揭示杀菌剂如何影响大豆叶片对肥料的吸收

《Journal of Soil Science and Plant Nutrition》：Unravelling How Fungicides Affect the Absorption of Fertilizers by Soybean Leaves

　　标题：锰（Mn）和锌（Zn）混合物对可溶性叶肥中硫酸盐和EDTA螯合物与基于乳化剂和悬浮剂浓缩液的杀菌剂控制白粉病效果的影响

摘要
目的：本研究旨在探讨可溶性叶肥中的锰（Mn）和锌（Zn）混合物与基于乳化剂和悬浮剂浓缩液的杀菌剂结合使用对控制白粉病的效果。

方法：在温室条件下，使用便携式和台式X射线荧光（pXRF）设备测量了大豆植物（Glycine max L.）在V3和R1生长阶段对营养素的吸收情况，以确定其随时间的吸收动态。此外，还利用同步辐射成像技术分析了喷洒后元素在叶片表面的分布。在施药15天后评估了白粉病的严重程度，以评估病害控制效果。

结果：当锰和锌以硫酸盐形式单独施用时，吸收效果更好。然而，当EDTA螯合的锰和锌与乳化剂杀菌剂结合使用时，吸收速率超过了单独使用化肥时的吸收速率。同步辐射分析显示，在48小时内，锰和锌已完全扩散到整个处理过的叶片区域。此外，无论单独使用还是与叶肥混合使用，杀菌剂在病害控制方面都有效。

