利用微生物改良的龙眼（Dimocarpus longan）果皮和种子废弃物制成的堆肥肥料：解锁葫芦巴（Trigonella foenum-graecum）中的土壤健康促进成分及生物活性物质

《Journal of Soil Science and Plant Nutrition》：Microbial-Enhanced Peel and Seed Wastes of Dimocarpus longan Bokashi Fertilizers: Unlocking Soil Health and Bioactive Constituents in Trigonella foenum-graecum

　　**摘要**
本研究评估了一种改良的Bokashi发酵系统，该系统利用特定的微生物联合菌群（酿酒酵母、乳酸乳球菌和沼泽红假单胞菌）将龙眼（Dimocarpus longan）的果皮和种子生物转化为生物肥料。通过总有机质（OM）和碳氮比（C/N）来评估发酵的稳定性。将制备得到的生物堆肥茶——龙眼果皮（LP）、龙眼种子（LS）及其1:1混合物（LP: LS）以1%（w/v）的比例应用于葫芦巴（Trigonella foenum-graecum）进行盆栽实验。15天后的幼苗被收集用于分析。与对照组相比，所有发酵处理均显著丰富了土壤养分并优化了碳氮比。其中，龙眼种子处理产生了最高的养分浓度，而龙眼果皮与种子的混合处理则显著增强了微生物活性，特别是增加了真菌（如曲霉、枝孢菌和青霉菌属）以及细菌/放线菌的数量。从生理学角度来看，经过龙眼果皮与种子处理的葫芦巴在叶绿素色素、碳水化合物、蛋白质含量及次生代谢产物（酚类和黄酮类）方面表现出最大的增长。此外，RT-PCR分析证实了关键生物合成基因（包括MVK、PAL和FLS（多酚/萜类途径）以及CHLH（叶绿素生物合成基因）的上调。通过丙二醛（MDA）水平测得的氧化应激保持在控制范围内，表明没有植物毒性。这些数据表明，酿酒酵母、乳酸乳球菌和沼泽红假单胞菌组合的Bokashi系统能够有效地将龙眼废弃物转化为富含养分的生物肥料。代谢基因的上调以及土壤微生物谱的改变为这种废弃物资源化策略在可持续农业中的应用提供了技术支持。

**图形摘要**
本研究评估了一种改良的Bokashi发酵系统，该系统利用特定的微生物联合菌群（酿酒酵母、乳酸乳球菌和沼泽红假单胞菌）将龙眼（Dimocarpus longan）的果皮和种子生物转化为生物肥料。通过总有机质（OM）和碳氮比（C/N）来评估发酵的稳定性。将制备得到的生物堆肥茶——龙眼果皮（LP）、龙眼种子（LS）及其1:1混合物（LP: LS）以1%（w/v）的比例应用于葫芦巴（Trigonella foenum-graecum）进行盆栽实验。15天后的幼苗被收集用于分析。与对照组相比，所有发酵处理均显著丰富了土壤养分并优化了碳氮比。其中，龙眼种子处理产生了最高的养分浓度，而龙眼果皮与种子的混合处理则显著增强了微生物活性，特别是增加了真菌（如曲霉、枝孢菌和青霉菌属）以及细菌/放线菌的数量。从生理学角度来看，经过龙眼果皮与种子处理的葫芦巴在叶绿素色素、碳水化合物、蛋白质含量及次生代谢产物（酚类和黄酮类）方面表现出最大的增长。此外，RT-PCR分析证实了关键生物合成基因（包括MVK、PAL和FLS（多酚/萜类途径）以及CHLH（叶绿素生物合成基因）的上调。通过丙二醛（MDA）水平测得的氧化应激保持在控制范围内，表明没有植物毒性。这些数据表明，酿酒酵母、乳酸乳球菌和沼泽红假单胞菌组合的Bokashi系统能够有效地将龙眼废弃物转化为富含养分的生物肥料。代谢基因的上调以及土壤微生物谱的改变为这种废弃物资源化策略在可持续农业中的应用提供了技术支持。

### 1 引言
葫芦巴是一种属于豆科植物的植物，学名为Trigonella foenum-graecum L.，属于一年生植物（Ammar 2022）。自古以来，葫芦巴就被广泛用于烹饪和民间医药领域，其绿色叶子和种子都被加以利用（Chi et al. 2025）。葫芦巴提取物中含有大量的植物化合物，包括类固醇、萜类、生物碱、黄酮类、酚类、苷类和单宁（Wangui et al. 2025）。这些多酚类化合物被称为苯丙烷类化合物，因为它们是由苯丙氨酸衍生而来的。黄酮类和酚类化合物具有多种有益的生理作用（Bonta 2020; Dias et al. 2021; Mutha et al. 2021）。萜类是一类包含初级和次级植物代谢产物的异质群体，如用于光合作用的色素、植物激素和精油（Pichersky and Raguso 2018）。

