H?O?，均溶于50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.8）中。在560纳米处记录吸光度的变化。一个酶单位定义为上述化学物质反应中50%的抑制。SOD活性表示为每克鲜重（U/g FW）的酶单位数，其中一个单位对应NBT还原的50%抑制。

**过氧化氢酶（EC1.11.1.6）活性**
植物样本的过氧化氢酶（CAT）活性通过部分修改先前方法（Aebi，1984年）来评估。反应混合物包含20 μL酶提取物、100 μL 150 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）、150 μL 30 mM H?O?和30 μL蒸馏水，最终使磷酸钾缓冲液和H?O?的浓度分别为50 mM和15 mM，总体积为300 μL。混合物在25 ± 2°C下孵育30分钟。使用分光光度计监测240纳米处吸光度的变化。CAT活性表示为每分钟每毫克蛋白质分解的H?O?微摩尔数（μmol/min/mg protein）。

**邻苯二甲酚过氧化物酶（EC1.11.1.7）活性**
植物样本中的邻苯二甲酚过氧化物酶（GPOX）活性通过部分修改先前方法（Baycu等人，2006年）来评估。简而言之，反应混合物的总体积为300 μL，包含215 μL 100 mM磷酸钠钾缓冲液（pH 5.8）、45 μL 100 mM邻苯二甲酚、15 μL 100 mM过氧化氢（H?O?）和25 μL酶提取物。酶活性表示为每分钟每克鲜重（FW）的470纳米处吸光度变化（ΔA470/g FW/min）。

**抗坏血酸过氧化物酶（EC 1.11.1.11）活性**
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性通过部分修改先前建立的方法（Nakano和Asada，1981年）来评估。反应混合物的总体积为300 μL，包含50 μL酶提取物、50 μL 3 mM抗坏血酸、50 μL 0.6 mM H?O?和50 μL 0.6 mM EDTA。通过监测290纳米处的吸光度来评估酶活性。APX活性表示为每分钟每毫升酶提取物氧化的抗坏血酸微摩尔数（μmol/min/mL）。

**复合物制备和分子对接**
抗坏血酸过氧化物酶（1OAG）、过氧化氢酶（1DGB）、谷胱甘肽过氧化物酶（4A78）和超氧化物歧化酶（6DQY）的受体分子从RSCB蛋白质数据库（RCSB 2024）下载。选择ET作为配体，并从PubChem（PubChem CID：126041）下载，格式为SDF（PubChem 2024）。使用PyMOL程序（Schrodinger 2021）将SDF格式的配体和受体转换为PDB格式。在Autodock Vina程序（Trott & Olson，2010）中准备受体分子，通过去除水分子、添加极性氢原子和Kollman电荷（Bozari 2024）。ET分子也使用相同程序制备。使用Discovery Studio Visualizer程序（Biovia 2023）识别每个受体分子的五个最佳结合位点。将五个最佳结合位点的网格尺寸调整为所需尺寸。将配体与受体的最佳结合构象保存为PDB格式的输出文件，并使用PyMOL进行可视化。

**统计分析**
统计分析使用了SPSS for Microsoft Windows（SPSS v.22.0）执行单因素ANOVA测试。结果以三次实验的平均值±标准差（SD）表示。使用Duncan的多范围检验在0.05的置信水平下确定平均值之间的差异显著性。

