TYLCCxV编码的C4蛋白的可逆S-棕榈酰化过程调控了双生病毒（geminivirus）的致病机制

《Stress Biology》：Reversible S-palmitoylation of C4 protein encoded by TYLCCxV orchestrates geminiviral pathogenesis

　　摘要：半胱氨酸棕榈酰化（S-棕榈酰化或S-酰化）是一种可逆的翻译后修饰，由相互拮抗的酶——棕榈酰基转移酶（PATs）和去棕榈酰化酶动态控制。尽管在其它系统中其作用已得到证实，但在植物中的S-酰化机制，特别是在植物-病毒相互作用期间的时空调控方面，仍然知之甚少，这主要是由于缺乏经过验证的酶-底物对。以双生病毒番茄黄化曲叶病毒（TYLCCxV）作为模型，我们发现病毒效应因子C4在第4位半胱氨酸（Cys-4）处发生S-棕榈酰化，这种修饰对其在质膜上的锚定以及后续的病毒致病性至关重要。来自本氏烟草（Nicotiana benthamiana）的棕榈酰基转移酶NbPAT4催化C4的S-棕榈酰化，促进其向膜上的定位、蛋白质稳定性并增强病毒感染能力。相反，C4第4位半胱氨酸被替换为精氨酸（C4C4S）后，S-棕榈酰化被消除，导致蛋白质重新分布到细胞质中，稳定性降低，病毒致病性减弱。我们还鉴定出NbABHD6作为一种去棕榈酰化酶，它能与C4相互作用并催化其S-去棕榈酰化，进而通过26S蛋白酶体途径促进C4的降解。这项研究揭示了植物-双生病毒相互作用中的一个调控轴，确定NbPAT4和NbABHD6为拮抗性酶，它们动态调节C4的S-酰化程度。这些发现支持了一种宿主-病原体之间的酶学拔河模型，其中竞争性的S-棕榈酰化平衡控制着病毒的亚细胞运输和致病性。

引言：棕榈酰化是真核细胞中一种主要的蛋白质脂质化形式，包括N-棕榈酰化、O-棕榈酰化和S-棕榈酰化（Yang等人，2008年）。其中，半胱氨酸棕榈酰化（也称为S-棕榈酰化或S-酰化）涉及通过硫酯键将饱和的16碳棕榈酸共价连接到半胱氨酸（Cys）残基上。由于硫酯键的不稳定性，这种修饰是动态且可逆的（Zaballa和van der Goot，2018年）。S-酰化在调节膜结合、亚细胞运输、蛋白质稳定性和多种细胞条件下的酶活性中起着核心作用（Linder和Deschenes，2007年）。S-酰化是一个可逆过程，由两个拮抗的酶家族控制：棕榈酰基转移酶（PATs）和去棕榈酰化酶（Magee和Seabra，2005年）。PATs的特点是含有一个保守的富含半胱氨酸的结构域，其中包含催化性DHHC（Asp-His-His-Cys）基序，该基序介导棕榈酰基团向目标蛋白质的转移（Mitchell等人，2006年）。在酵母和哺乳动物系统中，S-酰化已被广泛研究。在人类中已鉴定出23种PATs，其中许多与各种疾病相关，强调了DHHC-PATs在生理和病理背景下的关键作用（De和Sadhukhan，2018年）。相比之下，植物中S-酰化的研究仍然有限（Hemsley，2020年）。尽管如此，生物信息学分析揭示了多个植物物种中存在DHHC蛋白同源物（Yuan等人，2013年）。在拟南芥（Arabidopsis）中，研究人员鉴定了24种具有不同亚细胞定位的PATs（Batistic，2012年），为进一步探索植物生物学中的S-酰化奠定了基础。在水稻、玉米和大豆中发现了越来越多的S-棕榈酰化蛋白（Yuan等人，2013年；Li等人，2016年）。值得注意的是，水稻条纹病毒（RSV）和马铃薯簇顶病毒（PMTV）已经进化出利用宿主的S-酰化蛋白来促进感染。在本氏烟草中，RSV编码的NSvc4蛋白与Remorin 1（NbREM1）相互作用，破坏其S-棕榈酰化，并通过自噬途径促进其降解，从而增强RSV的感染（Fu等人，2018年）。同样，PMTV利用其三基因块1（TGB1）蛋白干扰NbHIPP26（一种与重金属相关的异戊二烯酰化植物蛋白）的S-酰化，使这两种蛋白都能通过微管转运到细胞核，最终促进PMTV的长距离传播（Cowan等人，2018年）。迄今为止，已有三种植物病毒蛋白被报道发生S-酰化。绿豆黄斑病毒（MYMV）的AC4通过S-酰化定位于质膜，与RNA干扰（RNAi）调节因子BARELY ANY MERISTEM 1（BAM1）相互作用并抑制基因沉默（Carluccio等人，2018年）。甜菜严重卷叶病毒（BSCTV）的S-酰化C4蛋白与受体激酶CLAVATA 1（CLV1）相互作用，后者调节分生组织维持，导致发育异常（Li等人，2018年）。在大麦条纹花叶病毒（BSMV）中，S-棕榈酰化的γb蛋白招募TGB1到叶绿体中，促进病毒复制和移动之间的切换。这一过程受到宿主棕榈酰基转移酶NbPAT15和NbPAT21的调控（Yue等人，2022年）。去棕榈酰化酶，也称为去酰化酶，催化硫酯键的水解，从蛋白质底物中去除酰基团。在哺乳动物细胞中，已鉴定出三类主要的去酰化酶：棕榈酰基-蛋白质硫酯酶1（PPT1）、酰基-蛋白质硫酯酶APT1和APT2以及含有α/β水解酶结构域的蛋白质17（ABHD17）家族（Won等人，2018年）。相比之下，植物中的去酰化研究仍然有限。例如，来自玉米（Zea mays）的假定硫酯酶ZmB6T1C9与哺乳动物的APTs具有结构相似性，但其去棕榈酰化活性尚未得到证实（Burger等人，2017年）。在拟南芥中，提出了11种与哺乳动物ABHD17结构相似的蛋白质作为候选去棕榈酰化酶，它们调节S-酰化水平并影响五种免疫相关蛋白质的亚细胞定位（Liu等人，2021年）。此外，在Medicago truncatula中，S-酰化的转录因子MtNAC80在冷胁迫下通过MtAPT1介导的去酰化从膜转运到细胞核（Ye等人，2024年）。最近，在拟南芥中鉴定了ABAPT3作为针对BSCTV编码的C4蛋白的去酰化酶（Zhao等人，2024年）。迄今为止，这是唯一已知的涉及特定底物及其特定去酰化酶的植物-病毒相互作用案例。尽管取得了这些进展，植物中去酰化的分子功能和调控机制仍大多未被探索。