全球对循环经济、可持续性和零废弃物的关注，受到了联合国可持续发展目标的推动，旨在通过回收废弃物来促进经济增长并减少对环境的破坏（Qi et al. 2024）。现代科学将这些概念结合起来，开发出经济实惠且环保的解决方案，以应对诸如食物短缺、土壤贫瘠和沙漠化等重大气候变化问题（Ammar 2021; Younis et al. 2022）。生物施肥是一种关键方法，它利用可降解材料来提高土壤肥力（Ammar et al. 2023）。生物肥料使用可降解材料，如微生物、真菌和各种植物残渣（例如果皮、咖啡渣、茶粉），这些材料通常含有抗氧化剂和生物碱等有益成分（Ammar 2022, 2023; Chakravarty and Mandavgane 2021; Shahrajabian et al. 2019; Tarashkar et al. 2023）。这种方法特别适用于处理中国龙眼（Dimocarpus longan Lour.）废弃物，因为龙眼的厚壳富含天然可降解的生物化学成分，如多糖、黄酮类、生物碱和类胡萝卜素，这些成分具有抗氧化或营养价值（Ammar et al. 2025; Shahrajabian et al. 2019）。除了这些化合物具有传统的药用或化妆品用途外，它们也非常适合作为可持续生态系统的天然土壤改良剂（Ammar et al. 2025）。

为了高效地将这些废弃物转化为可用资源，采用了Bokashi技术。这是一种在许多农业地区广泛使用的有机肥料，以其丰富的养分含量和有益微生物而闻名。这种肥料可以促进和激活土壤中的有益微生物，改善土壤物理特性，并为植物提供养分。与传统的有机肥料（如鸡粪或堆肥）不同，后者需要数周或数月才能分解，而Bokashi发酵过程仅需14至21天即可完成（Quiroz and Céspedes 2019）。在某些情况下，最终产物是一种半稳定的有机化合物，即部分降解且化学性质不稳定的物质（Quiroz and Céspedes 2019）。尽管如此，Bokashi在施用于土壤后仍能保持稳定性（Quiroz and Céspedes 2019）。然而，使用未经稳定的物质可能会因减少氧气供应、固定土壤中的氮或含有有害化学物质而导致植物生长受到抑制（Christel 2017; López-atanacio et al. 2025）。因此，本研究重点探讨了利用成本效益高的Bokashi技术通过接种酿酒酵母EC-1118和乳酸乳球菌的Bokashi混合物来处理龙眼废弃物（包括果皮和种子），旨在生产新型环保生物肥料，并评估其对葫芦巴生长的影响，同时研究相关的分子和生理机制、生物活性化合物的积累以及土壤肥力的提升。

