与柑橘果实中果汁囊的形成和启动相关的转录组学和代谢组学变化

《Planta》：Transcriptomic and metabolomic changes associated with the induction and initiation of juice sacs in citrus fruit

　　摘要
主要结论
转录组学和代谢组学比较揭示了柑橘果实中汁胞形成背后的潜在调控和代谢差异。

柑橘果实的可食用部分由汁胞组成——这些结构在水果中是独特的——它们在花序开放后不久从内果皮中发育而来，内果皮源自白皮层的最内层。尽管其生理和生化特性已被充分研究，但控制汁胞形成的调控机制仍知之甚少。在这项研究中，我们比较了两种柠檬（Citrus medica L.）品种——正常形成汁胞的卡拉布里亚柠檬和不会形成汁胞的也门柠檬——在四个发育阶段的情况：闭合的花朵、开花时的花朵以及开花后一周和两周的果实幼体。我们对内果皮细胞进行了比较转录组分析，随后进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA），并对整个子房和果实幼体进行了代谢组分析。正如预期的那样，卡拉布里亚柠檬的内果皮在细胞壁形成、DNA复制和细胞增殖相关基因的表达上更高，尤其是在开花后两周。相比之下，也门柠檬的内果皮中与应激相关的基因更为丰富。卡拉布里亚柠檬的子房和果实幼体显示出氨基酸含量的增加，而也门柠檬的子房和果实幼体则显示出TCA循环和能量代谢途径的激活。整合转录组学和代谢组学数据发现，也门柠檬中的碳水化合物和能量代谢途径显著富集。此外，我们识别出一个可能参与汁胞形成的转录因子调控网络。这些发现为理解汁胞形成的分子机制提供了新的见解，并为未来旨在阐明其调控机制的研究奠定了基础。

引言
柑橘在140多个国家种植，其用于鲜食市场和果汁行业的产量在过去几十年里持续增长（Spreen等人，2020年）。在芸香科植物中，柑橘属于橘亚科（Aurantioideae），以其独特的真浆果——柑橘类果实而闻名（Esau 1965；Fahn 1990）。柑橘类果实由三层组成：外果皮形成外层的有色表皮；中果皮形成内层的海绵状果皮；内果皮包含与子房相邻的两到三层内层细胞（Schneider 1968）。受精和结实后，汁胞原基通过内果皮细胞的抗性分裂以及相邻上皮细胞的周向分裂开始发育（Nii和Coombe，1988a；Burns等人，1994；Tisserat等人，1990）。汁胞继续膨胀并填充子房，从而定义了果实的部分结构。每个汁胞通过一个柄与子房壁相连。覆盖子房壁的上皮层形成了围绕汁胞的连续层（Tadeo等人，2020）。大多数汁胞从子房的背壁发育而来，只有少数从侧壁发育。每个子房包含两个侧脉束和一个背脉束，在大多数情况下，汁胞在脉束附近形成（Koch和Avigne 1990）。普遍认为脉束并不直接与汁胞相连，光合产物主要通过扩散运输（Sadka等人，2019）。如果有种子存在，它们会在子房的内部交界处形成。

鉴于柑橘的经济重要性，其初级和次级代谢已被很好地描述。此外，许多研究描述了不同果实发育阶段各种品种汁胞的转录组、蛋白质组和代谢组（Katz等人，2007，2010，2011；Gmitter等人，2012；Yu等人，2012；Ibá?ez等人，2014；Ding等人，2015；Lin等人，2015；Perotti等人，2015；Zheng等人，2016）。这些研究的整合使得人们对影响果实口感、风味和颜色的代谢途径以及发育过程和对生物和非生物信号的响应有了相对较好的理解（Tadeo等人，2008）。然而，据我们所知，控制内果皮组织中汁胞形成的机制仍研究不足。与其他浆果类型的水果相比，关于柑橘内果皮的独特性质如何促进汁胞的形成和发展的问题仍然存在。柠檬（Citrus medica L.）是最早被栽培的柑橘品种之一，与柚子（C. grandis）和柑橘（C. reticulata）一起被认为是其他品种如柠檬和酸橙（Karp和Hu 2018）的祖先。在柠檬品种中，有两种——“Buddha Fingers”和“Yemenite”——缺乏汁胞的形成。然而，“Buddha Fingers”没有子房，有时可以在其“手指”之间检测到汁胞。这表明这种品种具有形成汁胞的潜力，但由于缺乏子房而阻碍了其发育。相比之下，也门柠檬保持正常的果实形态，包括外果皮、中果皮、内果皮和含种子的子房（Karp和Hu 2018）。因此，可以得出结论，这种品种中汁胞的缺失可能是由于内果皮细胞的发育异常。

通过比较也门柠檬（Citrus medica var. Etrog）和含有汁胞的卡拉布里亚柠檬（Citrus medica var. vulgaris），我们旨在研究和理解汁胞形成的调控机制。最近的研究表明，在卡拉布里亚柠檬中，可以在开花后一周在子房的背壁检测到汁胞原基，并在开花后两周变得明显可见（Assili等人，2024）。相比之下，也门柠檬没有产生任何汁胞。对也门柠檬和卡拉布里亚柠檬的闭合花朵、开花时的花朵以及开花后一周和两周的果实幼体的整个子房进行比较激素分析发现，最丰富的激素——脱落酸（ABA）、赤霉素A4、吲哚-3-乙酸、异戊烯基腺嘌呤、茉莉酸和Zeatin核苷——在也门柠檬中的水平高于卡拉布里亚柠檬。此外，内果皮细胞的转录组分析显示，ABA代谢及相关基因的表达变化与子房和果实幼体中的激素水平变化一致。这表明内果皮细胞中的ABA水平遵循与子房和果实幼体相似的模式。虽然这仅提供了相关性数据，但它可能表明ABA在也门柠檬中负调控了汁胞原基的形成（Assili等人，2024）。鉴于这些结果，我们认为进一步比较也门柠檬和卡拉布里亚柠檬的内果皮及其他子房和果实幼体组织有助于识别与汁胞形成相关的调控过程。

材料与方法
植物材料
我们从含有汁胞的卡拉布里亚柠檬（Citrus medica var. Vulgaris）和不含汁胞的也门柠檬（Citrus medica var. Etrog）的成年果园中收集了子房和果实幼体的样本。这些样本来自以色列中部沿海地区的商业果园。根据每排树木在行内的位置随机选择了三棵树。从每棵树的东南侧收集了大小相似的花朵和果实幼体（n=25），每棵树被视为一个生物学重复样本。