结论：可溶性叶肥与杀菌剂的混合使用会干扰营养素的吸收，但在温室条件下，没有观察到对病害控制效果的负面影响。植物种群被平均分成两个评估组：45株用于叶片吸收评估，45株用于病害控制和谷物产量评估。2.4 体内叶片吸收动力学测定在达到V2物候阶段，即出现两片完全展开的三叶叶片时，将蛭石中的植物小心转移到专门为这项分析设计的单独丙烯酸样品架中，如图S1所示。对于表1中详细列出的每种处理方法，使用微量移液器（Eppendorf Research? plus）在叶片的向阳面滴上加0.5 μL（含有2.4 μg的Mn和2.4 μg的Zn）的溶液。干燥后，在施用后1、12、24、48、72和96小时通过体内微探针X射线荧光光谱（XRF）线扫描技术评估Mn和Zn肥料的吸收动力学，无论是否与杀菌剂混合。XRF分析使用台式设备（Orbis PC，EDAX，美国）进行，该设备配备了来自Rh阳极的1毫米针孔准直X射线束，工作电压为45 kV，电流为900 μA，并选择了25-μm厚的Al初级滤光片。每个点分析15秒，光谱由硅漂移探测器（SDD）记录，死时间<10%。实验中对每种处理方法使用了5个独立的生物学重复样本。在分析期间，植物被放置在光照周期为12小时的生长室中，温度控制在27°C±3°C，相对湿度控制在80±5%。根据Corrêa等人（2021）描述的方法，获得的Mn和Zn计数率被积分并归一化到第一次测量记录的值，以评估其随时间的吸收情况。表1列出了所使用的混合液的组成。这些组合旨在模拟农民常用的喷施混合液，施用量为70 L/ha。2.5 通过基于同步辐射的X射线荧光光谱成像评估叶片组织中的元素分布利用基于同步辐射的X射线荧光光谱技术追踪叶片内吸收营养素的空间分布模式。在温室条件下生长的总共15株V2阶段的植物（每种处理3株）被进行了评估。选择了五种代表性处理：（i）对照组，（ii）Mn/Zn硫酸盐和（iii）Mn/Zn EDTA螯合物，分别考虑有无（iv, v）SC杀菌剂的情况，因为这些处理在叶片吸收方面的动力学稳定性不同。为此，大豆叶片被暴露于0.5 μL的相应溶液滴中，因为这些组代表了动力学测定中观察到的关键吸收模式。在高湿度条件下48小时后，叶片从植物上摘下，使用剃须刀片手动切割处理区域，将其嵌入最佳切割温度（OCT）介质（Tissue Plus，Fischer HealthCare，美国）中，然后立即浸入用液态氮制冷的液态异戊烷（Dinamica，巴西）中。冷冻固定的块体随后保持在-25°C，固定在粘性玻璃膜（Fitar，巴西）上，并使用冷冻切片机（CM1850，Leica，Wetzlar，德国）在-25°C下进行切割。得到的30-μm厚的切片立即放入XRF样品架中，用6-μm厚的聚丙烯（FPP25-R3，VHG，美国）薄膜密封，然后转移到光束线上。XRF映射是在巴西坎皮纳斯市Carnauba相干X射线纳米探针光束线的Tarum?终端站进行的。该光束线配备了一个水平偏转的四次反弹晶体单色器、两个四元素硅漂移探测器（Vortex-ME4，Hitachi High-Technologies Science America，美国）和一个Kirkpatrick?Baez（KB）非色差光学系统，提供约150 nm宽的X射线聚焦光斑。XRF图谱以略高于Zn K边激发能量（10300 eV）的能量在飞扫模式下记录，通过250×250 μm的全景图像，横向分辨率为5 μm。测量在室温下进行。数据使用PyMca软件（版本5.6.3，ESRF Software Group，法国）处理。每个像素单元的环电流归一化元素强度并根据光束线仪器参数进行拟合。分析使用了每种条件的3个独立重复样本。2.6 在温室条件下评估Mn和Zn的叶片吸收在R1阶段，使用带有细雾喷头的手动压力喷雾器通过叶面喷雾施用处理（表1），每株植物280 μL（含有1.19 mg的Mn和1.19 mg的Zn），从顶部到底部进行，以模拟标准田间规模的叶面喷施条件。这个数值是基于70 L/ha的混合液量和每公顷250,000株植物的前提选定的。此外，植物按照完全随机设计排列。7天后，收集最后5片完全展开的三叶叶片以确定叶片吸收的Mn和Zn含量。收集的叶片按照Embrapa（2009）确定的洗涤程序进行清洗，首先用流动水和去离子水清洗，然后用洗涤剂溶液（1%）清洗，再用去离子水冲洗。最后，将它们浸入3%的盐酸溶液中1分钟，再用去离子水冲洗一次。然后在强制循环干燥箱（FANEM，型号320/4，巴西）中干燥48小时，最后用电动研磨机（Cadence，型号MDR302-127，中国）研磨成均匀的细粉，并通过100目筛子（<150 μm）以确保分析的一致性。将一百毫克研磨后的样品加入X射线样品杯（Spex Sample Prep，编号3577，美国），用6-μm厚的聚丙烯薄膜密封，并使用玻璃棒手动压平（Montanha等人，2024）。样品使用X射线荧光光谱仪（Bruker Tracer Vision III-SD，美国）进行分析，使用40 kV和30 μA的Rh X射线管，以及304.8 μm Al + 25.4 μm Ti的初级滤光片。X射线光谱由硅漂移探测器（SDD）在120秒内记录。分析在空气压力气氛下进行。量化使用标准添加法进行，将20、50、100、150、300和1000 mg/kg的Mn和Zn（来自1,000至10,000 mg/L的Mn和Zn储备溶液，Specsol，巴西）加入到0.500 g的大豆叶片样品中。X射线样品光谱使用Spectra Artax软件（版本7.4.0.0）进行处理。Mn和Zn的Kα净强度通过Rh Kα康普顿散射进行归一化，以便进行量化分析。2.7 混合液对病害控制和植物谷物产量的影响为了评估杀菌剂与Mn和Zn肥料结合的有效性，在喷洒后15天拍摄了第三片完全展开的三叶叶片的中央小叶的照片。