经生物刺激剂处理的芒草（Miscanthus × giganteus）在植物管理中的应用：关于深根系形成、金属固定及吸收能力的双层根系研究实验

《Plant and Soil》：Biostimulant-treated Miscanthus?×?giganteus for phytomanagement: a two-layer rhizotron experiment on deep rooting, metal phytostabilization and uptakes

　　摘要
背景与目的
利用多年生能源作物巨型芒草（Miscanthus × giganteus）对受金属污染的土壤进行植物管理是一种经济有效的方法，它将宝贵的生物质生产与金属的植物固定相结合。为了在不利条件（例如水资源短缺）可能阻碍植物生长的退化地区恢复植被，应用根系生物刺激剂可以增强植物的适应性和深层根系发育。本研究评估了菌根真菌和腐殖质物质（MB处理）对在受金属污染土壤中生长的巨型芒草的影响，具体包括：巨型芒草的深层根系生长、根部金属吸收以及土壤剖面中金属生物可利用性的变化。

方法
在温室圆柱形根室（66升）中栽培了经MB处理和未经处理的植物，从而能够研究两个叠加土壤层（L1（0–0.45米）和L2（0.45–0.90米）中的深层根系生长。这种来自前垃圾填埋场的土壤受到锌和铜的污染，同时还受到少量镍和铅的污染。

结果
MB处理显著提升了巨型芒草的根系生长表现，使其根系水分吸收效率提高了2.5克/升，干根密度几乎达到对照植物的四倍。此外，经MB处理的植物对锌、铜和铅的吸收量也更大。收获时，MB处理降低了土壤孔隙水中铜的浓度，而通过NH4NO3提取的铅和锌浓度在L2层也有所下降。

结论
MB处理促进了巨型芒草的建立，并增强了其金属固定能力。尽管根部金属吸收量增加，但地上部分金属浓度未发生变化，这证实了巨型芒草具有排除金属的能力，使其仍适合用于生物燃料生产。

引言
扩大低温室气体排放的木质纤维素作物的种植对维持生物能源供应链（Clifton-Brown等人，2023年）和实现全球及欧盟的二氧化碳减排目标至关重要（联合国环境规划署，2022年；欧盟议会，2023年）。在此背景下，开发能够将木质纤维素的三大主要成分——纤维素、半纤维素和木质素——转化为生物燃料和其他生物产品的生物精炼厂是欧盟的重点任务。利用边际和退化土地（不包括为生物多样性和其他生态系统服务预留的土地），如受污染的土壤，可以增加当地的生物质供应，同时避免与粮食作物的竞争。这种方法符合欧洲立法中规定的可持续性标准和额外性措施（Clifton-Brown等人，2023年；欧盟委员会，2022年；Sallustio等人，2022年）。因此，对受金属污染土壤的植物管理越来越受到关注，这是一种基于自然的解决方案，通过种植高产工业作物来调节土壤-植物-微生物相互作用，以减少金属的存在（植物提取）和潜在迁移（植物固定）（Perlein等人，2023年；Robinson等人，2009年）。除了减轻污染外，植物管理还可以改善土壤健康，促进碳封存和生物多样性恢复（Erickson和Roozeboom，2021年）。已经有许多成功的田间规模案例研究（Mench等人，2018年；Thijs等人，2018年；Nsanganwimana等人，2015年）。对于农业或城市压力较小的大面积受污染区域，植物管理是一种经济高效且更可持续的原位替代方案，相比传统的物理化学修复技术，后者往往会破坏土壤结构和肥力（Perlein等人，2023年）。这种方法的相对简单性和可扩展性使其特别适用于欧洲超过两百万个受污染的场地，其中许多场地仍未被登记或开发（Panagos等人，2013年；Pérez和Eugenio，2018年）。

传统的针对金属提取的植物修复策略依赖于超积累植物，在某些情况下可以进行农艺利用，例如在超基性土壤中使用Alyssum属植物进行镍的农业采矿（Van Der Ent等人，2015年），以及几种用作生态催化剂的Noccaea caerulescens种群（Grison和Lock Toy Ki，2021年）。然而，这些物种通常产生的生物质不足以用于大规模的生物精炼应用，而木质纤维素能源草本植物则不同。虽然这些草本植物可以耐受并在地上部分积累一定浓度的某些金属（例如Sorghum bicolor中的锌和镉），但它们通常缺乏在地上部分储存组织中积累和隔离高浓度金属所需的特殊生理机制（Leitenmaier和Küpper，2013年；Rabêlo等人，2021年；Peroni等人，2024a）。然而，它们广泛的根系和强大的根沉积活动使其在植物固定方面特别有效。它们的高地上部分生物量和多年生生长习性也有助于逐渐从土壤中清除生物可利用的污染物（Rabêlo等人，2021年）。因此，它们更适合金属含量适中或较低的土壤，并且植物毒性风险较低，这种状况可以通过使用土壤改良剂进一步缓解（Vangronsveld等人，2009年；Rabêlo等人，2021年；Krzy?ak等人，2023年）。在意大利，现行立法鼓励采用植物管理方法，促进快速生长和耐逆境的物种进行植物提取和植物固定。然而，这些激励措施目前仅适用于耕作农业环境中的树木物种（部长法令，2019年）。巨型芒草是一种多年生C4木质纤维素作物，由于其高生物量生产力、较低的农艺投入需求（特别是氮肥需求）以及高水分利用效率，它是一个有前景的替代品（Monti等人，2019年；Heaton等人，2010年）。然而，在建立阶段，这些特性不太明显，因为植物会将大部分资源用于通过根系探索较大的土壤体积，从而增强其对不利条件（如水资源短缺）的抵抗力（Black等人，2017年）。成熟时，在地中海地区的传统农田条件下，巨型芒草每公顷可以产生超过15兆克的地上部分生物量（干重），尤其是在冬季每年收获的情况下（Monti等人，2015年）。此外，它还可以在各种类型的边际土地上成功种植，使其成为不断扩展的生物经济中的有前景作物（Clifton-Brown等人，2023年）。其生物量的多功能性进一步增强了其吸引力，因为它可用于多种生物能源途径（例如燃烧、厌氧消化和液体生物燃料生产），以及广泛的生物基应用（Winkler等人，2020年）。