**结果**

**根和茎样本中镍的存在**
在Control条件（0Ni0ET）下，茎中的镍含量为348 ppb。用50 ppm Ni处理（50Ni0ET）使茎中的镍含量增加了49.4倍（17203 ppb）。同时应用5 mM ET和50 ppm Ni（50Ni5ET）使茎中的镍含量减少到大约2.46倍（6982 ppb），相比单独使用50 ppm Ni（50Ni0ET）改善了59.4%。将ET增加到10 mM（50Ni10ET）进一步将镍含量降低到约2.60倍（6610 ppb），改善了61.56%（图1）。与Control组（0Ni0ET）相比，75 ppm Ni处理（75Ni0ET）使茎中的镍含量增加了43.3倍（19411 ppb）。同时应用5 mM ET和75 ppm Ni（75Ni5ET）使茎中的镍含量减少到9938 ppb，相比单独使用75 ppm Ni（75Ni0ET）改善了48.8%。将ET增加到10 mM（75Ni10ET）进一步将镍含量降低到8405 ppb，改善了56.7%（图1）。在Control条件（0Ni0ET）下，根中的镍含量为379 ppb。与Control组（0Ni0ET）相比，用50 ppm Ni处理（50Ni0ET）使根中的镍含量增加了130.7倍（49537 ppb）。同时应用5 mM ET和50 ppm Ni（50Ni5ET）使根中的镍含量减少到46,995 ppb，相比单独使用50 ppm Ni（50Ni0ET）减少了5.13%。将ET增加到10 mM（50Ni10ET）进一步将镍含量降低到约1.10倍（45196 ppb），改善了8.76%（图1）。与Control组（0Ni0ET）相比，75 ppm Ni处理（75Ni0ET）使根中的镍含量增加了147.9倍（56051 ppb）。同时应用5 mM ET和75 ppm Ni（75Ni5ET）使根中的镍含量减少到1.03倍（54350 ppb），相比单独使用75 ppm Ni（75Ni0ET）减少了3.04%。将ET增加到10 mM（75Ni10ET）进一步将镍含量降低到1.09倍（51244 ppb），改善了8.58%（图1）。

**镍和ET处理对叶绿素（Chl）a和b含量的影响**
在50Ni0ET处理下，Chl-a含量相比0Ni0ET处理减少了26.81%，从1.38 mg/g FW降至1.01 mg/g FW（图2）。在50Ni5ET处理下，Chl-a含量增加到1.12 mg/g FW，相比50Ni0ET改善了10.89%。在50Ni10ET处理下，Chl-a含量为1.22 mg/g FW，相比50Ni0ET改善了20.79%。在75Ni0ET处理下，Chl-a含量相比0Ni0ET减少了33.34%，从1.38 mg/g FW降至0.92 mg/g FW（图2）。在50Ni5ET处理下，Chl-a含量增加到0.97 mg/g FW，相比75Ni0ET改善了5.43%。在75Ni10ET处理下，Chl-a含量为1.02 mg/g FW，相比75Ni0ET改善了10.87%。在50Ni0ET处理下，Chl-b含量相比0Ni0ET减少了18.03%，从0.61 mg/g FW降至0.50 mg/g FW（图2）。在50Ni5ET处理下，Chl-b含量增加到0.55 mg/g FW，相比50Ni0ET改善了10.0%。在75Ni10ET处理下，Chl-b含量相比0Ni0ET减少了34.43%，从0.61 mg/g FW降至0.40 mg/g FW（图2）。在75Ni5ET处理下，Chl-b含量增加到0.45 mg/g FW，相比50Ni0ET改善了12.50%。在75Ni10ET处理下，Chl-a含量为0.51 mg/g FW，相比75Ni0ET改善了27.50%。

**镍和ET处理对H?O?含量的影响**
在50Ni0ET处理下，H?O?含量从192.56 μmol/g FW增加到254.41 μmol/g FW，相比0Ni0ET增加了32.11%。在50Ni5ET处理下，H?O?含量降低到248.38 μmol/g FW，相比50Ni0ET改善了2.37%。在50Ni10ET处理下，H?O?含量降低到227.32 μmol/g FW，相比50Ni0ET改善了0.64%（图3）。在75Ni0ET处理下，H?O?含量从192.56 μmol/g FW增加到291.96 μmol/g FW，相比50Ni0ET增加了51.62%。在75Ni5ET处理下，H?O?含量降低到286.64 μmol/g FW，相比75Ni0ET提高了1.82%。在75Ni10ET处理下，H?O?含量降低到281.44 μmol/g FW，相比75Ni0ET提高了3.61%（图3）。