根据Godoy等人（2006）的二维图谱图确定病害的频率和严重程度，如图1所示。图1此图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像图表灵感来自用于确定叶部病害严重程度的等级此外，在成熟阶段，收集豆荚，并将分离出的谷物在60°C的强制循环干燥箱（FANEM LTDA型号320/4）中干燥48小时。根据Perini等人（2012）的方法，以每株植物的谷物克数测量植物产量。2.8 统计分析所有定量数据都经过了单因素方差分析（ANOVA），随后进行了Tukey事后检验，置信区间为95%。数据的正态性通过Shapiro-Wilk检验在0.05的显著性水平下进行评估。所有数据使用OriginLab（版本2022b，Northampton，MA，美国）进行处理。3 结果3.1 营养素的叶片吸收图2展示了V2阶段的植物，显示了叶片在96小时内暴露于硫酸盐和EDTA螯合Mn和Zn溶液中的吸收率，无论是否施用了杀菌剂。数据显示，当施用杀菌剂时，Mn的吸收显著下降（图2A）。具体来说，使用EC杀菌剂后12小时吸收率降至零，而SC杀菌剂最初有所增加，随后呈指数上升，最终Mn(SO4)、EC+Mn(SO4)和SC+Mn(SO4)的总吸收率分别为70%、50%和25%。图2此图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像V2阶段大豆植物中Mn和Zn的吸收。（A和C）结合或不结合EC和SC杀菌剂的Mn肥料的吸收率（%）；（B和D）结合或不结合EC和SC杀菌剂的Zn肥料的吸收率（%）。图中的条形图表示5个生物学重复样本的平均值±标准误差对于Mn[EDTA]，杀菌剂的存在提高了吸收率（图2C），组合EC+Mn[EDTA]、SC+Mn[EDTA]和Mn[EDTA]的总吸收率分别为63%、55%和42%。这表明将Mn[EDTA]与杀菌剂结合显著提高了吸收率。单独使用Zn(SO4)显示出最高的吸收率，顺序为Zn(SO?) > 可乳化浓缩物+Zn(SO?) > 悬浮浓缩物+Zn(SO?)（图2B）。总吸收率分别为42%、33%和18%。相比之下，Zn[EDTA]在与EC和SC结合的混合物中吸收得更好，达到54%，而单独使用时仅为34%。图3展示了在R1阶段，施用了Mn和Zn营养源或它们与杀菌剂混合物的叶片中的Mn和Zn浓度。值得一提的是，所有叶片都经过清洗以去除表面残留的Zn和Mn。对照组植物的叶片平均含有37 mg/kg和56 mg/kg的Mn和Zn，而暴露于EC和SC杀菌剂的叶片分别含有38 mg/kg和47 mg/kg的Mn和56 mg/kg和53 mg/kg的Zn，这表明叶面施用杀菌剂并未影响叶片中的Zn和Mn浓度。图3此图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像R1阶段大豆植物中Mn和Zn的吸收。（A和B）结合和不结合EC和SC杀菌剂的Mn肥料的浓度；（C和D）结合和不结合EC和SC杀菌剂的Zn肥料的浓度。图中的条形图表示5个生物学重复样本的平均值±标准误差，不同的字母表示处理之间存在统计学上的显著差异（p<0.05）。此外，这些结果还表明，在温室条件下，两种杀菌剂都影响了叶片对Mn和Zn的吸收。对于不使用杀菌剂的锰处理，硫酸盐来源的浓度最高，即616 mg/kg，而单独使用EDTA来源的浓度最低，为203 mg/kg。然而，当两种Mn来源与杀菌剂结合时，观察到了相反的趋势；硫酸盐来源的Mn浓度降低，而EDTA来源的Mn浓度增加。当EDTA与杀菌剂结合时，Zn的浓度最高，其次是单独使用硫酸盐的Zn，最后是单独使用EDTA的Zn。这种浓度模式在EC和SC杀菌剂处理中都是一致的（图3B和D）。由于EC和SC杀菌剂在Mn和Zn的吸收上具有类似的交互作用模式，因此只选择了EC杀菌剂来研究混合物是否会影响叶片内的元素重新分布。图4A展示了基于同步辐射的XRF映射的RGB图像，显示了大豆叶片横截面中钙（Ca）、锰（Mn）和锌（Zn）的空间分布。它还对比了特定区域细胞内外的强度（图4BC），比较了经过EC处理的叶片和未处理的叶片。XRF映射显示，无论叶片处理如何，表皮中的Mn和Zn信号几乎不存在。然而，出现了不同的分布模式，EDTA和硫酸盐处理都导致表皮中的Zn和Mn缺失，表明这些元素在细胞内的短距离传输行为不同。图像进一步表明，这些元素被有效地吸收并定位在特定的细胞区内，表明其在植物内的吸收和移动是成功的。图4此图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像V2阶段大豆植物中Mn和Zn的吸收。（A）施用48小时后的叶片横截面的250×250 μm图像；（B）标记出叶片内外的区域；（C）来自识别为细胞内外的区域的Cakα、Mnkα和Znkα的强度。数据代表了3次生物学重复实验的平均值±标准误差，不同字母表示细胞区域之间以及实验处理之间的统计学显著差异。图4C详细比较了作为硫酸盐和EDTA螯合物来源应用的Mn和Zn的强度和分布，并结合了EC杀菌剂。图3B显示了Ca的空间分布，用于区分和选择细胞内外的区域，从而能够评估有无混合物时Zn和Mn的强度。图4C展示了选定区域中Ca、Mn和Zn的强度。叶片组织中的Mn和Zn浓度在不同处理之间没有显示出显著差异，表明在V2阶段初期吸收未受到来源（硫酸盐或EDTA）或EC杀菌剂添加的影响。Mn和Zn的细胞分布在大多数处理中保持平衡，但在细胞外区域观察到更高的平均强度。然而，无论是单独使用还是与杀菌剂一起使用的硫酸盐来源的Mn，并未遵循这一模式。相比之下，EDTA螯合物来源与EC的结合导致48小时后浓度降低。