### 2 材料与方法
#### 2.1 龙眼废弃物管理和厨房Bokashi堆肥及茶液的制备
2024年1月至2月期间，从当地市场收集了龙眼（Dimocarpus longan Lour.）的果皮和种子废弃物。废弃物用蒸馏水清洗、分类后，在40°C的强制通风烘箱中脱水72小时。为确保表面积的一致性，将干燥后的材料研磨并筛分至0.2–2.0毫米的颗粒大小。实验采用三个9升的聚丙烯（PP）Bokashi容器（尺寸：20厘米×20厘米×23厘米），每个容器都配备了由ATmega328微控制器控制的自动监测和分配系统。该系统包括超声传感器用于监测废弃物水平，DHT11传感器用于实时温度（维持在±28°C）和湿度监测，以及一个用于精确分配Bokashi混合物的自动直流电机驱动的螺杆。每种处理方式包括10克废弃物粉末与50毫升蒸馏水混合成糊状。具体处理组别为：（1）龙眼果皮（LP），（2）龙眼种子（LS），以及（3）果皮与种子的1:1混合物（LP: LS）。为了启动发酵，每个容器添加了15克的微生物混合物：5克酿酒酵母EC-1118、5克乳酸乳球菌和5克沼泽红假单胞菌。容器密封以保持厌氧环境。初次发酵在室温下持续14天，每隔3天通过排水口收集发酵液（Bokashi茶液）以防止水分饱和并维持厌氧环境。初次发酵后，将发酵糊状物埋入高压灭菌的清洁土壤盆中（pH 5–6.5）完成成熟过程。最终Bokashi茶液的pH值为4.8，表明发酵成功（Lew et al. 2021; López-atanacio et al. 2025）。从成熟堆肥中提取三种Bokashi堆肥茶液（浓度为1% w/v：LP、LS、LP: LS），在±28°C下孵育3天后过滤（Yin et al. 2025）。作者测量了在645、663和470纳米处的吸光度。2.5.4 总可溶性糖和总可溶性蛋白含量 在制备的硼酸盐缓冲液提取物中评估了总可溶性糖的浓度。总可溶性糖的浓度在490纳米处进行测量，随后使用预定义的校准曲线以毫克每克干重的单位进行定量。总可溶性蛋白的浓度也进行了定量评估。吸光度通过在595纳米处进行分光光度测量来确定。蛋白浓度使用牛血清白蛋白（BSA）的校准曲线以毫克每克干重的单位进行量化。2.5.5 酚类和黄酮类化合物含量的测量 使用shoot的乙醇提取物来量化总酚类和黄酮类化合物。干燥的叶子被研磨成细粉。在室温下，组织（0.1克和0.5克）被均匀处理并在70%的丙酮中孵育30分钟，然后以4倍重力离心。酚类含量使用Folin-Ciocalteu试剂进行测量。提取物与Folin-Ciocalteu试剂以1:1的体积比混合。5分钟后，加入7.5%的碳酸钠溶液，体积比为2:1。2小时后，在725纳米处测量吸光度。100微升的相同提取物与4毫升蒸馏水混合用于黄酮类化合物的测定，然后加入0.3毫升的5%亚硝酸钠。五分钟后，加入0.3毫升的10%氯化铝。五分钟后，向混合物中加入2毫升的1摩尔氢氧化钠。吸光度在510纳米处相对于空白进行测量。使用儿茶素作为校准曲线。2.5.6 应激生物标志物的评估 Malondialdehyde (MDA)的浓度根据已建立的方法进行量化。使用5%（w/v）的TCA溶液提取叶子以评估MDA。加热20分钟后，样品提取物和0.67%（w/v）的TBA被冷却。样品的吸光度在两个波长处进行测量：532纳米和600纳米。2.5.7 基因维度 从100毫克的完全展开的叶子中提取总RNA，然后立即在液氮中快速冷冻叶子样本，并存储在-80°C，然后在液氮下使用预冷的研钵和研杵将其研磨成细粉以防止RNA降解。提取是使用Qiagen RNase Mini Kit进行的。总RNA是使用Qiagen RNeasy Mini Kit（Qiagen，德国）按照制造商的协议提取的。cDNA是在20微升的反应体积中合成的，使用M-MLV逆转录酶（Promega，美国）、5x RT缓冲液、10 mM dNTPs、50 ng μL?1 oligo(dT)18引物、40 U μl?1 RiboLock RNase抑制剂和200 U μl?1 M-MLV RT酶。热循环条件为：5分钟在65°C（引物退火/DNA变性），60分钟在42°C（逆转录），10分钟在95°C（酶失活）。定量实时PCR使用Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific，美国）进行，反应体积为25微升，包含1微升cDNA（1:10稀释）、12.5微升2x Master Mix、0.5 μM每个引物（表S1）和无核酸酶的水。在Rotor-Gene Q（Qiagen，德国）上的热循环包括95°C 10分钟，然后是40个循环，每个循环95°C 15秒和60°C 60秒（结合退火/延伸）。相对基因表达使用2^(-ΔΔCt)方法进行量化，以ACTIN作为参考基因（Elsherif等人2024a, b a；Livak和Schmittgen 2001）。2.6 统计调查 结果以三次重复的平均值±标准误差（SE）表示。不同处理之间的不同测量变量的差异通过单因素方差分析（ANOVA）进行测试，然后使用XLSTAT软件（版本2014.5.03）进行Tukey检验，找到显著差异（p < 0.05）。3 结果3.1 Bokashi堆肥和茶的分析 所有堆肥茶都显示出酸性的pH值，低于对照土壤（7.5），但高于5。测量的pH值分别为LP为5.8，LS为5.2，LP: LS为5.4（表1A）。同样，所有堆肥的EC平均值都高于对照（0.77）。LP的EC值最高（1.46），其次是LP: LS（1.17）和LS（1.12）（表1A）。表1 总结了生态和原子吸收光谱法（AAS）分析，其中（A）是制备的Bokashi堆肥和茶对照土壤及制备的Bokashi堆肥，（B）是处理过的土壤样本，（C）是处理过的植物样本。对Bokashi堆肥（LP、LS和LP: LS）的分析确认所有配方中的必需矿物质比例都显著高于对照土壤。氮（N+）%的增加最为显著，在LP（1.2%）中记录到异常峰值，其次是LS（1.1%）配方，这比最低的对照水平（0.029%）增加了大约40倍（表1A）。钾（K+）%方面，LP处理的值最高（5.32%），所有其他处理（LP: LS为4.38%和LS为3.64%）也显著超过了对照土壤（2.89%）（表1A）。总碳（C+）4%的含量也明显增加，在LS配方中达到峰值（36.59%），其次是LP: LS（33.47%）和LP（30.20%），均显著超过对照（20.20%）（表1A）。最后，虽然所有堆肥都提高了磷（P+）5%的可用性，但LS配方记录的百分比最高（30.37%），相比之下对照土壤为28.01%（表1A）。所有制备的堆肥都显著提高了总有机质（OM%）的含量，相比对照土壤（4.9%）。LP: LS配方记录的最高OM百分比（59.7%），其次是LP（56.4%），然后是LS（36.6%）（表1A）。同样，碳氮（C: N）比例在所有堆肥中的记录也显著高于对照土壤（20.20%）。这些高的OM%和C: N值证实了堆肥显著富集土壤有机质和养分循环的能力。3.2 土壤分析3.2.1 主要营养土分析 土壤pH值的平均值；对照土壤为7.32，而使用堆肥茶处理后的土壤pH值略有变化：LS样本略微增加至7.41，LP略微降低至7.28，LP: LS为7.18（表1B）。在土壤电导率（EC）平均值方面，处理过的对照土壤为0.08，但在LS中增加到0.17，而在LP中为0.11，LP: LS为0.09（表1B）。所有堆肥处理都成功提高了土壤中的必需矿物质和有机成分的水平，相比未经处理的对照（表1B）。LS处理在所有测量参数中显示出最显著的增强。特别是，钾（K+）%在LS中最高（3.40%），其次是LP（3.21%）和LP: LS（3.20%），均超过了对照（2.71%）。