在受控条件下，高剂量的金属（如铅、锌以及三价和六价铬）暴露只会部分抑制巨型芒草的生长，同时允许其地上部分适度吸收金属（Arduini等人，2006年；Barbosa等人，2015年）。在田间条件下，巨型芒草表现出将大量地上部分生物量生产与有效植物固定相结合的能力，从而降低了金属的生物可利用性（Nsanganwimana等人，2021年；Rusinowski等人，2019年）。其强大的植物固定能力部分归因于根表面形成的铁质斑块，这增强了金属阳离子和砷物种的吸附和共沉淀作用（Nsanganwimana等人，2014年；Xin等人，2022年）。这些过程的有效性，以及巨型芒草作为根茎多年生植物提供的其他关键生态系统服务（例如，增强的水分保持和碳固定），随着其根系的扩展和加深而增强（Heaton等人，2010年；Bardgett等人，2014年；Rusinowski等人，2019年）。它还被提议用于非农业、受污染和退化地区的植被恢复，如棕地（Mamirova和Pidlisnyuk，2024年）。当植物发育受到边际条件和生物物理限制时，应用定制的农艺措施对于确保植物管理系统的效率至关重要（Kidd等人，2015年）。目前，由于微生物和其他生物刺激剂对植物的多重有益作用，它们的使用引起了极大的兴趣。这些产品可以直接增强土壤资源的吸收（例如养分、水分），并刺激关键生理过程（例如抗氧化反应），同时相比合成农用化学品具有显著的环境优势（Rouphael和Colla，2020年）。腐殖质物质和菌根对于支持巨型芒草在植物管理系统中的建立和表现特别重要，因为它们可以扩大根系探索的土壤体积，并通过腐殖质功能团和真菌细胞壁成分（如几丁质和壳聚糖）螯合金属（G?hre和Paszkowski，2006年；Canellas和Olivares，2014年）。在Peroni等人（2024年）的研究中，每周施用0.5克的腐殖质物质（持续11周）结合丛枝菌根真菌（每个根茎15克）被证明可以促进中国在镉和铬污染土壤中巨型芒草的生长和地上部分金属的输出，这种巨型芒草在中国是当地特有的且最广泛用于生物质生产的物种（Hou和Yi，2023年；Wang等人，2022年）。在Ofori-Agyemang等人（2024b）的研究中，这种组合降低了土壤孔隙水中镉和锌的浓度，同时提高了M. giganteus的地上部分干重产量，在这种法国土壤中同时受到镉、铅和锌的污染。然而，这两项研究都是在根部受限的盆栽条件下（12升体积）使用微繁殖的幼苗进行的。此外，它们没有评估该处理对使用根茎在更深土壤层中根系发展和金属吸收的影响，而这通常是田间条件下的做法（Heaton等人，2010年；O’Loughlin等人，2017年）。在非限制条件下研究根系的深入情况对于获得可靠的田间规模见解至关重要（Daniela Silva和Beeson，2011年），因为在这些条件下直接测量往往具有破坏性，且耗时费力（Urfan等人，2022年）。根据Neukirchen等人（1999年）的研究，在田间条件下，不到三分之一的巨型芒草根生物量集中在表土（0–30厘米）内。土壤剖面中的任何不连续性，例如孔隙度、有机物含量或元素生物可利用性的变化，都可能物理限制根系穿透和水分吸收（Holder等人，2025年）。因此，评估根系在早期生长期间是否能在底土中有效建立，以及它们对巨型芒草整体发展和金属生物可利用性变化的贡献是相关的。

本研究假设，将腐殖质物质和丛枝菌根真菌结合起来，可以增强在从前非法垃圾填埋场收集的受污染土壤中种植的巨型芒草的第一年根系生长。这种组合预计会增加根部金属吸收，并在不同土壤深度和湿度梯度下差异性地影响金属的生物可利用性。这些效应反过来将有利于巨型芒草在农艺条件不利、受污染区域的后续建立。为了验证这一假设，实验在近1米深的圆柱形根室中进行，以便在受控的中型生态系统中进行因子研究，详细研究代表巨型芒草根系生长及其与土壤湿度相互作用的深度（Griffiths等人，2022年）。实验结束时，使用双重分析方法量化了土壤中可利用的金属部分。首先，通过NH4NO3提取的方法确定可利用的金属，这种方法被认为适合估计容易移动的金属（例如锌、镉和镍）的生物可利用性。意大利主管当局认为这是评估根系和微生物容易吸收的金属部分的技术上最合适的程序，尽管尚未具有法律约束力（Emilia-Romagna大区，2022年）。因此，在实验之前采用了这种方法进行初步的土壤特性分析。其次，通过土壤孔隙水中的金属浓度来评估金属的生物可利用性，这提供了更直接的指示，尽管这种方法仍需进一步验证（Kim等人，2015年）。因此，本研究比较了这种方法在评估芒草根系对降低可变金属组分影响方面的效果与通过硝酸铵提取获得的结果。

**材料与方法**

**实验设置**
试验在十个圆柱形根箱中进行（体积66升，高度1米，直径0.3米），每个根箱内填充了受污染的土壤（见下文），填充高度达到0.9米（图1）。根箱放置在一个完全封闭的铝制框架内，框架表面覆盖有隔热聚碳酸酯板，以保持根部处于黑暗环境中，这与Zegada-Lizarazu和Monti（2019）的研究方法一致。每个根箱内分别在0.3米和0.6米深度放置了两个预先校准的土壤湿度探头（TDR；Spectrum waterscout SM-100），以提供来自两个相等土壤层的代表性数据：L1=0–0.45米深度和L2=0.45–9米深度（图1）。这些传感器连接到自动数据记录器上，记录了整个实验过程中的土壤湿度变化。整个系统置于一个温室中，室内平均温度保持在23.8±3.5°C，相对湿度为59.6±8.9%，并允许自然阳光通过透明的温室屋顶进入，以避免阴影效应。

**土壤制备与表征**
受污染的土壤取自意大利博洛尼亚市周边的“Chiarini”站点（44° 50' N, 11° 28' E）。该地区曾是一个非法垃圾填埋场，长期接受工业、手工艺和建筑活动产生的废物非法处置。2009年，当地有关部门对该地点进行了检测，发现其中含有多种金属超标，符合意大利立法法令152/06的规定：Ni、Pb、Cu和Zn（Simoni 2009）。2022年11月，收集了1米深的土壤样本，经过5毫米筛分后，放入混凝土搅拌机中混合，然后再填充到圆柱形根箱中。每个根箱每周用1升去离子水湿润土壤，持续4个月，以使土壤均匀压实。在填充根箱的过程中，每个层次各取了一个土壤样本进行分析，以检测假总金属（loid）浓度。此外，还获得了三个混合子样本，用于检测初始生物可利用部分和土壤的物理化学性质。实验前的土壤特性见表1和表2。假总金属浓度是通过王水（HCl: HNO3，3:1 v/v）酸消化后，利用电感耦合等离子体光发射光谱法（ICP-OES）测定的（表1）。初始生物可利用部分则是按照Gryschko等人（2005）的方法，用1M NH4NO3提取测定的。具体步骤是将50毫升1M NH4NO3溶液加入到20克经过2毫米筛分的风干土壤中，搅拌2小时后，通过无灰滤纸过滤。所得溶液由电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）分析（表1）。所用土壤为壤土-砂质土壤，呈微碱性，含有大量石灰石以及丰富的有机物质和大量大量元素（氮、磷和钾）。尽管某些根箱中镍和铅的含量略高于意大利法定限值，这可能是由于垃圾填埋场土壤中存在金属颗粒所致。