双生病毒是一类以单链环状DNA（ssDNA）为特征的植物病毒，它们会导致重要作物的严重疾病（Varma和Malathi，2003年）。最大的属Begomovirus包含445种物种，进一步分为双份体和单份体两类。双份体begomovirus具有两个环状基因组成分DNA-A和DNA-B，而单份体begomovirus则具有一个大小与DNA-A相似的单一环状基因组，约为2.8 kb（Rojas等人，2005年）。在双生病毒与植物之间的持续“军备竞赛”中，这些病毒已进化出复杂的策略来抑制宿主免疫，包括使用多功能效应蛋白如C4。C4蛋白作为一种关键的毒力因子，通过决定症状表现、抑制转录基因沉默（TGS）和转录后基因沉默（PTGS）以及破坏多层植物防御机制发挥作用。BSCTV的C4上调RKP，导致细胞周期抑制剂ICK/KRP的水平降低，从而破坏有丝分裂周期并引起细胞异常分裂（Lai等人，2009年）。番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的C4与受体激酶BAM1相互作用，阻断RNAi的移动并抑制PTGS（Rosas-Diaz等人，2018年）。棉花叶卷曲Multan病毒（CLCMuV）的C4与S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）结合，后者是甲基化循环中的核心酶，从而抑制SAMS活性并抑制TGS（Ismayil等人，2018年）。TYLCV的C4还通过劫持钙感应受体CAS来抑制水杨酸生物合成，削弱植物免疫力（Medina-Puche等人，2020年）。此外，烟草叶卷曲Yunnan病毒（TbLCYnV）的C4通过直接相互作用促进蔗糖非发酵-1相关激酶1亚单位β（NbSnRK1β2）的降解，从而对抗宿主的抗病毒反应（Li等人，2024年）。最近在中国发现的单份体begomovirus TYLCCxV在植物中引发严重的疾病症状，包括叶片向上卷曲、皱缩、黄化和生长受阻。TYLCCxV的C4蛋白作为症状决定因子，当通过马铃薯病毒X（PVX）载体表达时可以触发类似病毒的症状（Xie等人，2024年）。然而，C4如何操纵宿主因子来调节植物防御反应的分子机制尚不清楚。虽然先前的研究表明BSCTV的C4和MYMV的AC4发生S-酰化（Carluccio等人，2018年；Li等人，2018年），但它们的酶学调控以及S-酰化周期在植物-病毒相互作用中的生物学作用仍大部分未被探索。在本研究中，我们证明TYLCCxV的C4在第4位半胱氨酸残基发生可逆的S-酰化。棕榈酰基转移酶NbPAT4催化C4的棕榈酰化，促进其在质膜上的积累和定位，从而增强病毒感染。相反，去棕榈酰化酶NbABHD6介导C4的S-去酰化，导致其通过26S蛋白酶体途径降解。这种动态的棕榈酰化-去棕榈酰化循环揭示了双生病毒与宿主防御机制之间一个先前未被认识的调控层面。