氮（N+）%也在LS中达到峰值（0.140%），紧随其后的是LP（0.139%），然后是LP: LS（0.073%），显示出相对于对照（0.042%）的显著上升。同样，磷（P+）5%在LS中最高（35.7%），其次是LP（33.1%），和LP: LS（32%），相对于对照（30.5%）。此外，所有堆肥都提高了土壤的总有机质（OM%），对照土壤仅为2.85%，而在LS中增加到7.23%，LP为6.73%，LP: LS为4.53%（表1B）。所有堆肥都提高了土壤的C: N比例，对照土壤仅为18.81%，而在LS中提高到52.64%，LP为39.40%，LP: LS为29.93%（表1B）。3.2.2 微生物土壤分析和分类 使用LP: LS堆肥茶处理的土壤记录了最高的真菌菌落形成单位（CFU g?1）（1112 CFU g?1），其次是LP（800 CFU g?1）和LS（400 CFU g?1），相比之下对照土壤为100 CFU g?1（图1a）。处理堆肥茶后的土壤样本中记录了六种真菌种类：曲霉属（Aspergillus spp.）、枝孢属（Cladosporium spp.）、青霉菌属（Penicillium spp.）、根霉属（Rhizopus spp.）、Scopulariopsis spp.和酿酒酵母属（Saccharomyces spp.）（表2）。图1 这张图像的替代文本可能是通过人工智能生成的。全尺寸图像 对照土壤和处理过的样品中总微生物菌落形成单位（CFU g?1）的评估，(a) 平均真菌菌落形成单位（CFU g?1），加上(b) 平均细菌菌落形成单位（CFU g?1）×10^4。数据代表平均值±标准误差（n = 3）。不同的小写字母用于表示Tukey检验中的统计显著差异（P < 0.05）。表2 使用Bokashi堆肥茶处理的土壤样本的真菌菌落形成单位CFU g?1的平均值。全尺寸表格 LP: LS和LP处理的土壤都记录了全部6种真菌种类，而LS中记录了3种。对照土壤仅含有曲霉属（Aspergillus spp.）（表2）。关于细菌菌落形成单位CFU g?1，使用LP堆肥茶处理的土壤记录了最高的细菌CFU（3.7 × 10^4 CFU g?1），其次是LP: LS（2.6 × 10^4 CFU g?1）和LS（2 × 10^4 CFU g?1），相比之下对照土壤为1.7 × 10^4 CFU g?1（图1b）。在LS和LP: LS处理的土壤中都记录了芽孢杆菌属（Bacillus spp.）和放线菌属（Actinomycetes），而对照土壤和LP处理的土壤只有芽孢杆菌属（Bacillus spp.）（表3）。表3 使用Bokashi堆肥茶处理的土壤样本的细菌菌落形成单位CFU g?1的平均值。全尺寸表格3.3 植物分析3.3.1 主要营养植物分析 堆肥改良土壤中的必需生长矿物质浓度比对照土壤更高。钾（K?）在LP: LS处理中增加最多（1.45%），其次是LP（0.89%）和LS（0.88%），而对照土壤为0.83%（表1C）。同样，氮（N?）在LP: LS中达到最高水平（2.34%），其次是LP（1.68%）和LS（1.65%），相比之下对照土壤仅为1.47%（表1C）。磷（P??）也在LP: LS中达到峰值（6.04%），其次是LP（4.83%）和LS（3.62%），而对照土壤仅为1.31%（表1C）。所有堆肥处理都提高了植物样本的有机质（OM%）水平，超过了对照值（10.18%），在LP: LS中达到13.49%，LP中为10.37%，LS中为10.28%（表1C）。同样，碳氮（C: N）比例在堆肥应用后显著增加，与对照土壤相比（2.21），在LP: LS中增加到56.02，在LP中为9.92，在LS中为4.13（表1C）。3.3.2 种子发芽和幼苗生长标准 关于种子发芽和幼苗生长标准；对20粒Trigonella foenum-graecum种子进行了5天后的不同处理试验，结果显示对照土壤（10/20粒种子）的发芽率为50%，LS（11/20粒种子）为55%，LP（12/20粒种子）为60%，LP: LS（14/20粒种子）为70%。图2a、b、c和d中的数据显示了Dimocarpus longan的果皮和种子废弃物对Trigonella foenum-graecum种子发芽率、长度以及15天生长后幼苗的鲜重和干重的影响。Dimocarpus longan的果皮和种子废弃物应用显著提高了15天后的幼苗发芽率，LS为13粒，LP为14粒，LP: LS为15粒，相比之下对照土壤为12粒（图2a）。此外，LS、LP和LP: LS的应用显著增加了15天大Trigonella foenum-graecum幼苗的总体长度，其中LP: LS的应用效果最高（图2b）。同样，结果还显示LS、LP和LP: LS的应用显著增加了15天大Trigonella foenum-graecum幼苗的鲜重和干重（图2c）。增强的比例分别为鲜重的29%、44%和81%，干重的18%、33%和48%（图2d）。图2 这张图像的替代文本可能是通过人工智能生成的。全尺寸图像 Dimocarpus longan（LS、LP和LP: LS）的果皮和种子废弃物对Trigonella foenum-graecum种子发芽率（%）、幼苗长度（cm）以及鲜重和干重（mg）的影响。数据代表平均值±标准误差（n = 3）。不同的小写字母用于表示Tukey检验中的统计显著差异（P < 0.05）。表3 使用Bokashi堆肥茶处理的土壤样本的真菌菌落形成单位CFU g?1的平均值。全尺寸表格 LP: LS和LP处理的土壤都记录了全部6种真菌种类，而LS中记录了3种。对照土壤仅含有曲霉属（Aspergillus spp.）（表2）。关于细菌菌落形成单位CFU g?1，使用LP堆肥茶处理的土壤记录了最高的细菌CFU（3.7 × 10^4 CFU g?1），其次是LP: LS（2.6 × 10^4 CFU g?1）和LS（2 × 10^4 CFU g?1），相比之下对照土壤为1.7 × 10^4 CFU g?1（图1b）。在LS和LP: LS处理的土壤中都记录了芽孢杆菌属（Bacillus spp.）和放线菌属（Actinomycetes），而对照土壤和LP处理的土壤只有芽孢杆菌属（Bacillus spp.）（表3）。表3 使用Bokashi堆肥茶处理的土壤样本的细菌菌落形成单位CFU g?1的平均值。全尺寸表格3.3.3 光合作用色素含量 表4中的数据显示了Dimocarpus longan的果皮和种子废弃物对15天大Trigonella foenum-graecum幼苗的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的影响。LS、LP和LP: LS的应用显著增加了Chl a、Chl b和类胡萝卜素的含量，与对照相比。叶绿素a（Chl a）含量的增长率分别为29%、32%和38%，叶绿素b（Chl b）含量分别为20%、153%和180%，类胡萝卜素含量分别为14%、40%和60%。表4显示了龙眼（Dimocarpus longan）的果皮和种子废弃物（LS、LP和LP: LS）对15天大的葫芦巴（Trigonella foenum-graecum）幼苗中叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）和类胡萝卜素含量（mg g?1干重）的影响。图3a和图3b阐明了龙眼果皮和种子废弃物对15天大葫芦巴幼苗中总可溶性蛋白（TSP）和总可溶性糖（TSS）含量的影响。应用LS、LP和LP: LS处理后，TSP和TSS含量分别比对照组显著增加了30%、76%和117%（图3a），TSS含量增加了12%和143%（图3b）。图3的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