**植物栽培与处理**
2023年3月，从意大利博洛尼亚大学Cadriano实验农场（44° 56' N 11° 41' E）2008年建立的芒草种植园中采集了根茎。从0.3米深度挖掘出至少带有一个生长芽的60个根茎，将其放入装有沙子的2.6升盆中，置于18–20°C的受控环境室中，并每天用去离子水灌溉。14天后，挑选出10个长出芽和一片叶子的根茎。这些根茎从沙子中取出，冲洗并称重（93.8±36.7克），然后种植在根箱中，深度为0.1米。试验持续204天，从2023年3月23日至10月13日，采用完全随机设计，每个处理重复五次。处理措施包括：（i）根际生物刺激剂和菌根的组合（MB）；（ii）不施用任何生物刺激剂的对照组（C）。MB处理（Ofori-Agyemang等，2024b；Peroni等，2024）使用了两种产品：
- **菌根（M）**：一种含有7种天然存在于欧洲土壤中的丛枝内生菌根真菌的接种混合物：Claroideoglomus claroideum、Rhizophagus irregularis、Claroideoglomus etunicatum、Funneliformis mosseae、Claroideoglomus lamellosum、Septoglomus deserticola和Rhizophagus diaphanus（Symbivit?，Symbiom，CZ），将其涂布在惰性粘土和沸石基质上。种植时每根茎施用10克（相当于最少2000个感染性繁殖体，根据生产商提供的最可能数量测试，平均为3300个）。粉末状产品直接撒在土壤孔洞表面，然后覆盖上相同的受污染土壤，并用0.5升去离子水灌溉以促进孢子产生。供应商保证产品不含病原体和土壤颗粒。基于Ofori-Agyemang等（2024b）的研究结果，假设根系得到了菌根定殖。由于无法对大量土壤（1米深）进行灭菌处理，同时为了保持中观实验结果与实际田间条件的相关性，未直接测定根系菌根化指数。
- **根际生物刺激剂（B）**：基于腐殖酸（75% m/m）和富里酸（5% m/m）（提取自Leonardite）以及有机碳（20% m/m）（Lonite 80SP?，Alba Milagro，IT）。共进行了两次土壤处理：第一次在种植后12天（Tejera和Heaton，2017所述），第二次在第一次处理后大约一个月，即生长阶段32天（种植后67天）。两种处理中，每株植物的施用剂量均为0.3克，溶解在0.5升水中并充分混合。在整个实验期间，根据土壤湿度探头的读数，每2–3天浇水一次。种植后29天开始灌溉，手动加入足够的水量，使两个土壤层的含水量恢复到盆栽容量的90%（图2）。L2层的平均含水量约为总持水能力的76%（15±1.4%），而L1层仅为46%（9±1.7%）（图2）。

**实验过程与结果展示**
实验期间对处理的芒草植物（MB）的平均灌溉量用灰线表示，对照组芒草植物（C）用黑线表示。水量（垂直轴单位为毫米）是根据土壤湿度探头的数据计算得出的，目的是将两个土壤层的含水量恢复到盆栽容量的90%。横轴表示种植后的天数（DAT）。

**植物与土壤采样、分析及计算**
收获时测量了多个形态学和生物测量参数：主茎高度、基部直径、主茎上的总叶片数和完全展开的叶片数；总蘖数、每株植物的叶片总数；最大叶片长度和宽度。随后，将植株剪下并称重以测定其鲜重（SFW），然后在60°C的烤箱中烘干至恒重（SDW）。干燥后的植株被研磨至颗粒大小小于1毫米（Fristch Pulverisette 19），取0.5克子样本在微波炉（Marsxpress，CEM，美国）中加热20分钟，加入5毫升65%浓度的HNO3、2毫升H2O2和1毫升蒸馏水。同时加入了一份认证参考材料（BIPEA maize V463）和三个空白试剂。使用ICP-MS测定消化液中的金属（loid）浓度。除了作为该地区污染物的Cu、Ni、Pb和Zn外，还测定了镉（Cd）、铬（Cr）、铁（Fe）、钙（Ca）、镁（Mg）、锰（Mn）、钼（Mo）、磷（P）和钾（K）的浓度，以详细研究金属吸收动态，参考了Lange等人（2017）的建议。收获时，在每个土壤层孔洞中放置了Rhizon MOM采样器（Standard Rhizons ?，Rhizosphere Research Products，NL）以收集孔隙水（SPW），40毫升样品在4°C下保存，待后续进行ICP-MS分析，检测Ni、Pb、Cu、Zn、Cd、Cr、Co、Fe、Ca、Mg、Mn、Mo、P和K。通过圆柱形取芯钻（45.53立方厘米）从同一孔洞采集每个土壤层的样本（图1）。从每个土壤样本中小心分离出根系，然后将其储存在4°C下，待用1M NH4NO3提取。所得提取物（AN）的制备方法与实验开始时采集的土壤样本相同。根系用自来水冲洗以去除附着的土壤颗粒，再用去离子水冲洗，用滤纸吸干后称重以测定鲜重，随后在60°C的烤箱中烘干以确定干重。根系分析在认可的外部实验室进行：将根系研磨并在压力下用硝酸（HNO3）消化。根据欧洲标准UNIEN 13805:2014，通过ICP-OES测定镍、Pb、Cu和Zn的浓度。

**数据统计与解释**
数据统计分为三个步骤进行。首先，考虑了地上部分植物的相关参数，并通过双代码T检验（p≤0.05）验证了MB处理的效果，前提是满足正态性和同方差性假设，检验的变量包括：SFW、SDW、“植物与土壤采样、分析及计算”部分描述的生物测量参数、叶片水分利用效率（WUE）、叶片元素浓度以及Ni、Pb、Cu、Zn的吸收量。其次，考虑了地下部分植物的相关参数（FRDs、DRDs、RDWs、根系水分利用效率、根系金属浓度、总根系金属吸收量和TFs）以及土壤参数（平均湿度、金属BCFs、最终土壤AN和SPW元素浓度），并进行了空间重复测量方差分析（ANOVA），以解释不同深度的多次采样结果。将单个植株作为分析对象，两层土壤（L1和L2）作为组内因素，处理措施（MB和C）作为组间因素。采用适当的广义最小二乘模型（GLS）对每个参数进行建模，其中考虑了异方差性。对于统计上显著差异的处理组（p≤0.05），进行了Fischer的LSD事后检验来比较平均值。最后，对四组变量进行了多元分析，根据其性质进行了分类处理。采用这种方法是为了避免由于在不同类型的变量上强制进行降维处理而可能导致的信息丢失（Murphy和Patrick 2010）。

1) 植物发育指标（SFW、SDW、在“植物和土壤采样、分析与计算”部分描述的生物测量参数、RDW-L1、RDW-L2、地上部水分利用效率（WUE）、根部水分利用效率（WUE-L1、WUE-L2）、两层土壤的平均湿度、初始根茎重量以及提供的总灌溉水量）。

2) 地上部离子组成（地上部镍（Ni）、铅（Pb）、铜（Cu）、锌（Zn）、镉（Cd）、铬（Cr）、铁（Fe）、钙（Ca）、镁（Mg）、锰（Mn）、钼（Mo）、磷（P）和钾（K）的浓度。