转录组分析
从闭合的花朵（CF）、开花时的花朵（A）以及开花后1周（A1W）和2周（A2W）的果实幼体中收集了距离子房最近的两到三层内层细胞的样本，用于RNA提取，采用激光捕获显微切割（LCM，Zeiss PALM MicroBeam激光显微切割系统）技术（Martin等人，2016；Assili等人，2024）。在线资源1展示了卡拉布里亚柠檬的横截面和LCM采样情况。每个样本收集了四到五个子房/果实幼体，每个样本包含约1000-4000个内果皮细胞，放入收集管的粘性盖中（Adhesive Cap 200 opaque，Zeiss，编号415190-9181-000）。根据制造商的说明使用RNeasy Micro Kit进行RNA提取（Qiagen，Hilden，德国）。样本在以色列雷霍沃特的Nancy和Stephen Grand以色列国家个性化医学中心的Illumina平台上进行测序，使用INCPM-mRNA-seq方法。简而言之，从500纳克的总RNA中纯化了poly A片段（mRNA），然后进行碎片化和双链cDNA的生成。随后进行End修复、A碱基添加、接头连接和PCR扩增步骤，使用Agencourt Ampure XP珠子进行清理（Beckman Coulter）。使用Qubit（Thermo Fisher Scientific）和TapeStation（Agilent）对文库进行定量。测序使用NovaSeq 6000 SP 100循环试剂盒进行，每个样本分配20M个读段（Illumina；单读段测序）。由于技术上难以获得足够的细胞进行RNA提取，因此使用了两个重复样本进行分析。

原始读段经历了过滤和清洗处理。使用trimmomatic工具（Bolger等人，2014）从读段中去除Illumina接头，并使用FASTX Toolkit（http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html，版本0.0.13.2）修剪质量得分<30的读段末端核苷酸，并使用FASTQ Quality Filter去除质量得分≤30的读段，其中碱基对比例小于70%。使用STAR软件（Dobin等人，2013）将干净读段映射到橙子（Citrus sinensis v2.0_HZAU）的参考基因组上，平均映射率为93.7%。使用Cufflinks（Trapnell等人，2010）结合plantgarden数据库（https://plantgarden.jp/en/list/t2711/genome/t2711.G001）和Citrus Pan-Genome to breeding数据库（https://citrus.hzau.edu.cn）的基因注释估计基因丰度。基因表达值以每百万映射片段中的外显子片段数（FPKM）计算。使用DESeq2 R包（Love等人，2014）完成差异表达分析。p值校正后小于0.05的基因被认为是差异表达的。

基因序列被用作在NCBI非冗余（nr）蛋白质数据库中搜索的查询词，使用DIAMOND程序（Buchfink等人，2014）进行搜索。搜索结果导入Blast2GO版本4.0（Conesa等人，2005）进行基因本体（GO）分配。使用基于Fisher精确检验的Blast2GO程序进行基因本体富集分析，并进行了多重检验校正以控制假发现率（FDR）。使用KOBAS 3.0工具（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/?t=1）检测差异表达基因在KEGG通路和基因本体（GO）中的统计富集。使用Expander 7软件（Ulitsky等人，2010）和K-means算法（Shamir等人，2005）对差异表达基因进行聚类分析。聚类数量设置为5。根据Feng等人（2021）的方法，使用拟南芥蛋白序列进行BLAST搜索以识别基因家族。

使用Bioinformatics & Evolutionary Genomics（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）生成维恩图，并通过AgriGOv2（http://systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/）启动GO注释分析，包括REVIGO（Supek等人，2011）。KEGG分析通过MetaboAnalyst 5.0（https://www.metaboanalyst.ca/home.xhtml）进行。REVIGO和KEGG分析的图形使用R包ggplot构建。此外，基因共表达网络是使用R包WGCNA（v 1.63）（Langfelder和Horvath 2008）构建的。共有2057个差异表达基因（DEGs），其平均FPKM值来自测试样本，这些基因被用于通过加权相关网络分析（WGCNA）来构建共表达网络。转录组数据被存入NCBI BioSample和BioProject，其访问编号如下（Biosample中的第一个数字和Bioproject中的第二个数字）：C_A（SAMN56320921，PRJNA1431751），C_A1W（SAMN56320922，PRJNA1431751），C_A2W（SAMN56320923，PRJNA1431751），C_CF（SAMN56320924，PRJNA1431751），Y_A（SAMN56320925，PRJNA1431751），Y_A1W（SAMN56320926，PRJNA1431751），Y_A2W（SAMN56320927，PRJNA1431751），Y_CF（SAMN56320928，PRJNA1431751）。

定量实时PCR
根据制造商的说明，使用StepOnePlus系统（Applied Biosystems）对含有CF、A、A1W和A2W的卵巢和果实小果以及年轻、完全展开的叶片中的选定基因的表达进行了量化。本研究中使用的引物列在在线资源2中，包括作为参考基因的柑橘属β-actin（Cs1g05000）。

常规PCR
由于其中一个鉴定出的转录因子TF4（Cs1g08000）无法通过定量实时PCR检测到，因此使用2×PCRBIO Taq Mix Red（PCR Biosystems Inc.，美国东哈特福德）和特定引物（在线资源2）进行了常规PCR，按照制造商的说明进行操作。PCR反应包括在95°C下初步变性3分钟，然后在95°C下变性50秒，接着在58°C下退火30秒，在72°C下延伸60秒，最后在72°C下延伸10分钟。产物在含有pUC19 DNA/MspI（HpaII）标记物的1.7% TAE琼脂糖凝胶上进行分离（Thermo Fisher Scientific，英国沃灵顿）。

代谢组学分析
代谢组学分析是在卵巢壁/果实果肉和内果皮上进行的，排除了外果皮、连接子房部分的中心组织和胚珠/种子。新鲜的植物材料（CF、A、A1W和A2W）各复制三次，冻干后，每种24个样品（约含有30毫克干重），在美国加州大学戴维斯分校的West Coast Metabolomics Center使用ALEX-CIS GCTOF MS进行非靶向初级代谢组学分析（https://metabolomics.ucdavis.edu/core-services）。