3.2 混合液对疾病控制的效果
表2展示了杀菌剂（无论是否与肥料组合）对喷洒叶片上的白粉病控制的效力（详见图S4），结果表明单独使用杀菌剂或与可溶性肥料混合使用的杀菌剂在控制白粉病方面都是完全有效的。

3.3 混合液对作物产量的影响
在施用处理后，植物一直生长到衰老阶段以评估生产结果。如表3所示，处理组之间没有统计学上的显著差异。然而，某些混合处理观察到了轻微的生产力下降。例如，杀菌剂与Mn0.54Zn0.46[EDTA]的联合使用导致生产力比未接受杀菌剂或肥料的对照组降低了13%。当这种混合处理与Mn0.54Zn.46(SO4)和悬浮浓缩液单独使用时，生产力下降了更多，达到了20%。

4 讨论
尽管叶片吸收数据显示Mn和Zn硫酸盐来源的表现优于所有其他处理，但温室实验结果显示，与EDTA螯合的Mn和Zn与SC杀菌剂结合使用，导致这些营养素在叶片中的积累更多。然而，这种积累可以归因于它们向植物其他部分的再动员减少。这一点在同步辐射成像中得到了证实，即48小时后，处理区域的元素分布保持均匀。相比之下，基于硫酸盐的来源在施用后24小时内促进了Mn和Zn的再动员，这解释了温室条件下叶片浓度的降低（Gomes等人，2019年；Rezende等人，2025年）。
我们的研究结果表明，将Mn和Zn硫酸盐来源与EC和SC杀菌剂结合使用导致这些营养素的吸收率降低。这种效应可能归因于Mn2+和Zn2+离子与杀菌剂活性成分颗粒（有机分子化合物）之间的相互作用。然而，还应考虑到其他因素，例如喷雾溶液的物理化学性质——溶解度、电荷、pH值、表面张力和潮解点——也可能影响通过叶片的养分吸收效率（Fernández和Eichert，2009年；Fernández和Brown，2013年）。例如，据报道溶液pH值的变化影响了棉花植物对三氟氯氰尿酸的吸收模式（Matocha等人，2006年），将溶液的pH值从5改为9后，吸收量分别增加了52%到60%。当向杀菌剂溶液中添加其他成分时，pH值可能会发生变化，这可能导致杀菌剂降解以及植物吸收杀菌剂方式的变化。在这里，也观察到了可溶性肥料与杀菌剂混合后的pH变化（表S3），但这种变化并未干扰白粉病的控制。
先前的研究表明，当氯氟氰尿酸与Mn硫酸盐及有机硅助剂结合使用时，角质层渗透率增加了47%，而单独使用Mn硫酸盐与有机硅助剂时，渗透率仅增加了20%；而不添加助剂的Mn渗透率低至3%（Zandonadi等人，2018年）。这些数据表明，防御性物质比Mn硫酸盐与助剂结合使用更能增强Mn的渗透。在我们的研究中，观察到Mn0.54Zn.46[EDTA]与EC和SC杀菌剂混合使用时，吸收效果有所改善。这种效应表明螯合剂与杀菌剂活性成分或其他成分之间的相互作用促进了叶片中的吸收。
另一个可能增强Mn和Zn EDTA螯合物来源与杀菌剂效果的因素是其他添加成分的正面相互作用，这些成分可以与角质层相互作用，从而促进螯合矿物质的吸收。尽管具体制造过程并未披露，但这些配方通常包括表面活性剂、稀释剂或助剂，它们可以稳定产品并 improving其渗透到植物中的能力（Defarge等人，2018年）。这种相互作用可以在碘的生物强化中观察到，六种非离子表面活性剂和油基助剂表明基于有机硅的助剂Pulse?显著增加了谷物中的碘浓度（1269 μg/kg），而单独使用KIO3时为231 μg/kg。Synerterol? Horti Oil也提高了碘水平（450 μg/kg），而其他助剂则没有显著效果（Magor等人，2023年）。同样，在使用氯氟氰尿酸时，将20 g/ha的浓度与商用助剂Natur’l Oil?（豆油93%）以0.5%的浓度混合后，小麦叶片中活性成分的吸收量增加了10 mg/kg到29 mg/kg（Melo等人，2015年）。另一个例子是在评估植物油、矿物油和醇类及酯类助剂与纳米杀虫剂、乳化浓缩液和水乳液混合物时，矿物油助剂的使用提高了湿润能力，增加了滴剂大小和渗透率，以及提高了杀虫剂的效率（Hu等人，2024年）。