3) 根部的离子组成（两层土壤中镍（Ni）、铅（Pb）和铜（Cu）的浓度。

4) 试验结束时L1和L2层土壤中生物可利用的镍（Ni）、铅（Pb）、铜（Cu）和锌（Zn）的浓度，包括吸附在土壤颗粒表面（SPW）和自由存在于溶液中的（AN）。在通过Grubbs检验确认没有异常值后，对每个组进行了主成分分析（PCA），生成了相关矩阵，并排除根据皮尔逊积差相关系数（p ≤ 0.05）判定与其他参数无统计相关性的参数，同时确保在描述能力方面损失最小；最终基于特征值大于1的标准化值提取了主成分（Onofri等人2010）。前两个步骤使用的是R软件4.3.0版本；第三步的多变量分析使用了Statgraphics Centurion软件19版本。

**结果**

**地上部分产量和生物测量特征**

总体而言，芒草植株在不同处理下的地上部分产量和生物测量特征之间的差异较小。MB处理组的地上部鲜重（SFW）和干重（SDW）（分别为96.2克和43.4克）平均高于C处理组（分别为88.0克和38.9克），MB组内部变异性较小，但未导致显著差异（图3a和b）。在其他生物测量特征方面，MB组与C组相比有两个显著差异：一是分蘖数平均增加了1.6个，二是每株植物的总叶片数增加了约32%（图3c和d）。对于其他生物测量特征以及地上部水分利用效率（WUE），也未发现显著差异（见表1和图1补充材料）。

**图3**

该图的替代文本可能是利用人工智能生成的。

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(a) 试验结束时收获的SFW和SDW产量；(b) 每株植物的分蘖总数；(c) 叶片总数。通过独立样本的双编码t检验（p ≤ 0.05）比较了具有根部处理的芒草植株（MB）与未经处理的对照植株（C）。箱形图的上下须表示最大值和最小值；橙色矩形的上下边界分别代表第一和第三四分位数；橙色矩形内的水平线表示中位数，x轴表示平均值。均值之间的差异通过Fisher的LSD检验区分，结果用箱形图上方的字母表示。

**根密度和水分吸收效率**

MB处理显著提高了每升灌溉水产生的根干重（R-WUE），增加了约2.5克（图4，p ≤ 0.05）。这一效应也体现在DRD上，MB处理组的DRD增加了0.7毫克/立方厘米（图5a）。对于FRD（图5b），发现了处理*层交互作用。

**图4**

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根部水分利用效率（R-WUE）计算为RDW产量与灌溉水量的比值。通过空间重复测量ANOVA比较了具有根部处理的芒草植株（MB）与对照植株（C）（p ≤ 0.05）。箱形图的上下须表示最大值和最小值；橙色矩形的上下边界分别代表第一和第三四分位数；橙色矩形内的水平线表示中位数，x轴表示平均值。均值之间的差异通过Fisher的LSD检验区分，结果用箱形图上方的字母表示。

**图5**

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**全尺寸图像**

试验结束时的根干密度（a）和鲜密度（b）。通过取L1（0–0.45米深度）和L2（0.45–0.9米深度）两个土壤层的代表性样本，比较了具有根部处理的芒草植株（MB）与对照植株（C）。通过空间重复测量ANOVA测试了处理和层效应（p ≤ 0.05）。直方图的上限表示均值，误差棒表示标准差。均值之间的差异通过Fisher的LSD检验区分，结果用直方图上方的字母表示。

**植物离子组成 – 地上部镍（Ni）、铅（Pb）、铜（Cu）和锌（Zn）的吸收**

与SFW和SDW类似，MB处理并未增加地上部Ni、Pb、Cu和Zn的浓度或它们的吸收量（表4）。相比之下，根部Ni和Zn的浓度显示出处理*层交互作用（图6a和d）。对于这些金属，C处理组的L1层浓度最高（Ni为19毫克/千克干物质，Zn为142毫克/千克干物质），而L2层浓度最低（Ni为11毫克/千克干物质，Zn为115毫克/千克干物质），而MB处理的浓度与C处理的任一层值均无显著差异。然而，根部的Pb和Cu浓度并未受到这两个因素的显著影响，尽管存在数值趋势（图6b和c）。最后，MB处理组的总根部吸收量分别增加了330%的Pb、282%的Cu和309%的Zn，而Ni的处理组平均值虽略高于C处理组，但差异不显著（图7）。表4显示了地上部Ni、Pb、Cu和Zn的浓度及吸收量。通过独立样本的双编码t检验（p ≤ 0.05）比较了具有根部处理的芒草植株（MB）与对照植株（C）。均值之间的差异通过Fisher的LSD检验区分，结果用平均值和标准差旁边的字母表示。括号内的数值为标准差。

**图6**

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**全尺寸图像**

根部Ni（a）、Pb（b）、Cu（c）和Zn（d）的浓度。通过取L1（0–0.45米深度）和L2（0.45–0.9米深度）两个土壤层的代表性样本，比较了具有根部处理的芒草植株（MB）与对照植株（C）。通过空间重复测量ANOVA测试了处理和层效应（p ≤ 0.05）。直方图的上限表示均值，误差棒表示标准差。均值之间的差异通过Fisher的LSD检验区分，结果用直方图上方的字母表示。

**图7**

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**全尺寸图像**

总根部Ni（a）、Pb（b）、Cu（c）和Zn（d）的吸收量，计算方法为根部金属浓度与RDW产量的乘积。通过取L1（0–0.45米深度）和L2（0.45–0.9米深度）两个土壤层的代表性样本，比较了具有根部处理的芒草植株（MB）与对照植株（C）。通过空间重复测量ANOVA测试了处理和层效应（p ≤ 0.05）。直方图的上限表示均值，误差棒表示标准差。均值之间的差异通过Fisher的LSD检验区分，结果用直方图上方的字母表示。

**植物修复指数**

根据BCF和TF指数，仅发现Pb存在统计差异，因此图8中仅展示了Pb的指数（Ni、Cu和Zn的相应指数见补充材料表2）。详细来说，其BCF值受土壤层的影响显著，而不受所用生物刺激剂的影响，即L1层的BCF值为0.24，显著高于L2层的0.18，因此在图8a中将MB和C处理合并显示。考虑TF指数时，处理*层交互作用显著，L2层的TF值（0.02）显著高于其他层（所有层的TF值约为0.01）（图8b）。然而，在这两种情况下，指数值都非常低，尤其是TF指数，Pb的指数也比Ni、Cu和Zn的低。

**图8**

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**全尺寸图像**

Pb的生物富集因子（BCF）（a）和转移因子（TF）（b）。通过取L1（0–0.45米深度）和L2（0.45–0.9米深度）两个土壤层的代表性样本，比较了具有根部处理的芒草植株（MB）与对照植株（C）。通过空间重复测量ANOVA测试了处理和土壤层效应（p ≤ 0.05）。直方图的上限表示均值，误差棒表示标准差。均值之间的差异通过Fisher的LSD检验区分。