龙眼果皮和种子废弃物（LS、LP和LP: LS）对（a）总可溶性糖含量（TSS），以及（b）总可溶性蛋白（TSP），还有（c）总酚类含量，（d）黄酮类含量，和（e）丙二醛含量（MDA）对葫芦巴幼苗的影响。数据表示平均值±标准误差（n=3）。不同的小写字母用于表示Tukey检验下的统计学显著差异（P<0.05）。信息性注释包括：C. 对照组土壤，LS：龙眼种子堆肥，LP：龙眼果皮堆肥，LP: LS：龙眼（果皮：种子）堆肥，TSS：总可溶性糖含量，TSP：总可溶性蛋白含量，MDA：丙二醛。

图3c和图3d的数据展示了龙眼果皮和种子废弃物对15天大葫芦巴幼苗中总酚类和黄酮类含量的影响。应用LS、LP和LP: LS处理后，总酚类和黄酮类含量分别比对照组显著增加了28%、81%和132%。此外，果皮和种子废弃物的应用并未导致MDA含量在处理组间出现统计学上的显著变化（图3e），表明堆肥应用使脂质过氧化水平与对照组相当。

在基因表达方面，本研究考察了参与次生代谢物的几种重要酶的基因表达情况，如CHLH（图4a）、PAL（图4b）、FLS（图4c）和MVK（图4d）。与对照组相比，使用LP: LS处理的植物表现出更高的转录水平，并且几种酶的表达增加。特别是CHLH、MVK和PAL的表达分别增加了16.12倍、3.73倍和4.55倍。