**镍和ET处理对MDA含量的影响**
在50Ni0ET处理下，MDA含量从25.45 U/g protein增加到54.93 U/g protein，相比0Ni0ET增加了115.83%。在50Ni5ET处理下，MDA含量降低到50.39 U/g protein，相比50Ni0ET改善了8.26%。在50Ni10ET处理下，MDA含量降低到41.08 U/g protein，相比50Ni0ET改善了25.21%（图4）。在75Ni0ET处理下，MDA含量从25.45 U/g protein增加到82.28 U/g protein，相比0Ni0ET增加了223.31%。在75Ni5ET处理下，MDA含量降低到76.90 U/g protein，相比75Ni0ET提高了6.53%。在75Ni10ET处理下，MDA含量降低到66.18 U/g protein，相比75Ni0ET提高了19.56%（图4）。

**镍和ET处理对抗氧化酶的影响**
与Control组（0Ni0ET）相比，50Ni0ET处理下的SOD活性略有上升，从39.84 U/g protein增加到40.21 U/g protein，增长了0.93%。在50Ni5ET处理下，SOD活性为40.06 U/g蛋白，比50Ni0ET提高了0.37%。在50Ni10ET处理下，SOD活性为39.51 U/g蛋白，比50Ni0ET提高了1.74%（见图5）。与对照组（0Ni0ET）相比，75Ni0ET处理下的SOD活性略有上升，从39.84 U/g蛋白增加到40.61 U/g蛋白，提高了1.93%。在75Ni5ET处理下，SOD活性为40.45 U/g蛋白，比75Ni0ET提高了0.39%。在75Ni5ET处理下，SOD活性为40.04 U/g蛋白，比75Ni0ET提高了1.41%（见图5）。Ni的应用显著增加了CAT酶的活性（见图6）。在50Ni0ET处理下，CAT活性比0Ni0ET处理增加了4.19倍，从11.48 μmol/min/mg蛋白增加到48.02 μmol/min/mg蛋白。在50Ni5ET处理下，CAT活性降低到45.03 μmol/min/mg蛋白，比50Ni0ET提高了6.23%。在50Ni10ET处理下，CAT活性为25.12 μmol/min/mg蛋白，比50Ni0ET提高了47.69%。在75Ni0ET处理下，CAT活性比0Ni0ET增加了7.93倍，从11.48 μmol/min/mg蛋白增加到91.08 μmol/min/mg蛋白。在75Ni5ET处理下，CAT活性降低到89.01 μmol/min/mg蛋白，比75Ni0ET提高了2.27%。在75Ni10ET处理下，CAT活性为78.17 μmol/min/mg蛋白，比75Ni0ET提高了14.17%（见图6）。在50Ni0ET处理下，GPOX活性比0Ni0ET处理增加了1.27倍，从11,596 ΔA470/g FW/min增加到14,735 ΔA470/g FW/min（见图7）。在50Ni5ET处理下，GPOX活性降低到14,605 ΔA470/g FW/min，比50Ni0ET提高了0.88%。在50Ni10ET处理下，GPOX活性为11,021 ΔA470/g FW/min，比50Ni0ET提高了25.21%。在75Ni0ET处理下，GPOX活性比0Ni0ET增加了1.64倍，从11,596 ΔA470/g FW/min增加到18,969 ΔA470/g FW/min。在75Ni5ET处理下，GPOX活性降低到18,769 ΔA470/g FW/min，比75Ni0ET提高了1.05%。在50Ni0ET处理下，APX活性比0Ni0ET处理增加了1.75倍，从97.67 μmol/min/mL增加到162.32 μmol/min/mL（见图8）。在50Ni5ET处理下，APX活性降低到159.01 μmol/min/mL，比50Ni0ET提高了2.03%。在50Ni10ET处理下，APX活性为132.3 μmol/min/mL，比50Ni0ET提高了18.49%。在75Ni0ET处理下，APX活性比0Ni0ET增加了2.72倍，从97.67 μmol/min/mL增加到252.32 μmol/min/mL（见图8）。在75Ni5ET处理下，APX活性降低到250.21 μmol/min/mL，比50Ni0ET提高了0.84%。在75Ni10ET处理下，APX活性为234.13 μmol/min/mL，比75Ni0ET提高了7.15%（见图8）。