统计分析
用于分析代谢物的统计测试包括主成分分析（PCA）、层次聚类（Consolation plot）和双因素方差分析（Two-way ANOVA），这些分析是使用MetaboAnalyst-5.0和JMP 14完成的。

联合路径分析
为了整合转录组和代谢组数据集，我们采用了MetaboAnalyst的联合路径分析模块，以获得代谢和转录变化的全面视图，从而能够识别在转录和代谢水平上共调节的生物学相关路径。该模块允许在KEGG代谢路径的背景下同时分析基因表达和代谢物丰度数据。从转录组数据中选出的显著改变基因（调整后的p值<0.05）和差异富集的代谢物被上传。分析使用了超几何测试进行路径富集，并使用度中心性方法进行拓扑路径影响分析，这两者都是该工具的默认设置。由于KEGG目前没有为Citrus medica或其他柑橘物种提供特定物种的数据库，我们选择了拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为路径映射的参考生物。这使得可以基于跨植物物种保守的代谢和调控过程推断出路径关联。

结果
果汁囊（JSs）的来源组织是内果皮，定义为果皮的2到3层内部细胞，这在柑橘果实中对应于白内皮（在线资源1）。之前，我们对Calabria品种的果实小果样本在花闭合期（CF）、开花期（A）、开花后1周的果实小果（A1W）和开花后2周的果实小果（A2W）进行了发育分析，结果显示JS原基在A1W时期的子房背壁出现，并在A2W时期变得清晰可见（Assili等人，2024年）。相比之下，对Yemenite品种的类似分析确认了这种柑橘品种中没有JS的形成。

Calabria和Yemenite内果皮细胞的比较转录组分析
在Calabria和Yemenite柑橘的四个发育阶段（CF、A、A1W和A2W）中，使用激光捕获微切割（LCM）技术切除了最内侧的2到3层细胞，这些细胞层相邻于子房并定义为内果皮（Assili等人，2024年）。从这些样本中提取的RNA被扩增并进行了深度测序。共有29,656个基因被成功映射（在线资源3）。除了A阶段的Calabria样本外，同一组织的重复样本聚在一起（在线资源4）。Yemenite柑橘的CF和A阶段的样本聚在一起，而Calabria柑橘的相应阶段则没有。A1W阶段的样本来自两个品种都聚在一起，而A2W阶段的样本彼此相对较远。在分别比较两个品种在每个阶段的表达时，我们确定了2,339个差异表达基因（DEGs），其变化程度至少为两倍（2FC），调整后的p值≤0.05。在这些DEGs中，有219个在多个发育阶段呈现出显著差异（在线资源5和图1）。与A2W阶段果汁囊原基数量增加有关（Assili等人，2024年），大多数DEGs（Calabria有1,577个，Yemenite有780个）出现在A2W阶段，其中大多数是独特的：Calabria有705个，Yemenite有694个。CF、A和A1W阶段分别有422个（Calabria有159个，Yemenite有263个）、243个（Calabria有67个，Yemenite有176个）和97个（Calabria有33个，Yemenite有64个）DEGs，许多是每个阶段独有的（图1）。

图1
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UpSet图展示了差异表达基因（DEGs）。上层图表显示了Calabria和Yemenite柑橘在CF、A1W、A2W和A3W阶段的DEGs总数。下层图表显示了每个品种和阶段之间重叠的DEGs数量。

MapMan分析揭示了以下模式：（1）光合作用和主要及次要碳水化合物代谢过程在Yemenite柑橘中富集；（2）细胞壁相关过程在Yemenite柑橘的CF和A阶段富集，但在Calabria柑橘的A2W阶段明显富集；（3）应激和氧化还原相关过程在Yemenite柑橘中富集；（4）DNA相关、信号传递和细胞周期相关过程在Calabria柑橘中富集，特别是在A2W阶段；（5）运输过程在Yemenite柑橘中富集，尤其是在CF、A和A1W阶段（图2和在线资源6-9）。

图2
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MapMan分析显示了Calabria和Yemenite柑橘在四个发育阶段（CF、A、A1W和A2W）之间的差异过程。蓝色代表上调的转录本（Calabria），红色代表下调的转录本（Yemenite）。

映射到碳水化合物代谢的DEGs包括20个基因，如上所述，这些基因在Yemenite柑橘中被诱导（在线资源9）。这些基因包括两个参与应激诱导的淀粉代谢的BETA-AMYLASE样基因（Cs9g04980，orange1.1t03470）（Kaplan和Guy 2004；Fan等人，2024；Berndsen等人，2024）；五个与应激反应相关的raffinose家族基因（Cs3g15460，Cs5g05900，Cs4g05490，Cs9g12460，Cs4g07840）（Yan等人，2022；Sanyal等人，2023）；以及两个与海藻糖生物合成相关的基因（Cs4g02730，Cs2g17640），这些基因调节细胞生长（Morales-Herrera等人，2023；Griffiths等人，2025）。

在细胞壁形成和修饰过程中，检测到了41个基因，其中大多数在Calabria柑橘中的表达量高于Yemenite柑橘（在线资源9）。这些基因包括三个EXPANSIN基因（Cs7g03630，Cs8g18640，Cs6g15990）和一个参与细胞壁松弛的COBRA样基因（Cs5g12210）（Cosgrove 2000，2024；Samalova等人，2022）；三个与纤维素合成相关的基因（Cs7g07050，Cs7g05150，Cs4g08560）；以及九个编码果胶裂解酶和聚半乳醛酸酶的基因（Cs8g11330，Cs7g21940，orange1.1t02511，Cs7g08820，Cs9g03730，Cs9g01630，Cs5g03170，Cs7g08600，Cs1g12730），这些基因负责细胞壁降解（Lu等人，2025；Anderson和Pelloux 2025）。

在DNA和细胞周期相关过程中，检测到了123个基因，其中许多在Calabria柑橘中的表达量高于Yemenite柑橘（在线资源9）。这些基因与DNA复制和修复、染色质相位分离、细胞周期调控和胞质分裂有关。

在应激响应过程中，检测到了53个基因，其中大多数在Yemenite柑橘中的表达量高于Calabria柑橘（在线资源9）。在这些基因中，我们识别出九个与热休克相关的基因和三个与干旱胁迫相关的基因。