龙眼堆肥（LS、LP和LP: LS）对葫芦巴幼苗中（a）CHLH，（b）PAL，（c）FLS和（d）MVK基因表达的影响。数据表示平均值±标准误差（n=3）。不同的小写字母用于表示Tukey检验下的统计学显著差异（P<0.05）。信息性注释包括：C. 对照组土壤，LS：龙眼种子堆肥，LP：龙眼果皮堆肥，LP: LS：龙眼（果皮：种子）堆肥，PAL：苯丙氨酸氨裂解酶，MVK：甲瓦龙酸激酶，CHLH：镁螯合酶的H亚基。

讨论部分指出，土壤有机肥力对全球生产至关重要，因为有机物调节着土壤-植物系统中的关键物理、化学和生物平衡。因此，将有机废弃物转化为环保肥料（如Bokashi）是一种重要的管理策略，可以改善生态系统健康并提高作物产量（Gashua等人，2023年）。虽然传统有机分解通常需要较长时间才能释放养分，但Bokashi提供了快速解决方案。它由含有有益微生物（有效微生物或EM-4）的发酵有机物制成，这些微生物加速了分解和矿化过程，使养分能够迅速被植物吸收，通常在一到两周内即可（Gashua等人，2023年；Luyima等人，2022年）。我们的结果显示养分可用性和微生物密度都有所增加。尽管实验设计没有将接种物的单独影响与土壤中的天然养分池分开，但CFU计数增加与生长改善之间的相关性表明，微生物群可能在龙眼残渣的矿化过程中起支持作用。所有堆肥处理的土壤中真菌菌落计数都有所增加，特别是在LP和LP: LS处理的土壤中，其中包含六种真菌：曲霉菌属、枝孢菌属、青霉菌属、根霉菌属、Scopulariopsis属和酵母菌属。此外，所有堆肥处理的土壤中细菌菌落计数也有所增加，特别是在LS和LP: LS处理的土壤中，这些土壤中细菌菌落计数最高，包括两个细菌群体：芽孢杆菌属和放线菌属。微生物是各种生态系统过程中的重要参与者，尤其是能提高土壤肥力。土壤细菌能够促进重要矿物质养分（如氮、磷和硫）的生物地球化学循环，这些养分对植物生长至关重要。细菌利用有机碳作为能源来促进这一循环过程（Basu等人，2021年；Gashua等人，2023年）。将放线菌加入堆肥以提高土壤肥力和作物产量是一种有效的策略，因为它们效率高、环境安全且生产成本低。放线菌通过产生1,3-β-葡聚糖酶和分解细胞壁的酶来发挥拮抗作用。另一方面，放线菌通过分泌促进植物生长的化合物、矿物质养分或促进有益微生物的繁殖直接影响植物生长。放线菌能提高土壤养分浓度，增加有机质含量，并增强土壤微生物群落。

本研究的结果表明，与非处理对照组相比，所有处理组中葫芦巴植物的生长指标（种子发芽率、幼苗长度、根长、幼苗鲜重和干重）都有所提高。其中，LP: LS处理的促进效果最为显著。LP: LS处理下的生长促进效果可能归因于较低的pH值和较高的矿物质含量，这体现在较高的电导率（EC）上。堆肥茶的酸性可能增强了微量养分的溶解度，而微生物的存在可能加速了有机种子和果皮中N、P和K的释放。这意味着所有制备的Bokashi堆肥都含有高水平的矿物质和养分，从而提高了土壤肥力并促进了植物生长。根据原子吸收光谱法（AAS）的结果，所有制备的堆肥中的关键矿物质K+ %、N+ %和P+ %均高于对照土壤；因此，处理后土壤的营养成分和肥力得到了提升。此外，所有制备的堆肥的C+ %、C:N比率和总有机质（OM%）也高于对照土壤，从而提高了所有处理土壤的肥力（Senesi 1989年；Singbah等人，2025年）。所有制备的堆肥茶均为酸性，其pH值低于对照土壤（7.5），但高于5，并且在处理后保持了土壤的pH值在7以上。这一结果适用于大多数作物生长所需的范围（pH 4.7至7.5，例如小麦、玉米、大豆、燕麦和大麦）（Singbah等人，2025年；Tong等人，2021年）。此外，所有堆肥处理都增加了真菌菌落计数，尤其是LP和LP: LS处理的土壤，其中细菌菌落计数最高。LP: LS处理中的土壤微生物，如曲霉菌属、枝孢菌属、青霉菌属、根霉菌属和Scopulariopsis属，促进了包括磷、硫和氮在内的矿物质养分的生物地球化学循环，这些养分对植物生长至关重要。细菌利用有机碳作为能源来促进这一循环过程（Basu等人，2021年；Gashua等人，2023年）。芽孢杆菌属可以显著改变土壤微生物组，可能促进植物发育，并增加土壤微生物多样性。此外，它们在抵御生物和非生物胁迫方面起着重要作用（Zhang等人，2025年；Tsotetsi等人，2022年；Gurikar等人，2023年）。