**土壤样品中的生物可利用金属**

土壤层显著影响了Pb和Zn的吸附量（AN）（图9b和d）。对初始和最终吸附量差异的分析验证了图9中直接评估的结果。对于这些金属，L2层的值显著低于L1层，即Pb降低了26%，Zn降低了16%，且与MB或C处理无显著差异，这些结果在图9中合并显示。L2层的Ni和Cu平均浓度也较低（图9a和c），尽管与L1层没有统计学差异。关于SPW元素浓度（表5），Pb、Cd、Fe、Mn和P的浓度低于ICP-MS的定量阈值。MB处理降低了SPW中的Cu浓度（即降低了18%）。Co在L1层的浓度仅为L2层的一半。

**图9**

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**全尺寸图像**

根据土壤层不同，土壤样品中最终1M NH4NO3提取浓度下的Ni（a）、Pb（b）、Cu（c）和Zn（d）。通过空间重复测量ANOVA测试了处理和土壤层效应（p ≤ 0.05）。直方图的上限表示均值，误差棒表示标准差。均值之间的差异通过Fisher的LSD检验区分。

**表5**

通过空间重复测量ANOVA比较了具有根部处理的芒草植株（MB）与对照植株（C）（p ≤ 0.05）。所有值均以μg L?1表示。

**多变量分析**

从对芒草植物发育进行的PCA中提取了四个主成分（图10a），解释了约90%的总方差；两个主要轴解释了58.74%的方差（PC1 = 33.24%和PC2 = 25.50%）。分析中排除了最大叶宽。一组参数对PC1有正面影响，这些参数与根密度和两层土壤的水分利用效率以及生物测量参数（如每株植物的分蘖总数和叶片总数）相关，MB处理在这些参数上具有统计学意义。L2层的总叶片数与水分利用效率呈正相关（r = +0.66，见图3补充材料）。L2层的平均湿度也被纳入这一组，而植物高度则呈现负相关（r = ?0.74，见图3补充材料），位于第二象限，与L1层的平均湿度一起。PC2主要受SFW和SDW的影响。

**图10**

该图的替代文本可能是利用人工智能生成的。

**主成分分析（PCA）**

(a) 植物发育；(b) 地上部离子组成；(c) 根部离子组成；(d) 生物可利用金属浓度。对于植物发育，考虑了以下生物测量和生长参数：地上部鲜重（SFW）、地上部干重（SDW）、最大植株高度（Ht）、主分蘖上的总叶片数（TLT）、主分蘖上的扩展叶片数（ELT）、每株植物的分蘖数（NT）、每株植物的总叶片数（TLP）、最大叶片长度（MLL）、两层土壤中的根干密度（DRD-L1和DRD-L2）、地上部水分利用效率（S-WUE）、两层土壤中的根部水分利用效率（R-WUE-L1和R-WUE-L2）、两层土壤的平均湿度（AM-L1和AM-L2）、初始根茎重量（RW）以及提供的总灌溉水量（Ir）。在叶片离子组中，考虑了Ni、Cu、Zn、Cd、Cr、Fe、Mg、Mn和K的浓度（SC）。在根际离子组中，考虑了表土层（RC-L1）中根部的Ni、Pb、Cu和Zn浓度，以及底土层（RC-L2）中根部的Pb、Cu和Zn浓度。对于生物可利用金属浓度，考虑了NH4NO3提取物和土壤孔隙水中这两种土层中的金属浓度（分别对应AN-L1、AN-L2、SPW-L1和SPW-L2）。每个图形的PC1轴由水平黑线表示，PC2轴由垂直黑线表示，所考虑的变量位置由橙色线条标出。在叶片和根际离子组的PCA分析中（分别见图10b和c），两个主要组分分别解释了82.64%和83.15%的变异。在这两个图形中，所有参数都分布在第一和第四象限之间，显示出显著的相关性，并正向驱动PC1轴。对于叶片离子组（图10b），叶片Zn浓度是PC1轴的主要驱动因素（占61.01%），与叶片Mn、Ni、Cr、Cd和Fe浓度有较高的相关性（见补充材料图4）。至于PC2轴（21.63%），只有少数参数对其有正向影响，尤其是K-SC。Pb-SC、Ca-SC、Mo-SC和P-SC未被纳入分析。对于根际离子组（图10c），L1层中的金属浓度之间的相关性比L2层中的更强（见补充材料图5），但Ni-RC-L1被排除在PCA分析之外。L1和L2层中的根样本之间只有Zn显示出统计学上的显著相关性（r = +0.64，见补充材料图5）。对于在AN和SPW中检测到的生物可利用金属浓度，提取了四个主要组分，解释了88.47%的总方差。图10d显示了前两个主要组分，占总方差的63.60%。在叶片和根际离子组的PCA分析中，所有参数都对PC1轴有正向影响（41.10%）。其中，SPW中的Pb浓度未被纳入，因为它们的浓度低于量化阈值；同时，Pb-AN-L2也没有被考虑在分析中。有趣的是，在第一象限中，出现了一个参数簇，包括L1层中检测到的金属和L2层中检测到的土壤孔隙水中的Ni、Cu、Zn。总体而言，L1层中的AN组分之间没有相关性，而L2层中的AN组分之间显示出强烈的正相关性（见补充材料图6）。两个土层中相同金属的AN组分之间没有相关性，唯一的例外是Ni（r = +0.87），它在同一土层中的两种检测方法之间显示出正相关性。实际上，Ni参数对PC1轴的驱动作用最大。

关于植物生长和生物量发育，MB处理显著提高了根部的水分利用效率（WUE，见图4），从而显著增加了干物质密度（DRD，见图5a），证实了其在促进芒草生长方面的有效性。然而，这种改进并没有转化为处理间水分储存量（SFW）和干物质含量（SDW）的显著差异（见图3a和b）。Peroni等人（2024年）和Ofori-Agyemang等人（2024b年）的盆栽研究表明，菌根和腐殖质物质的联合应用比单独使用更能促进芒草的生长。Peroni等人（2024年）发现，当各组分单独应用时没有显著的生长差异，而它们的组合显著增加了中国污染土壤中Miscanthus lutarioriparius的SDW。相比之下，Ofori-Agyemang发现MB处理提高了Miscanthus giganteus的SDW，尽管与对照组没有统计学差异，这与我们的结果一致（见图3b）。除了物种和土壤差异外，种植方法也起着重要作用。微繁殖的苗木通常比根茎更有效地建立和再生，尽管根茎仍然是更经济且广泛使用的选项（Ouattara等人，2020年）。总体而言，这些结果可能反映了芒草在第一年的资源分配策略，即主要投资于根部和根茎的发育，而不是地上生物量，尤其是在可利用的土壤体积较大的情况下。这种地下投资预计会促进随后的地上生长，这一点得到了MB处理下初期根系改善的支持（O’Loughlin等人，2017年；Mann等人，2013年）。腐殖质物质和菌根可能同时促进了地下性能的提高（Feszterová等人，2024年；Wenzel，2009年）。本研究没有详细测量菌根定植情况，以便更好地再现田间条件。根茎来自种植园，因此在实验开始时，C和MB处理过的植物很可能已经具有AMF（amilostrophyces fungi）的定植，包括接种物中的菌根。这些三种AMF来源可能具有协同效应，但本研究没有对其进行调查。无论是MB处理过的植物还是对照植物的根系都应该是定植了菌根的，而且根系定植率没有显著差异（如之前在高粱上的田间研究Ofori-Agyemang等人，2024a年所示）。然而，在第一象限中，出现了一个参数簇，包括L1层中检测到的金属和L2层中检测到的土壤孔隙水成分（Ni、Cu、Zn）。总体而言，L1层中的AN组分之间没有相关性，而L2层中的AN组分显示出强烈的正相关性（见补充材料图6）。同一金属的AN组分在两个土层之间没有相关性，唯一的例外是Ni（r = +0.87），它在同一土层中的两种检测方法之间显示出正相关性（即L1层，r = +0.77）。实际上，Ni参数对PC1轴的驱动作用最大。