转录因子（TFs）表达的变化
假设Yemenite柑橘与Calabria柑橘相比有一个或多个调控途径发生了改变，接下来我们分析了差异表达的转录因子（TFs）。转录组分析确定了122个差异表达的TFs，平均占所有DEGs的约6%（在线资源8）。这些TFs大多属于以下基因家族：亮氨酸拉链基序（ZIP）、乙烯响应因子（ERF）、同源域亮氨酸拉链（HD-ZIP）、MADS-box（MADS）、NAC域转录因子（NAC）、WUSCHEL相关同源框（WOX）、WRKY域转录因子（WRKY）和MYB域转录因子（MYB）。大多数检测到的TFs（共108个）在品种和阶段上具有特异性表达，其中大部分在A2W阶段表达（图3）。只有五个TFs在三个或四个发育阶段都有表达，分别属于ZIP、ERF、HD-ZIP和NAC家族。值得注意的是，这四个TFs的表达趋势与其他家族成员相反；虽然大多数家族成员在Yemenite中表达较高，但这四个TFs在Calabria中的表达量高于Yemenite（图4）。将这些TFs注释为拟南芥后发现它们可能在组织形成中起调节作用（详见下文）。这些包括bZIP基因PERIANTHIA（PAN）（Cs7g13010，TF1）、ERF基因BOLITA/DRN/ESR2（Cs7g09370，TF2）、HD-ZIP基因LATE MERISTEM IDENTITY1（LMI1）（Cs6g15700，TF3）和NAC基因CUP-SHAPED COTYLEDON 2（CUC2）（Cs1g08000，TF4）。

图3
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UpSet图展示了Calabria和Yemenite柑橘在CF、A1W、A2W和A3W阶段的差异表达转录因子（TFs）总数。下层图表显示了每个品种和阶段之间重叠的TFs数量。

图4
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对四个发育阶段（CF、A、A1W和A2W）中不同发育阶段的差异表达转录因子基因的Log2倍数比值（Calabria/Yemenite）进行了展示。显示了以下家族：基本亮氨酸拉链（bZIP）蛋白、乙烯响应因子（ERF）蛋白、同源域亮氨酸拉链（HD-ZIP）蛋白、MADS-box转录因子（MADS）、NAC转录因子（NAC）、WRKY转录因子（WRKY）、WUSCHEL相关同源框（WOX）和MYB转录因子（MYB）。

在这四个TFs的FPKM值在Yemenite柑橘的所有分析发育阶段的内果皮细胞中都非常低，与Calabria柑橘相比（图5）。TF1在Calabria柑橘的CF和A阶段的內果皮细胞中显示出相对较高的FPKM值，而在后期阶段降低（图5a）。其转录本在Calabria的叶片和整个卵巢中可检测到，但在Yemenite的器官中检测不到（图5b）。

图5
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展示了Calabria和Yemenite柑橘在不同发育阶段（CF、A、A1W和A2W）的TF1、TF2、TF3和TF4的表达分析。FPKM值表示为：（a）TF1（Cs7g13010，PAN-LIKE）、（b）TF2（Cs7g09370，BOLITA-like/DRNL-like）、（c）TF3（Cs6g15700，LMI1-like）和（d）TF4（Cs1g08000，CUC2-like）在Calabria和Yemenite内果皮中的情况。相对表达情况表示为：（b）TF1、（d）TF2和（f）TF3在Calabria柑橘叶片（C-L）、Yemenite柑橘叶片（Y-L）、Calabria柑橘卵巢（C-O）、Yemenite柑橘卵巢（Y-O）和柑橘（Citrus reticulata）叶片（Mn）上的表达情况。小写字母和*表示使用单因素方差分析（one-way ANOVA）分析后相应的发育阶段之间存在统计学上的显著差异（P<0.05）。TF4引物的PCR产物在C-L、Y-L、C-O、Y-O和去氘水（DDW）上的琼脂糖凝胶电泳（2%）。

在Calabria柑橘中，TF2和TF3在CF、A和A1W阶段的內果皮细胞中表达相对恒定，在A2W阶段增加了2.5到3倍（图5c，e）。这两个TF在Calabria的叶片中无法检测到，而在Yemenite的叶片中TF2的表达量较低。这两个TF在两种品种的整个卵巢/果实小果中都有表达（图5d，f）；然而，TF2在两种品种中的表达水平相似，而TF3在Yemenite柑橘中的表达量大约是Calabria的三分之一。

在Calabria柑橘中，TF4在CF、A和A1W阶段的內果皮细胞中的表达量保持恒定，在A2W阶段减少了约两倍（图5g）。该基因在两种品种的叶片或整个子房中都无法通过定量逆转录聚酶链反应（qPCR）检测到。然而，使用高循环次数的传统PCR方法在两种品种的子房/小果实中检测到了其转录本（图5h）。除了这四种转录因子（TFs）外，我们还鉴定出另一种类似MYC的bHLH转录因子MYC67（orange1.1t0057），它在Calabria柑橘的四个分析阶段中的三个阶段被诱导表达（在线资源10）。

**差异表达基因（DEGs）的加权基因共表达网络分析（WGCNA）**
WGCNA用于将高度相关的基因聚类成网络（模块），并识别可能作为相关过程驱动因素的关键调控基因。共有2,057个DEGs被聚类到23个模块中，这些模块具有不同的层级关系（在线资源11和12）。这些模块被分为四组（图6）。第1组（G1）包括六个模块——蓝色、青绿色、皇室蓝、棕褐色、浅绿色和紫色——包含在Yemenite柑橘中诱导表达的DEGs，尤其是在A2W阶段。第2组（G2）包括三个模块——鲑鱼色、深青绿色和绿色——包含在Calabria和Yemenite柑橘中诱导表达的DEGs，主要在A1W阶段。第3组（G3）包括三个模块——深红色、黑色和浅青色——包含在Yemenite柑橘的CF阶段诱导表达的DEGs。最大的组是第4组（G4），包括十个模块——深绿色、黄绿色、浅黄色、棕色、红色、青色、粉红色、灰色60、午夜蓝和黄色——包含在Calabria柑橘的各个阶段诱导表达的DEGs。

**图6**
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**图像全尺寸**
热图展示了通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）确定的两种柑橘品种——Calabria和Yemenite——在四个发育阶段（CF、A、A1W和A2W）之间的基因-表型关系。每一行对应一个模块，每一列对应不同的品种-阶段组合。每个单元格中的顶部和底部数字分别表示模块与该组合之间的相关系数和测试的p值。模块被分为四组：G1、G2、G3和G4。