表1显示了ET与抗坏血酸过氧化物酶、过氧化氢酶、间苯三酚过氧化物酶和超氧化物歧化酶的最佳结合位置。相应地，分子与这些酶的结合能分别为：抗坏血酸过氧化物酶在S3位点的结合能为-5.1 kcal/mol，过氧化氢酶在S2和S3位点的结合能为-6.3 kcal/mol，间苯三酚过氧化物酶在S2和S3位点的结合能为-4.6 kcal/mol，超氧化物歧化酶在S1和S5位点的结合能为-5.2 kcal/mol。这些结合能数据见表1，分子-配体相互作用见图9。

嗜盐微生物具有在低水分活性环境中生存的独特能力，这种环境通常与高盐浓度相关（Brown 1976；Oren 2006）。ET是在盐胁迫下新合成的化合物之一，也是研究最广泛的嗜盐微生物代谢物之一。研究表明，ET能有效稳定DNA、蛋白质和脂质双层等大分子的结构（Yu和Nagaoka 2004；Hahn等人2015a；Zaccai等人2016；Czech等人2018；Keller等人2021）。ET的稳定作用基于一种称为“优先排斥”（preferential exclusion）的机制（Yu等人2007）。这一过程涉及将ET从围绕大分子表面的水合层中排除出去，导致这些大分子周围的溶剂结构发生变化。ET的这些特性使其成为众多科学研究的焦点，并促进了其在化妆品、医学和生物技术等领域的应用。例如，ET在胁迫条件下可以稳定酶并保护细胞。在生物柴油生产中，ET提高了脂肪酶的催化效率，从而增加了生物柴油的产量（Wang和Zhang 2010）。此外，ET还能稳定乳过氧化物酶（常用于食品工业），并促进广泛使用的乙醇生产菌Zymomonas mobilis的生长和葡萄糖利用。它还能保护这些细胞免受发酵过程中的乙醇毒性（Zhang等人2008）。ET的细胞稳定作用不仅限于这些应用；它还可用作人类细胞（如卵细胞、红细胞和自然杀伤细胞）和微生物（如乳酸菌）的冷冻保护剂（Assal等人2014；Pasley等人2017；Choi等人2018；Orhan等人2024）。在医学应用中，ET显示出有希望的细胞保护作用和抗炎效果。对人类上皮细胞和动物模型的研究表明，ET可能有助于缓解肠道疾病（Abdel-Aziz等人2015；Castro-Ochoa等人2019）。此外，ET在缓解急性呼吸道感染和急性支气管炎患者的症状方面比盐水更有效（Tran等人2019）。它还能通过改善干眼症状和维持泪液平衡来保护眼睛健康（Dwivedi等人2014）。此外，ET还显示出减少放疗或化疗副作用的潜力（Rieckmann等人2019）。如前所述，ET具有保护细胞和细胞大分子免受多种胁迫因素的潜力。因此，在本研究中，我们探讨了ET是否可以保护植物免受镍胁迫。

我们的研究发现，暴露于50 ppm和75 ppm的镍会导致叶绿素a含量显著下降，分别比对照组减少了27.23%和33.34%。同样，叶绿素b含量也分别减少了18.03%和34.43%。事实上，许多研究人员指出镍的毒性会降低不同植物的叶绿素含量。例如，在一项关于小麦（Triticum aestivum）的研究中，增加镍浓度（25和50 μM）会导致总叶绿素含量（叶绿素a和b）的浓度依赖性下降（Uru? Parlak 2016）。类似地，对Triticum aestivum的研究也发现，较高的镍浓度（50、100和150 ppm）也会导致总叶绿素含量的浓度依赖性下降（Saleh等人2020）。这一趋势也在其他植物物种中观察到，包括Brassica oleracea、Vigna mungo和Pistia stratiotes（Pandey和Sharma 2002；Singh和Pandey 2011；Singh等人2012a）。另一方面，作为研究其减少镍毒性的化合物ET，在50 ppm和75 ppm镍浓度下均增加了叶绿素a的含量。在测试的两种ET浓度（5 mM和10 mM）中，较高浓度（10 mM）在缓解负面影响方面更为有效，50 ppm镍的改善率为20.79%，75 ppm镍的改善率为5.43%。同样，叶绿素b含量在10 mM ET处理下也有所增加，50 ppm镍增加了10.0%，75 ppm镍增加了12.50%。ET通过提高植物的光合作用效率来增加叶绿素含量的机制可能与其作为渗透保护剂的作用有关，这有助于更有效地将光能转化为化学能（M?kel?等人2000）。