应用制备好的种子混合物后，葫芦巴幼苗中的光合色素（叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素）以及CHLH基因的水平显著增加。其中，LP: LS处理的改善效果最为明显。叶绿素的生产依赖于初始步骤，即将Mg2+结合到原卟啉中（Reid和Hunter，2002年；Sirijovski等人，2008年）。这一过程由镁螯合酶的H亚基（CHLH）介导，在不同植物中具有保守的机制。为了适应多变的环境条件，CHLH发展出多种生物活性，包括叶绿素生产、逆向信号传导和脱落酸（ABA）响应。种子的主要作用是在植物建立期间提供必需养分（Elsherif等人，2024a, b）。叶绿素水平的提高及其生物合成与光合活性的提高和生长速率的增加有关。龙眼堆肥中的果皮和种子矿物质可以直接或间接促进叶绿素的生物合成途径（El-Shenody等人，2023年；Elsherif等人，2025年）。此外，类胡萝卜素水平的提高通常与抗氧化作用有关，表明细胞功能正常（Nessem等人，2023年）。LP: LS土壤中放线菌的富集增强了光合作用，进而增加了产量。放线菌增加了土壤中的氮可用性，从而增强了关键氮代谢酶（如谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶和硝酸还原酶）的活性。

通过评估主要代谢指标，评估了龙眼果皮和种子堆肥对葫芦巴幼苗的影响。结果表明，使用堆肥茶处理的种子发芽显著提高了TSS和TSP，其中LP: LS处理的数值最高。TSS和TSP的增加主要归因于代谢活动的增强和光合作用的加速，这体现在生物量和色素水平的提高上。同样，使用天然堆肥处理的种子为植物提供了必需的养分和代谢物，如碳水化合物和蛋白质，从而促进了生长速率（El-Shenody等人，2023年）。此外，LP: LS土壤中放线菌的添加改善了光合作用，导致含氮氨基酸的水平增加，糖的浓度也提高（Jog等人，2016年）。LP: LS土壤处理可以通过多酚等促进生长的物质的存在来改善种子发芽和幼苗生长，从而促进根部和茎部的发育，从而从早期阶段增强了植物的健康。尽管总可溶性蛋白（TSP）可以作为植物代谢活动的一般指标，但其抗氧化活性与其通过酶促和非酶促机制缓解氧化应激的能力直接相关。生理上，TSP的显著增加可能表明植物具有较强的抗氧化防御系统，尤其是在植物面临环境压力或受到生物刺激时（Quan等人，2025年）。

使用龙眼果皮和种子堆肥茶后，通过测量代谢指标评估了其对葫芦巴幼苗的影响。结果表明，使用堆肥茶处理的种子发芽显著提高了TSS和TSP，其中LP: LS处理的数值最高。TSS和TSP的增加主要归因于代谢活动的增强和光合作用的加速，这体现在生物量和色素水平的提高上。同样，使用天然堆肥处理的种子为植物提供了必需的养分和代谢物，如碳水化合物和蛋白质，从而促进了生长速率（El-Shenody等人，2023年）。此外，LP: LS土壤中放线菌的添加改善了光合作用，导致含氮氨基酸的水平增加，以及糖浓度的提高（Jog等人，2016年）。LP: LS土壤处理可以通过多酚等促进生长的物质来改善种子发芽和幼苗生长，从而促进根部和茎部的发育。总体而言，TSP可以作为植物代谢活动的一般指标，但其抗氧化活性与其通过酶促和非酶促机制缓解氧化应激的能力直接相关。生理上，TSP的显著增加可能表明植物具有较强的抗氧化防御系统，尤其是在植物面临环境压力或受到生物刺激时（Quan等人，2025年）。

使用龙眼果皮和种子堆肥后，通过评估主要代谢指标来评估其对葫芦巴幼苗的影响。结果表明，使用龙眼果皮和种子堆肥茶处理的种子发芽显著提高了TSS和TSP，其中LP: LS处理的数值最高。TSS和TSP的增加主要归因于代谢活动的增强和光合作用的加速，这体现在生物量和色素水平的提高上。使用天然堆肥处理的种子为植物提供了必需的养分和代谢物，如碳水化合物和蛋白质，从而促进了生长速率（El-Shenody等人，2023年）。此外，LP: LS土壤中放线菌的添加改善了光合作用，导致含氮氨基酸的水平增加，以及糖浓度的提高（Jog等人，2016年）。LP: LS土壤处理可以通过多酚等促进生长的物质的存在来改善种子发芽和幼苗生长，从而促进根部和茎部的发育。尽管总可溶性蛋白（TSP）可以作为植物代谢活动的一般指标，但其抗氧化活性与其通过酶促和非酶促机制缓解氧化应激的能力直接相关。生理上，TSP的显著增加可能表明植物具有较强的抗氧化防御系统，尤其是在植物面临环境压力或受到生物刺激时（Quan等人，2025年）。