在G1组中，蓝色和青绿色模块包含的基因数量最多，分别为235个和339个DEGs。在G4组中，棕色和黄色模块分别包含176个和151个DEGs（在线资源11）。其他模块包含的DEGs少于100个。

**基因本体（GO）分析**
对每个组进行的GO分析显示了不同的富集模式（图7）。G1组包含在Yemenite柑橘中诱导表达的模块，富集在与化学反应、分子功能调节以及酒精、胺类和萜类物质代谢相关的过程。G2组包含在两个品种的A1W阶段诱导表达的模块，富集在与化学反应、发育过程和解剖结构发展相关的过程。G3组包含在Yemenite柑橘的CF阶段诱导表达的模块，富集与非生物刺激的反应和发育过程，尤其是胚胎后期发育相关的过程。G4组包含在Calabria柑橘中诱导表达的模块，富集与DNA复制、染色质组织、细胞周期、细胞器组织、多细胞组织以及小分子和hexose代谢过程相关的过程。

**图7**
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**图像全尺寸**
根据WGCNA分析结果，使用REVIGO对第1-4组的基因进行的GO富集分析可视化（图5）。每个矩形代表一个簇。簇被合并成由松散关联术语组成的“超级簇”，并用不同颜色进行可视化。矩形的大小根据GO术语的p值进行调整。

**果汁囊原基**
果汁囊原基是通过内果皮细胞的抗clinal和periclinal分裂产生的。对G4组的GO分析显示，与DNA复制和细胞周期相关的过程得到富集。为了识别可能在每个模块中起关键调控作用的高度互联的枢纽基因，我们使用了WGCNA和Cytoscape（Shannon等人，2003）构建了基因共表达网络（在线资源13）。

值得注意的是，G3组的浅青色模块和G4组的灰色60及红色模块含有最高比例的转录因子（TFs），分别为12%、14%和12%，而所有DEGs中的平均TF丰度为6%（在线资源11）。如上所述，G4组包含了在所有分析阶段都在Calabria柑橘中诱导表达的模块。它包含890个基因，其中51个TF分布在10个模块中（在线资源11）。在这51个TF中，有20个与其各自模块中的至少50%的基因有直接关联（表1）。之前鉴定出的三个TFs——TF1、TF2和TF3——包含在这21个TF中。TF1被归类在灰色60模块中，与其模块中的55%的DEGs有连接。TF2和TF3分别被归类在红色模块中，与其模块中的66%和57%的DEGs有连接。TF4属于灰色模块（表S10），与其模块中的49%的基因有连接。

**表1**
在WGCNA模块网络中检测到的具有最多边的转录因子（TFs）

**表1**
在这20个TF中，有20个在至少一个发育阶段在Calabria中比在Yemenite中更活跃（表1）。大多数这些TF与可能与组织形成和生长以及细胞分化相关的过程有关。例如，Cs2g25740是拟南芥基因AT1G66350的同源物，编码DLLA亚家族的GRAS蛋白RGA-LIKE1（RGL1），参与细胞分化（Wen和Chang 2002）。几个TF与分生组织调节有关，包括Cs2g09770，它是AT2G34710的同源物（一种HD-ZIP基因，编码PHABULOSA，PHB）（Williams等人，2005；Müller等人，2015）；orange1.1t00208，它是AT2G45190的同源物（一种YABBY家族基因，编码FILAMENTOUS FLOWER，FIL，参与叶片和果实的背轴细胞类型指定）（Lugassi等人，2010；Bonaccorso等人，2012）；以及orange1.1t00339，它是AT3G61250的同源物（一种MYB家族基因，编码LATE MERISTEM IDENTITY2，LMI2）（Pastore等人，2011）。其他TF与花发育有关，例如Cs1g08850，它是AT5G58280的同源物（一种AP2/B3类TF，编码DNA结合蛋白）（Zhou等人，2021；Jiang等人，2022），以及Cs8g05770和Cs8g05780，它们是AT3G19184的同源物（AP2/B3类TF，编码REPRODUCTIVE MERISTEM1，REM1）（Luna-García等人，2024）。此外，Cs2g16790是AT3G18010的同源物（一种WUSCHEL相关同源框基因，编码WOX1），与胚胎模式形成有关（Haecker等人，2004）。

**图8**
该图像的替代文本可能是通过人工智能生成的。

**图像全尺寸**
通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）显示的两种柑橘品种Calabria和Yemenite在四个发育阶段（CF、A、A1W和A2W）之间的基因-表型关系热图。每一行对应一个模块，每一列对应不同的品种-阶段组合。每个单元格中的顶部和底部数字分别表示模块与组合之间的相关系数和测试的p值。模块被分为四组：G1、G2、G3和G4。

在G1组中，蓝色和青绿色模块包含的基因数量最多，分别为235个和339个DEGs。在G4组中，棕色和黄色模块分别包含176个和151个DEGs（在线资源11）。其他模块包含的DEGs少于100个。

**图7**
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**图像全尺寸**
根据WGCNA分析结果，使用REVIGO对第1-4组的基因进行GO富集分析的可视化（图5）。每个矩形代表一个单独的簇。簇被合并成由松散相关术语组成的“超级簇”，用不同颜色进行可视化。矩形的大小根据GO术语的p值进行调整。

**果汁囊原基的生成**
果汁囊原基是通过内果皮细胞的anticlinal和periclinal分裂产生的。对G4组的GO分析显示，与DNA复制和细胞周期相关的过程得到富集。为了识别可能在每个模块中起关键调控作用的高度互联的枢纽基因，我们使用WGCNA和Cytoscape（Shannon等人，2003）构建了基因共表达网络（在线资源13）。

值得注意的是，G3组的浅青色模块和G4组的灰色60及红色模块含有最高比例的转录因子（TFs），分别为12%、14%和12%，而所有DEGs中的平均TF丰度为6%（在线资源11）。如上所述，G4组包含了在所有分析阶段都在Calabria柑橘中诱导表达的模块。它包含890个基因，其中包括51个TF，分布在10个模块中（在线资源11）。在这些51个TF中，有20个与其各自模块中的至少50%的基因有直接关联（表1）。之前鉴定出的三个TFs——TF1、TF2和TF3——包含在这21个TF中。TF1被归类在灰色60模块中，与其模块中的55%的DEGs有连接。TF2和TF3分别被归类在红色模块中，与其模块中的66%和57%的DEGs有连接。TF4属于灰色模块（表S10），与其模块中的49%的基因有连接。