对照组中的H?O?水平为192.56 μmoL/g FW。添加50 ppm镍后，H?O?水平上升到254.41 μmoL/g FW。加入5 mM ET和50 ppm镍后，H?O?水平为252.36 μmoL/g FW；而加入10 mM ET和50 ppm镍后，H?O?水平进一步降低到227.32 μmoL/g FW。在75 ppm镍处理下，H?O?水平达到291.96 μmoL/g FW。加入5 mM ET和75 ppm镍后，H?O?水平为286.64 μmoL/g FW；加入10 mM ET后，H?O?水平进一步降低到281.44 μmoL/g FW。因此，在两种镍浓度下，10 mM ET的效果均优于5 mM ET，尤其是在50 ppm镍时。许多关于不同植物（包括Triticum aestivum、Zea mays和Solanum lycopersicum）的研究表明，镍胁迫下H?O?水平会上升，这支持了当前的研究结果（Jahan等人2020；Vaculík等人2021；Sabir等人2022）。ET通过共同作用减少镍毒性的结果表明，ET可能通过直接中和活性氧（ROS）或增强抗氧化酶的活性来发挥作用（Brands等人2019；Ozfidan-Konakci等人2022）。

在胁迫条件下（如重金属暴露、干旱或盐度），ROS水平上升并攻击脂质双层中的不饱和脂肪酸的甲基烯基（CH2），产生脂质自由基（L•）。这种L•随后与分子氧（O2）反应形成脂质过氧化物自由基（LOO•）。LOO•可以与另一个脂质分子反应，生成脂质过氧化物（LOOH），并产生新的脂质自由基，从而持续引发链式反应。在此过程中形成的脂质过氧化物（LOOH）可以分解成活性醛类物质，如MDA，MDA被用作测量细胞（包括植物）胁迫程度的生物标志物（Ayala等人2014）。我们的研究表明，与H?O?水平的变化一致，MDA水平在两种镍处理下均有所上升。与对照组相比，50 ppm和75 ppm镍使MDA水平分别上升了115.82%和223.25%。这与之前的研究结果一致，这些研究指出镍的应用会提高各种植物中的MDA水平（Sirhindi等人2016；Xalxo等人2017；Jahan等人2020；Vaculík等人2021）。然而，将镍与ET共同使用，尤其是在10 mM浓度下，可以降低升高的MDA水平，50 ppm镍的毒性降低了25.21%，75 ppm镍的毒性降低了19.57%。ET在镍胁迫下降低MDA水平的机制可能是由于其作为渗透保护剂的作用，它稳定了细胞膜，防止它们受到氧化损伤。ET可能通过减少ROS的生成和增强植物的抗氧化防御机制来减轻脂质氧化，从而降低MDA水平。这与之前的研究结果一致，即ET有助于维持脂质单层和双层的稳定性（Harishchandra等人2010），同时它还具有清除羟基自由基的能力（Brands等人2019）。另一种可能是ET通过抑制镍的吸收来促进植物生长，类似于甘氨酸甜菜碱在盐胁迫下促进Zea mays生长的作用（Zhu等人2022）。