使用龙眼果皮和种子堆肥后，通过测量代谢指标来评估其对葫芦巴幼苗的影响。结果表明，使用堆肥茶处理的种子发芽显著提高了TSS和TSP，其中LP: LS处理的数值最高。TSS和TSP的增加主要归因于代谢活动的增强和光合作用的加速，这体现在生物量和色素水平的提高上。使用天然堆肥处理的种子为植物提供了必需的养分和代谢物，如碳水化合物和蛋白质，从而促进了生长速率（El-Shenody等人，2023年）。此外，LP: LS土壤中放线菌的添加改善了光合作用，导致含氮氨基酸的水平增加，以及糖浓度的提高（Jog等人，2016年）。LP: LS土壤处理可以通过多酚等促进生长的物质的存在来改善种子发芽和幼苗生长，从而促进根部和茎部的发育。在我们的研究中，虽然没有直接测量腐殖化指数（例如E4/E6），但葫芦巴幼苗的高发芽率和缺乏氧化应激（MDA）表明了堆肥的稳定性以及没有植物毒性的有机酸。这表明发酵过程有效地将龙眼皮和种子转化为了富含生物刺激剂的基质，从而为研究土壤碳动态提供了依据（Xing等人，2025年）。当葫芦巴幼苗接触到龙眼皮和种子堆肥时，其中含有的酚类化合物和黄酮类的累积数量显著增加。植物中的酚类和黄酮类物质在医药和食品工业中有很高的应用潜力，因此现代研究重点是它们的生物合成途径。与对照组相比，在LP:LS处理下，参与苯丙烷类途径的主要酶PAL的基因水平显著增加。PAL的激活是对初级代谢的直接响应，表明次级代谢得到了增强（Barros和Dixon，2020年）。由此可见，PAL的过表达表明苯丙烷类途径被激活，这一点得到了使用LP:LS后酚类和黄酮类物质水平增加的支持。为了进一步研究LP:LS处理后黄酮类物质的生产过程，评估了几种与黄酮类物质生成相关的酶基因的相对表达。当前的数据表明，在LP:LS条件下，植物能够产生更多的黄酮类和酚类物质。此外，与对照组相比，LP:LS处理还显著增加了FLS基因的表达，进而影响了其功能及其酶活性。FLS是黄酮醇生成中的限速酶，它编码了黄酮类代谢物合成过程中的主要酶（Liu等人，2022年；Shi等人，2022年）。FLS催化二氢黄酮醇的脱饱和反应，从而生成C-3位点羟基化的黄酮类衍生物，如鼠李素、槲皮素和山柰酚（Lei等人，2023年）。FLS的高表达会导致烟草中产生过多的槲皮素和山柰酚（Park等人，2020年）。因此，研究结果表明，LP:LS处理能够显著触发次级代谢途径，从而促进生物活性物质的生成。

萜类化合物（或异戊二烯类化合物）的结构由活性的异戊二烯前体组成，这些前体分别通过甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径和甲瓦酮酸（MVA）途径产生，这两个途径分别发生在细胞质和质体中（Tabatabaee等人，2021年）。MVK基因编码甲瓦酮酸激酶，它在将MVA磷酸化为5-磷酸甲瓦酮酸的过程中起着关键作用，而5-磷酸甲瓦酮酸是合成其他多种萜类化合物（包括甾醇和倍半萜类）的前体（Rodriguez-Concepcao和Boronat，2015年；Silva等人，2020年）。因此，我们发现使用LP:LS堆肥茶处理的植物中MVK基因显著增强，这表明该处理参与了萜类化合物的生物合成途径。此外，据报道，在拟南芥植物中MVK基因表达的增加会导致萜类化合物的产生显著增加（Lluch等人，2000年）。这种创新的功能改良剂LP:LS堆肥茶对MVK基因的表达有显著影响，表明植物的异戊二烯类生物合成途径被激活。

5 结论

本文提出了一种向循环经济转型的成功方法，通过Bokashi堆肥技术和厨房微生物将龙眼皮和种子废弃物转化为高效且环保的生物肥料。龙眼皮和种子的堆肥混合物（LP:LS）被证明是最有效的治疗方法，它能够提高土壤养分和微生物多样性，并同时增强葫芦巴（Trigonella foenum-graecum L.）的生物量、氮吸收以及次级代谢产物的生成。这些生理变化通过分子分析得到了进一步验证，分析显示控制次级代谢途径的主要基因得到了上调。通过将食物废弃物转化为高附加值的肥料，本研究提高了土壤肥力和作物品质，为小规模研究提供了一个典范，证明了零废物农业方法能够实现零废物排放，直接符合联合国2030年可持续发展目标。未来，我们计划进一步研究这种生物肥料对植物和土壤的长期毒性影响。