**表1**
在WGCNA模块网络中检测到的具有最多边的转录因子（TFs）

**表1**
这20个TF在至少一个发育阶段在Calabria中的活性高于在Yemenite中（表1）。大多数这些TF与可能涉及组织形成和生长以及细胞分化的过程有关。例如，Cs2g25740是拟南芥基因AT1G66350的同源物，编码DLLA亚家族的GRAS蛋白RGA-LIKE1（RGL1），参与细胞分化（Wen和Chang 2002）。几个TF与分生组织调节有关，包括Cs2g09770，它是AT2G34710的同源物（一种HD-ZIP基因，编码PHABULOSA，PHB）（Williams等人，2005；Müller等人，2015）；orange1.1t00208，它是AT2G45190的同源物（一种YABBY家族基因，编码FILAMENTOUS FLOWER，FIL，参与叶片和果实的背轴细胞类型指定）（Lugassi等人，2010；Bonaccorso等人，2012）；以及orange1.1t00339，它是AT3G61250的同源物（一种MYB家族基因，编码LATE MERISTEM IDENTITY2，LMI2）（Pastore等人，2011）。其他TF与花发育有关，例如Cs1g08850，它是AT5G58280的同源物（一种AP2/B3类TF，编码DNA结合蛋白）（Zhou等人，2021；Jiang等人，2022），以及Cs8g05770和Cs8g05780，它们是AT3G19184的同源物（AP2/B3类TF，编码REPRODUCTIVE MERISTEM1，REM1）（Luna-García等人，2024）。此外，Cs2g16790是AT3G18010的同源物（一种WUSCHEL相关同源框基因，编码WOX1），与胚胎模式形成有关（Haecker等人，2004）。

**图8**
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**图像全尺寸**
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通过WGCNA分析（图5）对第1-4组的基因进行GO富集分析的可视化结果。每个矩形代表一个单独的簇。簇被合并成由松散关联术语组成的“超级簇”，用不同颜色进行可视化。矩形的大小根据GO术语的p值进行调整。

**Calabria和Yemenite柑橘之间的非靶向代谢组学比较**
与在内果皮细胞中进行的转录组学分析不同，代谢组学分析是在整个子房和小果实上进行的，排除了外皮（flavedo）、中央连接组织（隔膜）和胚珠/种子（在线资源1）。在检测到的860种代谢物中，有138种被鉴定出来（在线资源14）。所有检测到的代谢物的主成分分析（PCA）显示，无论在四个分析的发育阶段中，两种品种总体上都是分开的，尤其是在PC2和PC3中，但在PC1和PC2中的分离程度较小（图8a）。同样，对这138种鉴定出的代谢物进行的PCA也显示了两种品种之间的明显分离（图8b）。此外，在Calabria和Yemenite柑橘中，CF阶段和A阶段与A1W和A2W阶段也是分开的（图8a，b）。对鉴定出的代谢物进行的统计分析显示，有26种、44种、23种和14种代谢物在两种品种的CF阶段、A阶段、A1W阶段和A2W阶段之间存在显著差异，但总体分布较为均匀（图8c）。

**图8**
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按发育阶段和两种柑橘品种（Yemenite (YM) 和 Calabria (CL)）分析的非靶向代谢物。890种非靶向代谢物的主成分分析（PCA）：PC1和PC2之间的3D分数图，以及PC2和PC3之间的3D分数图。b 单因素方差分析（ANOVA）显示了在指定的发育阶段（CF、A、A1W和A2W）中Calabria和Yemenite之间显著不同的代谢物数量。

**图9**
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图9示意性地总结了Calabria和Yemenite柑橘中初级代谢物（不包括糖类）水平的变化。TCA循环中的大多数代谢物在Yemenite中的水平高于Calabria，除了cis-aconitate这一循环中间产物。然而，它们的发育模式不同。Citrate、succinate和fumarate的水平在两个品种中普遍降低，而isocitrate在Yemenite中降低但在Calabria中增加。Cis-aconitate的水平在两个品种中基本保持稳定。

**图9**
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氨基酸和有机酸的代谢示意图，显示Yemenite（红色）中的水平总体较高，Calabria（蓝色）中较低，或没有变化（灰色）。旁边显示了Calabria和Yemenite在CF、A、A1W和A2W阶段的每种代谢物的平均值。条形图表示标准误差。

**图10**
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大多数检测到的氨基酸在Calabria中的水平至少在某个发育阶段高于Yemenite柑橘。Aspartate是个例外，在Yemenite中的水平较高。然而，由aspartate合成的氨基酸——alanine、lysine和asparagine——在Calabria中的水平较高，其中asparagine在两种品种中都存在；alanine在Calabria中总体上减少，而lysine在Calabria中减少，在Yemenite中则呈相反趋势。来自pyruvate的氨基酸——leucine、isoleucine和2-oxobutanoate——以及来自3-phosphoglyceraldehyde（3-PGA）的氨基酸——glycine和serine——在Calabria中的水平一般较高。Glycine和serine在两种品种中的模式相同，从CF到A1W水平降低，然后在A2W阶段重新诱导。虽然leucine的水平在两种品种中都减少，但isoleucine在Calabria中保持稳定，在Yemenite中减少。

**图10**
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来自2-oxoglutarate的氨基酸显示出混合的发育模式。Alanine、proline和glutamine在Calabria中的水平较高，而glutamate和aspartate在Yemenite中较高。尽管存在这些差异，但这些氨基酸在两种品种中的发育模式相似。Shikimate和anthranilate在两种品种中的发育模式相当，尽管它们的水平在Yemenite中较高。然而，tyrosine在Calabria中更丰富，尽管在两种品种中的变化模式相似，表现为在四个发育阶段中逐渐减少。Ferulic acid作为木质素生物合成的前体，在Calabria的A1W和A2W阶段水平较高。在Yemenite中，ferulic acid的水平在所有阶段逐渐降低。