讨论
植物生长和生物量发育
MB处理显著提高了根部的水分利用效率（WUE，见图4），从而显著增加了干物质密度（DRD，见图5a），支持了其在促进芒草生长方面的有效性。然而，这种改进并没有转化为处理间水分储存量（SFW）和干物质含量（SDW）的显著差异（见图3a和b）。Peroni等人（2024年）和Ofori-Agyemang等人（2024b年）的盆栽研究表明，菌根和腐殖质物质的联合应用比单独使用更能促进芒草的生长。Peroni等人（2024年）发现，当每个组分单独应用时没有显著的生长差异，而它们的组合显著增加了中国污染土壤中Miscanthus lutarioriparius的SDW。相比之下，Ofori-Agyemang发现MB处理提高了Miscanthus giganteus的SDW，但与对照组没有统计学差异，这与我们的结果一致（见图3b）。除了物种和土壤差异外，种植方法也起着重要作用。微繁殖的苗木通常比根茎更有效地建立和再生，尽管根茎仍然是更经济且广泛使用的选项（Ouattara等人，2020年）。总体而言，这些结果可能反映了芒草在第一年的资源分配策略，即主要投资于根部和根茎的发育，而不是地上生物量，尤其是在可利用的土壤体积较大的情况下。这种地下投资预计会促进随后的地上生长，这得到了MB处理下初期根系改善的支持（O’Loughlin等人，2017年；Mann等人，2013年）。腐殖质物质和菌根可能共同促进了地下性能的提高（Feszterová等人，2024年；Wenzel，2009年）。尽管本研究没有进行菌根定植的详细测量，以便更好地再现田间条件，但根茎来源于种植园，因此在实验开始时，C和MB处理过的植物很可能已经具有AMF的定植。菌根真菌可能来源于移植的根茎、接种物和土壤。这三种AMF来源可能具有协同效应，但本研究没有对此进行调查。无论是MB处理过的植物还是对照植物的根系都应该都定植了菌根，而且根系定植率没有显著差异（如之前的高粱田间研究Ofori-Agyemang等人，2024a年所示）。因此，难以准确评估个别真菌物种的作用，无论是它们对芒草生长的直接影响还是它们与腐殖质物质的相互作用。同样，涉及腐殖质物质和菌根联合应用于其他生物量作物（如高粱和麻）的田间研究也未发现根系定植的显著差异，尽管观察到叶片金属吸收的显著改善（Ofori-Agyemang等人，2026年）以及更好的生理特性和水分利用效率（Jaros-Tsoj等人，2025年）。此外，正如Iqbal等人（2025年）在田间规模上所示，应用MB处理后，栖息在芒草根际的微生物群落组成可能会发生显著变化。然而，这些研究都没有阐明菌根和腐殖质物质相互作用提高植物表现的机制。腐殖质物质可能通过多种机制促进根系增殖，这反过来又可能增强根系与菌根的相互作用（García等人，2016年；Olaetxea等人，2018年）。尽管应用剂量受到限制，以确保与潜在的田间应用兼容，但它们对土壤尤其是其水分保持能力具有可测量的肥料效应（Olaetxea等人，2018年），这是本研究中考察的提高芒草根系的关键因素之一。MB处理下根系WUE和DRD的增加可能与腐殖质物质介导的物理触发机制有关。腐殖质沉积物在根细胞壁孔隙中的形成可能暂时提高了水力传导性，从而增强了水分吸收（见图4）。尽管本研究没有记录这一具体现象，但在Leonardite提取物应用后有类似现象的报告（García等人，2016年；Olaetxea等人，2018年），并在高粱田间试验中得到证实（Jaros-Tsoj等人，2025年）。腐殖质物质的有益作用源于其化学异质性，特别是亲水性富里酸和疏水性腐殖酸的交替存在，这改善了根-土壤-水的相互作用（García等人，2019年）。主根干重的增加（见图5a）与这一机制一致，可以与芳香族腐殖酸中常见的O-和N-烷基功能团相关联（García等人，2016年）。灌溉模式（见图2）进一步支持这一假设：在作物生长的早期阶段，移植后长达130天内，MB处理过的植物比对照植物需要的水分更少，之后趋于一致或略微超过对照植物。这一趋势表明根系水分利用效率的暂时提高，可能是由于MB处理下根系发育的增强。从生化角度来看，来自腐殖质领域的外源生长素可能通过激活膜H?-ATPase来改变根系结构，从而促进细胞分裂、硝酸盐同化和内源性激素的合成（Canellas和Olivares，2014年；Olaetxea等人，2018年）。然而，这些途径在芒草中的直接证据仍然有限，因此本研究没有包括这些内容。文献中更好地记录了腐殖质物质刺激根际微生物群落的能力（Koskey等人，2023年）。特别是腐殖酸已被证明可以支持菌根真菌的发展（Lodhi等人，2013年），而Leonardite-沸石底物的相互作用进一步促进了孢子的发育（Wolny-Ko?adka等人，2022年）。尽管本研究没有提供直接证据，但据报道，接种物中包含的Rhizophagus属真菌可以诱导芒草产生 cytokinin（Schmidt等人，2017年），并可能有助于MB处理过的植物中分蘖和叶数的增加（见图3c和d）。地上和地下植物生长的总体发展受到上下土层间水分梯度的强烈影响，这从图10a中的PC1聚类中可以看出。由于本研究使用了深度根系观测系统，这种模式得到了清晰体现。当表层水分受限时，深层根系的增殖是C4木质纤维素植物的一种公认的适应策略（Zegada-Lizarazu等人，2012年），例如在Arundo donax中，在相似的深层根系观测条件下，多达70%的总水分吸收来自水分含量较高的深层土壤（Zegada-Lizarazu和Monti，2019年）。芒草可能依赖于类似的机制，如图10a中的AM-L2和root WUE-L2所表明的，这与水分需求模式一致（见图2）。虽然所有植物都表现出这种适应性深根反应，但MB处理过的植物可能从上述物理触发效应中获得了更多好处。地上植物形态的改善支持了这些观察结果。MB处理过的植物在整个土壤剖面中的更好根系发育和水分利用效率促进了更茂密的生长习性，如分蘖和叶片数量的显著增加（见图3c和d）。特别是后者与底层土壤中的root WUE（见图10a；补充材料图3）显示出直接相关性。这些效应可能反映了通过增强深层根系增殖来增加蒸发表面积和稳定光合活动的适应性响应。因此，MB处理可能主要发挥了物理效应，可能增强了Miscanthus giganteus的异步水分行为和“保持绿色”表型（Krzy?ak等人，2023年）。Jaros-Tsoj等人（2025年）在另一种C4能源作物高粱上也得出了类似的结论。这种行为对于在边际和受污染土壤中建立芒草具有明显优势，特别是在低投入和灌溉条件有限的条件下。在田间条件下，根系发育和SDW产量的潜在增加将取决于特定地点的因素，包括土壤-气候条件和处理管理实践，特别是是否每年重复相同的处理。根据一项关于生物刺激剂效果的元分析，草类在适当优化的情况下可以提高10%到16%的产量（Li等人，2022年），这突显了这些改良措施在砂质土壤等条件下的农学潜力。