在比较EC和SC杀菌剂时，注意到绝对养分吸收量存在显著差异，这可以归因于每种杀菌剂的独特配方。EC杀菌剂通常制造过程中具有更高的分散性和更细的液滴形成，粒度为0.1–10 μm，有利于吸收和养分输送（Brar等人，2006年）。相比之下，SC杀菌剂的粒度较大，范围为1到10 μm，可能会阻碍溶液渗透叶片，从而可能限制叶片吸收（Woods，2003年）。这种粒度和配方差异可能会影响养分输送效率，影响不同颗粒上吸附的Mn和Zn浓度以及由于杀菌剂颗粒聚集导致的过滤器堵塞的可能性。在观察ZnO悬浮液的吸收时，Gomes等人（2019年）发现ZnO的吸收率低于ZnSO4，这种差异归因于ZnO悬浮液的较大粒度。对于SC杀菌剂，吸收效率降低可以通过类似机制来解释，即较大的颗粒尺寸阻碍了养分在叶片表面和植物组织中的有效移动。
在研究ZnSO4在苹果叶片中的渗透时，Xie等人（2020年）观察到叶片表面的毛状体增加了疏水性，阻碍了Zn的吸收，而气孔促进了Zn的渗透。此外，低Zn水平促进了其他矿物质在叶片中的积累，而高Zn水平可能导致其与植酸的复合物形成。这些发现对于优化作物物种中的Zn生物强化策略至关重要，需要考虑叶片表面特性和Zn的施用量。我们的叶片横截面图显示，除了被吸收外，养分还通过非质体和质部区域传输，从而根据每种养分的移动性重新分配到叶片和植物的其他部分（Benitez-Afonso，2014年）。
另一方面，将吡虫啉（初始pH 6.32，电导率4 μS cm?1）与硫酸锰混合后，pH值降至4.55，电导率升至1729 μS cm?1。这种变化影响了蚜虫（Triozoida limbate）的控制效果，单独使用吡虫啉在7天后减少了20%的虫害，而在与硫酸锰混合后，7天后虫害增加了27%，14天后减少了54%，表明在控制蚜虫方面效果受到了抑制（Zandonadi等人，2019年）。与上述报道不同，本研究中发现，可溶性肥料与杀菌剂的混合液并未降低低病害压力下的疾病控制效率。
本研究观察到的疾病控制效果良好，特别是Mn0.54Zn0.46与乳化浓缩液和悬浮浓缩液杀菌剂的混合液，这与Bernads等人（2005年）研究除草剂时的观察结果相反。评估了来自硫酸盐、柠檬酸和EDTA螯合物来源的Mn、Fe、Cu和Zn养分与草甘膦及商业助剂CANG和NT混合物的效果，观察到草甘膦的吸收和转运效率存在拮抗作用，Zn硫酸盐（0.6 kg/ha）+ 助剂CANG（2.5% v/v）+ 草甘膦（0.28 kg/ha）的组合降低了高达99%。尽管有这种大幅降低，但最大的干扰因素是助剂CANG，因为当改变助剂为NT时，控制效果仅为54%。因此，除了养分之间的相互作用外，助剂也可以增强杀菌剂的拮抗作用。
此外，一项使用六种不同植物提取物来控制番茄植株晚疫病的研究评估了这种组合在温室和田间条件下的效果。在温室中使用1%和5%的浓度分别使疾病严重程度降低了48.6%和55%。在田间，仅5%的浓度就使疾病严重程度降低了35%。这些数据表明，在温室条件下较小的剂量可能比在田间使用较高浓度更有效（Sallam，2011年）。上述发现表明，本研究获得的疾病控制效果不一定可以推广到田间条件，即使Mn(SO4)和Zn(SO4)与杀菌剂的反应在温室中没有影响疾病控制，也不意味着在田间条件下也会出现相同的结果，因为田间环境中杀菌剂的浓度可能会有所不同。

5 结论
总之，当从硫酸盐来源添加到混合液中时，Mn和Zn的吸收受到损害，其中EC和SC杀菌剂的效应更为显著，减少了45%。另一方面，来自EDTA螯合物来源的Mn0.54Zn0.46的吸收效率低于与两种杀菌剂混合使用的效果，与单独使用相比增加了21%。在可溶性肥料与杀菌剂混合使用的情况下，对疾病控制或作物产量没有影响。然而，仍需进一步的田间评估，以确保未来仅基于本研究的假设不会影响疾病控制或作物产量的有效性。这些发现表明，混合物中的pH值和电导率的变化表明存在影响养分吸收效率的反应。