**图10**
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与大多数氨基酸和TCA循环代谢物不同，糖类没有显示出明显的变化在卡拉布里亚柠檬中，碳水化合物代谢途径中仅glyoxylate和dicarboxylate代谢途径得到富集，而与能量相关的途径中硫代谢途径得到富集。在氨基酸代谢途径中，alanine、aspartate和glutamate代谢在也门柠檬的A阶段显著富集，在卡拉布里亚柠檬中也同样得到富集。然而，在卡拉布里亚柠檬的CF和A阶段，许多额外的氨基酸代谢途径也得到了富集：包括cysteine和methionine代谢、tyrosine代谢、lysine降解、glycine、serine和threonine代谢、alanine、aspartate和glutamate代谢、氰基氨基酸代谢以及氨基酰-tRNA生物合成，其中后者在A阶段的FDR<0.05。在A1W+A2W阶段，与碳水化合物和能量代谢相关的六条途径得到富集。有三条途径仅在卡拉布里亚柠檬中富集：pentose和glucuronate互转化、糖酵解或糖异生以及氨基糖和核苷酸糖代谢，其中pentose和glucuronate互转化基于FDR测试显示出高度显著性。两条途径仅在也门柠檬中富集：pyruvate代谢和glyoxylate及dicarboxylate代谢。淀粉和蔗糖代谢在两个品种中都得到富集。此外，在A1W+A2W阶段，phenylpropanoid生物合成途径在两个品种中都得到富集，在卡拉布里亚柠檬中这种富集的显著性更高。

**讨论**
**卡拉布里亚柠檬中的汁囊形成**
内果皮由果皮的内层和部分胎座膜组成，此外还有一层表皮细胞及其周围的几层薄壁细胞（Ford 1942）。汁囊（JS）起源于表皮细胞中的抗斜向和周斜向分裂，这些表皮细胞保留了分生能力（Nii和Coombe 1988b；Burns等人1992）。表皮下的细胞也会分裂，但它们的子细胞会增大并失去分生特性。表皮细胞的斜向分裂后伴随细胞增大，形成了锥形的结构（Carrillo-López和Yahia 2019；Nii和Coombe 1988b；Ford 1942）。开花后不久，无论是否受精，内果皮的表皮细胞层上都会出现JS的原基（Assili等人2024）。也门柠檬品种不形成JS，可能是由于内果皮表皮中没有抗斜向分裂，或者表皮下的细胞无法分化为增大的JS细胞。转录组分析显示，大多数差异表达基因（DEGs）出现在A2W阶段，这与JS原基的出现时间相符；然而，调控过程可能早在更早期发育阶段就已经启动。

**卡拉布里亚柠檬与也门柠檬中的细胞增殖相关过程与应激相关过程**
转录组分析、WGCNA、基因注释（GO）和MapMan的结果表明，在卡拉布里亚柠檬的CF、A和A2W阶段富集的第四组基因（图6）与对化学物质的响应、DNA相关过程（包括复制、修复和染色质相分离）、细胞分裂、细胞周期调控、细胞分裂和细胞器组织有关（图7）。此外，在A2W阶段，与细胞壁形成和修饰相关的过程在卡拉布里亚柠檬中也得到富集，包括参与细胞壁松弛的基因（如EXPANSIN家族，Cosgrove 2000）和细胞壁降解的基因（如pectate lyases和polygalacturonases，Uluisik和Seymour 2020）。这些发现与汁囊形成过程中细胞扩张和增殖的需求一致。另一方面，这些过程在也门柠檬中未得到富集，可能表明与该过程相关的途径受到抑制，这可能解释了其独特的发育程序。

**第三组基因在也门柠檬中的富集**
第三组基因在也门柠檬中富集，尤其是在CF阶段，与对非生物刺激、应激（特别是氧化应激）的响应有关。在我们之前的研究中，我们发现也门柠檬的内果皮细胞中的ABA代谢、信号传导和运输以及整个 ovaries和果实的激素水平都比卡拉布里亚柠檬高。ABA通过抑制细胞分裂和分化来抑制营养生长（De Smet等人2003；Shimizu-Sato和Mori 2001；Zhang等人2010）。因此，可以推测ABA也可能抑制汁囊的形成。此外，ABA还与应激反应紧密相关，并在各种应激条件下被诱导，促进活性氧（ROS）的积累（Li等人2022；Parwez等人2022）。这引发了应激本身是否可能抑制汁囊形成和生长的问题。已知应激条件通过调节细胞周期、细胞扩张和分化来影响细胞生长和发育（Shafqat等人2021）。此外，应激还会影响次生代谢，后者可以提供对抗氧化应激的保护（Nehela和Killiny 2020）。

**代谢组分析**
虽然转录组分析是在内果皮细胞中进行的，但由于技术限制，代谢组分析是在整个 ovaries/果实中进行的，排除了外果皮（果皮）、隔膜和种子（在线资源1）。因此，尚不清楚观察到的代谢组变化是否也发生在内果皮细胞中，或者卡拉布里亚柠檬与也门柠檬在分析的发育阶段是否存在代谢物的显著差异。联合途径分析（整合了转录组数据和代谢组数据，并将代谢物水平的变化与其相应的生物合成基因的表达进行比较）为这个问题提供了一部分答案（Katam等人2022）。对整个 ovaries和果实的代谢组分析显示，TCA循环代谢物在也门柠檬中通常更高，而大多数主要氨基酸在卡拉布里亚柠檬中更丰富，除了aspartate和glutamate在也门柠檬中更高。此外，转录组数据显示，也门柠檬的内果皮细胞在至少三个发育阶段中与光合作用、氧化还原调节、信号传导、运输和碳水化合物代谢相关的进程富集。联合途径分析确认，TCA循环和能量代谢途径在也门柠檬中富集，表明对于这些过程，内果皮细胞和整个 ovaries/果实显示出相似的代谢行为。然而，对于氨基酸代谢，这种对应关系仅存在于cysteine、methionine、tyrosine和lysine中；其他氨基酸途径在也门柠檬或两个品种中都得到富集。

**TCA循环的作用**
TCA循环是细胞呼吸中的核心途径，将碳水化合物分解产生的pyruvate转化为ATP（Salazar-Roa和Malumbres 2017）。它还为细胞生长和分裂提供碳和生物合成中间体（Zhang和Fernie 2018）。此外，TCA循环在应对生物和非生物应激中起关键作用，其重编程对于减轻包括氧化应激在内的应激至关重要（Zhang和Fernie 2023；MacLean等人2023）。根据联合途径分析，在开花期间，galactose代谢在也门柠檬中也得到富集（Araniti等人2018；Zhang等人2015）。尽管在代谢组分析中未检测到galactose本身，但检测到了两种相关化合物——galactarate（mucic acid）和glucarate（saccharic acid）。这两种化合物在也门柠檬的ovaries和果实中的水平比卡拉布里亚高（图S3）。这些糖酸由葡萄糖和galactose氧化产生，通过galactarate脱水酶和glucarate脱水酶进行代谢转化。据报道，这两种化合物或在其中一种化合物在应激条件下（包括氧化应激）会积累（Araniti等人2018；Mellidou等人2021；Yadav等人2021；Rangani等人2020；Barros等人2023）。