植物离子组和植物提取能力
MB对提高总根系金属吸收的积极影响已在Pb、Cu和Zn上得到证实（见图7b、c和d）。这一结果主要归因于MB处理过的植物较高的DRD，并且受根系浓度变化的影响较小。这些结果与García-Mina等人（2004年）、Hamzah和Priyadarshini（2022年）以及Ondrasek等人（2018年）的先前研究结果一致。C植物中的根系Ni和Zn浓度表现出相似且显著的垂直模式（见图6a和d），L1层中的浓度（分别为19 mg kg?1 DM和142 mg kg?1 DM）高于L2层（分别为11 mg kg?1 DM和115 mg kg?1 DM）。这种变化与根系生物量的差异无关（见图5）。在其他假设中，芒草根系可能在较干燥的土层中产生黏液和根系沉积物，以及根表皮组织上的铁 plaque形成，这两种机制都已知可以增强根际中的阳离子吸附（Alloway，2008年）。对于MB处理过的植物，在土层之间或与C植物相比，根系金属浓度没有显著差异（见图6a和d），这表明尽管根系生物量更大，但没有金属稀释效应。这种模式可能反映了菌根的稳定作用，先前的研究已经证明菌根有助于在根密度增加的情况下保持相对稳定的金属浓度（Chen等人2003年；Karaca等人2013年；Nsanganwimana等人2015年；Stanton等人2022年）。深层土壤（L2）中的根锌和镍浓度具有显著相关性（r = 0.83，图10，图5补充材料）。锌和镍的溶解度以及根部暴露量主要由土壤pH值控制，在一定程度上也受有机物含量影响（Broadley等人2007年；Zhou等人2005年）。土壤pH值对锌的有效性有很强的控制作用，因为它调节了吸附-解吸平衡，从而影响根部表面的锌暴露量（Hernandez-Soriano和Jimenez-Lopez 2012年；Kaur等人2024年）。这种效应在我们的高pH值、低粘土土壤中尤其明显（表2），其中主要存在的锌离子形式是Zn(OH)+（Alloway 2008年）。锌和pH值之间的显著交互作用可以解释为什么锌是唯一在L1和L2层之间浓度相关的金属（r = 0.64，图10 c，图5补充材料）。在任何处理组中都未发现铁缺乏现象。作为一种禾本科植物，芒草可能采用了II型铁吸收策略，涉及释放植物铁载体，这些铁载体能够将三价铁溶解，并通过YS1/YSL转运蛋白使其以三价铁-植物铁载体复合物的形式被吸收（Andresen等人2018年）。然而，芒草产生的具体植物铁载体类型和数量尚未被研究，并且在本研究中没有报告。其他转运蛋白（以及参与长距离金属运输的烟酰胺）可能有助于促进二价铁的吸收，并通过共质体途径促进二价镍和锌的运输，尽管大多数支持这一理论的依据来自双子叶植物（I型）。在拟南芥（A. thaliana）中，根部的镍与IRT1转运蛋白相关联，而液泡镍输出蛋白IREG2则抑制了镍从根部向茎部的运输（Nishida等人2020年）。尽管这些机制尚未被测量，但在C植物的L2层根中可能效果较差（图6），这与较低的镍浓度相符。烟酰胺在根细胞和木质部液中形成稳定的复合物，促进镍的转移。增强的YSL3转运蛋白与镍-烟酰胺复合物的移动性有关，有助于维管系统中镍的运输，尤其是在超积累植物Noccaea属中（Nishida等人2020年）。虽然没有直接证据支持芒草的情况，但在其他草类如多年生黑麦草（Lolium perenne）中，茎部镍浓度的升高与木质部通量的增加以及柠檬酸含量的增加有关（Andresen等人2018年）。锌和镍的吸收主要由ZIP家族转运蛋白介导，尤其是IRT3，这是一种广谱二价阳离子转运蛋白（Kobayashi等人2019年）。重金属ATP酶4（HMA4）也有助于锌在根组织中的木质部装载（Nishida等人2020年）。此外，ZIP蛋白参与锌和镍向茎部的运输，而HMA2转运蛋白则在锌从根部向茎部的运输中起更具体的作用（Rabêlo等人2021年）。除了锌和镍，大多数二价阳离子在茎部离子组中聚集在一起，表明这些微量元素的移动性介于更容易运输的大量元素（如钾和磷）和更难移动的元素（如钙）之间（图10 b；Page和Feller 2015年）。然而，铜并未归入这一组（图10 b）。相反，其在L2层的根浓度位于由L1和L2层其他根金属浓度定义的两个群组之间（图10 c）。这种模式可能反映了与锌和镍相比，不同的土壤和根部因素对铜吸收的影响，特别是在pH值高于5.5时pH值的次要作用，以及铜与土壤有机物的更强相互作用（Rabêlo等人2021年）。此外，一旦被吸收，铜在细胞外部分的运输能力通常比锌和镍有限（Page和Feller 2015年）。尽管本研究中没有报道这一证据，但铜的生物富集因子（BCFs）高于镍和铅，特别是锌，表明尽管铜在植物组织中的移动性受限，但其吸收效率更高。表土中的铅BCF可能反映了在更活跃的表层土壤中吸收增强，再加上深层土壤中NH4NO3可提取铅部分的减少（图9 b）。这种铅生物有效性的下降（L1和L2层分别比初始值减少了40%和60%）可能是导致对照组植物L2层根铅浓度较低的数值原因（图6 b）。尽管缺乏统计显著性，但这导致了铅在土壤层之间的分配发生了微妙的变化（图8 b）。铜和锌的TF值相当（表2，补充材料），但对于这两种在植物中广泛需求和活跃利用的微量元素来说，其TF值仍然很低（Andresen等人2018年；Broadley等人2007年）。总体而言，茎部金属浓度并不特别高（表4），这与排斥金属的草类的行为一致（Rabêlo等人2021年），正如Peroni等人（2024年）和Ofori-Agyemang等人（2024b）所详细描述的，MB处理并未导致茎部金属浓度的差异。这些金属浓度低于之前在田间条件下使用根生物刺激剂进行的芒草实验中所报告的浓度（Nsanganwimana等人2015年）。这种差异可能部分是由于温室环境中没有叶片金属暴露，而在田间试验中则存在这种暴露（Kumar和Prasad 2018年），以及特定的土壤特性和较低的初始金属生物有效性（表1和2）。