关于植物中镍毒性的研究使用了不同浓度的镍（Oryza sativa、Zea mays、Phaseolus vulgaris），发现镍会被运输到根、茎和叶中（Mihailovic和Drazic 2011；Aziz等人2015；Vaculík等人2021）。在本研究中，应用50 ppm镍后，根部的镍含量比对照组高出130.2倍，茎部的镍含量高出29.3倍。在75 ppm镍下，根部的镍含量增加了147.8倍，茎部的镍含量增加了32.8倍。比较5 mM ET和10 mM ET发现，在两种镍胁迫条件下（50 ppm和75 ppm镍），较高浓度的ET在减少镍积累方面更为有效。虽然5 mM ET对镍毒性有一定的缓解作用，但10 mM ET的缓解效果更强，表明增加ET浓度可以增强其对镍胁迫的保护作用。还观察到，在两种ET浓度下（5 mM和10 mM），镍向植物的转移都减少了。ET减少植物中镍含量的机制可能类似于脯氨酸的作用，脯氨酸已被证明可以在镉胁迫下增强Cicer arietinum的抗氧化酶活性（Hayat等人2013）。此外，一项关于藻类细胞普通小球藻（Chlorella vulgaris）的研究发现，脯氨酸的应用可以减少由重金属应力（包括镍）引起的脂质过氧化（Mehta和Gaur 1999）。最新研究表明，ET可以刺激抗氧化酶，增强与果实抗病性相关的蛋白质，并激活苯丙烷类和黄酮类的生物合成途径（Xu等人2025）。另一项研究还表明，ET可以增强抗氧化防御，减少炎症，促进胶原蛋白合成，激活红系2相关因子2（Nrf2），并保护人类皮肤成纤维细胞（HSF）和3D皮肤模型免受紫外线B（UVB）的损伤（Wang等人2025）。先前的研究在各种植物中也证明了镍暴露会增加H?O?、MDA的水平以及镍的积累（Sirhindi等人2016；Xalxo等人2017；Kotapati等人2017；Jahan等人2020；Vaculík等人2021）。当前研究的结果显示，ET和镍的联合应用显著降低了植物对镍的吸收，并限制了镍从根部向茎部的运输。这些参数的随后减少，以及ET和镍联合应用后根部和茎部镍含量的下降，支持了ET通过减少植物中镍的积累来减轻镍诱导的氧化损伤的假设。ET减少镍吸收的效果可能归因于其稳定细胞膜的能力。细胞膜的稳定相应地减少了镍进入细胞的量，从而在吸收减少时限制了镍的运输。ET和镍联合应用时观察到的H?O?和MDA水平的降低也支持了ET稳定细胞膜的观点。这种氧化应激标志物的减少表明ET有效减轻了镍诱导的损伤，有助于保护细胞膜的完整性。这与之前的研究结果一致，即ET有助于维持膜稳定性，包括脂质单层和双层膜（Harishchandra等人2010）。我们的结果显示，SOD、CAT、APX和GPOX等抗氧化酶的水平在镍应用下均有所增加。随着镍浓度从50 ppm增加到75 ppm，这些酶的水平也相应上升。这些结果与之前在各种植物上进行的研究结果一致（Mihailovic和Drazic 2011；Sirhindi等人2016；Zhang等人2020；Kumar等人2022）。镍暴露显著增加了小麦植物中CAT、GPOX、APX和SOD酶的活性，在75 ppm镍处理下的酶水平高于50 ppm镍处理。添加ET（5 mM或10 mM）减缓了这些增加，其中10 mM ET在所有酶活性上显示出更显著的减少，尤其是CAT和APX。考虑到这些酶的变化，GPOX是在镍应力下受影响最小的酶。GPOX在镍应力下的轻微增加及其在ET作用下的相对较小减少可能是由于其结构所致。众所周知，镍对组氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸等氨基酸具有高亲和力。如果GPOX的结构在其关键区域（如活性位点）中含有较少的这些残基，镍离子可能对GPOX的影响比对CAT或APX等结构更脆弱的酶的影响较小（Koz?owski等人1999；Kowalik-Jankowska等人2007）。在镍应力下受影响最小的酶是SOD。SOD与GPOX一样受镍应力影响较小，这表明SOD在镍存在下具有相对的韧性，可能是因为其结构中存在与镍相互作用较少的氨基酸（Koz?owski等人1999；Kowalik-Jankowska等人2007；Szunyog等人2019）。