**其他相关基因**
在也门柠檬中还检测到几个与拟南芥应激相关基因的柑橘同源物，包括参与应激诱导的淀粉代谢的BETA-AMYLASE类似基因（Berndsen等人2025；David等人2022）和与多种应激反应相关的raffinose代谢相关基因（Yan等人2022），进一步支持了也门柠檬中可能存在诱导的应激信号传导。

**调控汁囊形成的候选驱动基因**
上述数据以及我们之前的研究结果表明，ABA和类似应激的条件可能抑制也门柠檬中的汁囊形成。然而，也有理由假设卡拉布里亚柠檬中存在促进汁囊形成的调控机制，而在也门柠檬中不存在。这一假设促使我们关注在卡拉布里亚内果皮中诱导的转录因子（TFs）。WGCNA识别出21个在卡拉布里亚中富集的第四组TFs，这些TFs可能是汁囊形成和形成的驱动基因。其中大多数TFs参与组织发育和生长，特别是在生殖器官中。

**其他相关基因**
已有多个基因被报道在拟南芥和其他植物中调节花分生组织的形成。这些基因包括REM1，它参与花发育（Mantegazza等人2014）；VRN1/REM39，一种参与花转变和后期花发育的DNA结合蛋白（Mantegazza等人2014）；以及LMI2，它促进从营养生长到开花的分生组织转变（Pastore等人2011）。其他TFs包括NFL，一种通过gibberellin信号传导控制开花时间的bHLH TF（Sharma等人2016），以及FIL，它调节分生组织结构（Chen等人1999）。这一组中的其他基因参与细胞发育、分化和增殖，例如RGL1，一种限制细胞增殖和扩张的DELLA亚家族GRAS蛋白（Wen和Chang 2002）；PDF2，在营养、花和花序分生组织中的L1层表达，参与表皮细胞分化（Nagata和Abe 2023；Rombolá-Caldentey等人2014）；WOX1，调节边缘分生组织的发育（Dolzblasz等人2016；Wang等人2020）；以及PHB，它控制根和叶组织的形成（Bertolotti等人2021；Hur等人2015）。

**结语**
尽管汁囊原基在开花后一周才被首次检测到，但控制这一过程的调控机制可能在花和卵巢的早期发育阶段就已经活跃，甚至可能在分生组织转变阶段就已经开始。因此，从分生组织启动到花器官发育和果实形成的整个过程中涉及的基因都可能参与汁囊的形成。

**进一步分析的TFs**
从第四组中选择了四个TFs进行进一步分析，因为与它们所属基因家族的大多数成员在也门柠檬中仅被诱导不同，这些TFs在卡拉布里亚柠檬的三个或四个发育阶段都被诱导。TF2和TF3在两个品种的整个 ovaries和果实中的表达水平相似，但在内果皮组织中表现出显著差异，表明它们在内果皮细胞中有特定作用。TF4在两个品种的 ovaries中的表达量都非常低，进一步支持其内果皮特异性功能，与TF2和TF3类似。这三个TFs与发育过程相关。TF2是一种BOLITA类似基因，编码一种对乙烯敏感的转录因子（ESR2），也可能调节细胞周期。TF3是一种LMI1类似基因，编码一种假定的同源框-亮氨酸拉链蛋白，调节分生组织身份并在多种生物过程中作为转录因子（Xu等人2010）。TF4是一种NAC结构域转录因子，其家族成员控制多种发育过程，包括分生组织起始和形成、胚珠数量和心皮发育（Cucinotta等人2018；Kamiuchi等人2014；Hibara等人2006；Raman等人2008）。该基因与拟南芥的CUC2基因和番茄的GOBLET基因具有高度同源性。这些基因通过控制次级器官之间的形成边界区域来调节叶和心皮的次级结构发育（Bilsborough等人2011；Ben-Gera等人2012）。有趣的是，异位表达GOBLET可以产生多心皮表型（Berger等人2009）。番茄和柑橘，像大多数真型果实一样，由心皮组成，这些心皮在发生上起源于叶片或与叶片有共同的起源（Fahn 1990）。因此，叶片和心皮上的次级结构可能有类似的起源和/或受到类似的发育机制调控。一个值得研究的假设是TF4可能在柑橘中参与汁囊原基的启动。

**TF1的特异性**
与TF2、TF3和TF4不同，TF1在也门柠檬的整个 ovaries中的表达都很低，表明其在品种间的差异可能不限于内果皮。尽管如此，它参与汁囊形成的可能性不能排除，因为其拟南芥同源基因（AT1G68640，PAN）已知调节花器官发育（Das等人2009；Maier等人2009；Chuang等人1999）。尽管如此，也门香橼虽然不会形成汁囊，但它为通过生理学和生物化学方法研究汁囊的生成机制提供了有用的研究材料。虽然本研究的转录组分析主要聚焦于作为汁囊来源组织的果皮细胞，但代谢组分析则是针对整个 ovaries（卵巢状结构）和果实小部分进行的。转录组分析以及转录组与代谢组数据的联合分析表明，卡拉布里亚香橼的汁囊形成是由与生长相关的过程（如细胞分裂和增殖）驱动的。相比之下，也门香橼的特征是激活了应激响应机制，这可能与ABA（脱落酸）水平升高有关，正如我们之前的研究（Assili等人，2024年）所揭示的那样。本研究还确定了可能参与果皮细胞分化及汁囊生成的关键转录因子，包括GRAS、ERF、HD-ZIP和NAC转录因子家族的成员。这些发现为未来研究柑橘类水果中控制汁囊生成的分子机制奠定了基础。例如，目前正通过转基因技术来探索特定转录因子在汁囊生成中的作用。此外，通过对更多香橼品种（包括那些能形成汁囊的和那些不能形成汁囊的品种）进行更广泛的比较，可能会进一步加深我们对这一机制的理解。