这样的茎部金属浓度使得芒草生物质易于用于生物燃料生产，确保符合热能和生化转化途径的质量标准（Lanzerstorfer 2019年；Pidlisnyuk等人2014年）。本研究没有发现芒草种植第一年结束时金属的AN浓度有显著差异；然而，观察到与土壤层因素有关的显著变化。L2层土壤中铅和锌的AN部分减少可以归因于在较高土壤湿度条件下的增强吸附作用。对于铅来说，这一过程可能是由于在芒草根表面形成了铁斑块（Xin等人2022年），这些铁斑块为铅2+提供了活跃的吸附位点。这种机制还受到粗质土壤结构的促进，即使在高湿度下也能保持良好的通气和高的氧化还原电位（Wenzel 2009年）。L2层的根铅浓度似乎受益于这一过程，与根际沉积物（DRD）呈强烈正相关（r = 0.78，图7，补充材料）。这一发现支持了这样一个假设：在所测试的条件下，根系增殖在铅的植物稳定化中起着关键作用，通过物理吸附以及可能的根际介导的固定作用。因此，在本研究中，L2层的铅生物有效性比L1层降低了20%。与此同时，L2层锌的AN部分减少可能是由于沉淀过程，主要是以碳酸盐的形式，以及在较小程度上的氢氧化物或铁/锰氧化物涂层，这些在亚碱性pH值和较高土壤湿度条件下更易形成（Imtiaz等人2006年；Pan等人2016年）。MB处理降低了SPW中的铜浓度，表明在我们的根际培养系统中铜的植物稳定化潜力增强（表5）。这一效应可以归因于铜对腐殖质有机物的强亲和力，特别是芳香族链中的O-烷基功能团（García等人2019年；Hernandez-Soriano和Jimenez-Lopez 2012年），这促进了有机质与矿物的结合以及铜的局部吸附（Clemente和Bernal 2006年；Feszterová等人2024年；Nikishina等人2022年）。相比之下，钴表现出相反的趋势，L2层的SPW浓度高于L1层（表5）。这可能是由于其在较高土壤湿度下与无定形铁相的络合，形成了更多可溶性的钴-铁复合物（Lange等人2017年）。与铜类似，钴也对有机物有很强的亲和力，这可以解释为什么这两种金属与锌和镍不同，在土壤层之间出现了SPW浓度的变化。Ofori-Agyemang等人（2024b）没有评估SPW中的铜或钴，但他们表明所测试的生物刺激剂影响了SPW中的金属浓度。值得注意的是，胶体形式在SPW分析中被大量排除（Pan等人2016年），并且在钙质和碱性土壤中通常不稳定（表2和5）。然而，AN部分可能仍含有少量的胶体、金属-有机复合物和金属-胺物质（Gryschko等人2005年）。这可能在NH4NO3提取过程中部分掩盖了MB处理对铜生物有效性的影响，特别是如果铜与芳香族腐殖结构中的胺基团螯合（García-Mina等人2004年）。应该使用连续金属提取技术（Bakircioglu等人2011年；Peijnenburg等人2007年）对这些过程进行更详细的评估，但这超出了本研究的范围。然而，进一步评估MB在田间条件下对芒草中铜生物有效性的影响是很重要的，特别是在多次应用之后。目前的证据表明，使用强螯合剂（如DTPA）三年后没有显著效果（Peroni等人2025年），而使用弱盐提取剂（主要是CaCl2）的田间研究，包括在汉麻和高粱上的试验，并未涉及铜生物有效性（Iqbal等人2025年；Jaros-Tsoj等人2025年；Ofori-Agyemang等人2024b，2026年）。图10 d第一象限中Zn、Cu和Ni的AN部分与它们在L2层相应的SPW浓度之间的聚类表明，自由离子可能是从上层向下释放的，这可能是由水淋溶引起的。这些发现强调，AN和SPW部分代表了不同的潜在植物可用金属池，它们可以根据土壤湿度、物理特性和具体的金属类型相互作用（Hernandez-Soriano和Jimenez-Lopez 2012年）。在本研究中，镍不仅与其在L1层的AN部分和SPW浓度有强相关性，而且与L1层和L2层的AN部分也有强相关性（图10 d），其浓度相对于表1中报告的初始浓度分别降低了62%和68%。这种模式表明镍被牢固地吸附在土壤成分上，其SPW浓度较低（表5）。其逐渐的溶解和移动可能影响了其他金属的行为，这从Cu和锌的AN部分在两个土壤层之间的显著相关性以及它们在L2层中的SPW浓度与镍的SPW浓度的相关性中得到了证明，镍在图10d中占主导地位。结论MB处理结合了从 Leonardite提取的腐殖物质和丛枝菌根真菌，主要提高了根部的水分吸收效率，从而在芒草×giganteus的建立阶段促进了根系的增殖。尽管生物刺激剂的应用没有增加茎部干生物量产量，但它改善了几项生物测量指标。更大的根系增殖是根部金属吸收增加的主要驱动力，因为根部金属浓度的变化仅限于锌和镍，并且由于MB的作用而大幅增加。茎部金属浓度保持较低，符合排斥金属的物种特征，未受MB处理的影响。相反，MB处理降低了土壤孔隙水中的铜浓度，而深层土壤较高的土壤湿度与NH4NO3可提取锌和铅的生物有效性降低有关。这表明，在使用深根茎秆作物的植物管理系统中，即使在表土以下也能发生显著的金属生物有效性动态变化。在深层土壤中，较高的干根密度直接与根部铅浓度的增加相关。L1层NH4NO3可提取锌、铜和镍浓度与其在L2层相应的SPW浓度之间的相关性模式出现。然而，仅在前层土壤中检测到这两种分析方法之间的相关性，这表明这两种方法量化了不同的易变金属池。研究的土壤对于这两种方法都显示了较低的生物有效金属浓度，特别是对于SPW来说，尽管SPW分析对与有机物亲和力更强的金属更为敏感，从而反映了MB处理的效果。总体而言，在这种非法垃圾填埋场的土壤中种植芒草适合作为植物管理用途，有效结合了金属的植物稳定化和可加工生物质的生产。结合腐殖物质和丛枝菌根真菌促进了芒草在受污染土壤中的第一年建立，并增强了金属的植物稳定潜力。然而，需要多年的田间研究来评估这些发现的长期稳定性。