在50 ppm和75 ppm镍浓度下，CAT和APX酶的活性显著增加，表明H?O?的水平超出了APX单独可以处理的范围。这表明CAT和APX共同有效地调节H?O?的水平。尽管CAT以其快速周转率而闻名，但它对H?O?的亲和力低于过氧化还原酶和APX，使得这两种酶在压力条件下对维持植物健康至关重要（Mittler和Zilinskas 1991；K?nig等人2002）。在使用5 mM和10 mM ET浓度来减少镍毒性的实验中，10 mM比5 mM更有效地恢复了所有抗氧化酶的水平。这两种ET浓度对SOD酶活性的改善最小，而对其他三种酶的改善显著。镍毒性对SOD酶的影响较小，以及ET在两种浓度下改善有限，表明这种酶受镍毒性的影响较小，因此ET对该酶的增强作用有限。两种ET浓度均提高了其他三种酶（POD、APX和CAT）的活性，表明它们抵抗镍诱导损伤的能力增强。这种增加可能是由于ET的稳定作用，因为它与周围的水分子形成强烈的相互作用，创建了一个稳定的水合壳层，间接稳定了酶的结构（Smiatek等人2012；Hahn等人2015b；Zaccai等人2016）。通过优先排斥机制，ET被排除在酶的水合层之外，改变了它们周围的溶剂结构。这一过程可能有助于保持酶的构象，减少它们与镍的直接相互作用。ET还可能调节抗氧化酶的基因表达，类似于甘氨酸甜菜碱的效果，后者已被证明可以在转基因水稻（Oryza sativa）中上调165个基因的表达，包括那些与重金属耐受性相关的基因（Kathuria等人2009）。此外，ET以其自由基清除作用而闻名（Brands等人2019），这可能减少了对抗氧化酶的需求，从而导致酶水平的下降。根据本研究获得的对接结果，结合强度从最强到最弱如下：CAT > SOD > APX > GPOX。这些结果表明CAT受到的保护最有效，结合亲和力范围为?6.3至?5.4 kcal/mol，其次是SOD，其结合亲和力范围为?5.2至?4.8 kcal/mol。APX显示出中等程度的保护，亲和力在?5.1 kcal/mol至?4.1 kcal/mol之间，而GPOX受到的保护最小，结合亲和力范围为?4.6 kcal/mol至?3.7 kcal/mol。基于这些发现，一项利用实验方法和分子对接分析的研究揭示，ET及其衍生物（同型ectoine、羟基ectoine、2-甲基-6-磷酰胺甲基-1,4,5,6-四氢嘧啶-4-羧酸和2-甲基-6-(3-磷酰丙基)-1,4,5,6-四氢嘧啶-4-羧酸）与酪氨酸酶相互作用，其中2-甲基-6-磷酰胺甲基-1,4,5,6-四氢嘧啶-4-羧酸的相互作用最强（Behazin和Ebrahimi 2018）。最近的一项研究探讨了四种兼容溶质（海藻糖、肌醇、葡糖基甘油和蔗糖）保护RNase酶的潜力。通过分子力学泊松-玻尔兹曼表面积分析，报道葡糖基甘油和蔗糖提供了最佳的保护（Ilyas等人2024）。通过展示ET对抗氧化酶内特定氨基酸的结合亲和力，ET可能增强这些酶的活性，从而减轻植物的应激。

**结论**
该研究强调了ET对小麦植物中镍诱导应激的保护作用，10 mM ET比5 mM更有效。ET的应用显著减轻了叶绿素的降解，限制了镍的积累，并减少了镍毒性引起的氧化应激标志物（H?O?和MDA）。此外，ET调节了关键抗氧化酶（SOD、CAT、APX和GPOX）的活性，其中CAT活性的降低最为显著，表明其对抗氧化防御系统的稳定作用。对接分析进一步证实了这些发现，表明结合亲和力趋势为CAT > SOD > APX > GPOX，CAT与ET的相互作用最强（–6.3至?5.4 kcal/mol），GPOX最弱（–4.6至?3.7 kcal/mol）。观察到的保护作用可能源于ET减少活性氧物种和稳定酶结构的能力，支持其在重金属应力条件下增强植物韧性的潜力。这项研究突出了ET作为环保解决方案在重金属污染环境中提高植物健康和生产力方面的潜力。然而，ET在有效减轻镍毒性方面的作用仍不清楚，需要进一步研究。

**图1**
**图2**
**图3**
**图4**
**图5**
**图6**
**图7**
**图8**
**图9**
**表1**