结果：TYLCCxV C4蛋白第4位半胱氨酸的S-酰化促进其在质膜上的定位和蛋白质积累。TYLCCxV的C4作为症状决定因子（Xie等人，2024年），但其潜在机制仍不清楚。为了研究C4的亚细胞定位，我们将表达H2B-RFP的转基因本氏烟草叶片与表达C4-GFP（GFP与C4的C端融合）或仅表达GFP的构建体一起 infiltration。在infiltration后48小时（hpi），我们使用共聚焦显微镜观察局部感染叶片中的GFP和RFP荧光。C4-GFP荧光主要定位于细胞质和质膜，核信号较弱，而单独的GFP则分布于整个细胞质和细胞核（图1A）。为了验证C4的定位，我们进行了亚细胞分级分析。我们将本氏烟草叶片与PIP2A-DsRed（质膜标记物）以及C4-GFP或GFP一起 infiltration。然后通过30,000×g离心将总蛋白质提取物分为沉淀（P30）和上清（S30）两部分。Western blot分析显示C4-GFP与PIP2A-DsRed共同沉淀在P30中，表明其定位于膜上，而单独的GFP仅出现在S30上清中，与其细胞质定位一致（图1B）。这些结果表明TYLCCxV的C4主要定位于质膜上。

图1：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

完整尺寸图像：TYLCCxV编码的C4第4位半胱氨酸的S-酰化促进质膜定位和蛋白质表达。代表性的共聚焦显微镜图像显示了本氏烟草叶片表皮细胞中C4和突变体C4C4S的亚细胞定位。转基因H2B-RFP本氏烟草植株分别 infiltration了C4-GFP或C4C4S-GFP或GFP。H2B用作细胞核标记物。从左到右的列分别为：GFP、RFP和GFP/RFP合并图（Merge）。刻度尺为20 μm。B：C4和突变体C4C4S的亚细胞分级分析。本氏烟草叶片分别与PIP2A-DsRed和C4-GFP、C4C4S-GFP或GFP一起 infiltration。离心后（3,000 g或30,000 g，30 K），将叶片组织分为可溶部分（S）和膜富集部分（P）。免疫印迹用于检测抗GFP或抗RFP抗体。GFP和PIP2A-DsRed分别作为可溶部分和膜富集部分的标记物。C和E：通过生物素开关测定法检测C4（C）或突变体C4C4S（E）蛋白的S-酰化。本氏烟草叶片分别 infiltration了C4-GFP或C4C4S-GFP，然后在NeutraAvidin珠上加载蛋白质提取物。使用抗GFP抗体进行免疫印迹。标记为“Palmitoylation”的泳道显示从Neutravidin珠中回收的C4-GFP或C4C4S-GFP的量，表明发生了S-酰化。Hyd：羟胺。D：通过Q-exactive液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）分析检测C4中的S-酰化位点。本氏烟草叶片表达了C4-Flag，蛋白质提取物通过SDS-PAGE进行分析。红色箭头和圆圈指向第4位半胱氨酸处的S-酰化位点。F：C4和C4C4S蛋白的Western blot分析和半定量RT-PCR测定其积累和mRNA水平。C4-Flag或C4C4S-Flag分别 infiltration到本氏烟草叶片的相反半部分，然后使用抗Flag抗体进行Western blot检测。C4蛋白的表达量是使用Image J 1.8.0软件计算的，C4-Flag的数据被设置为1.00。作为加载对照，使用了actin蛋白的表达。C4和C4C4S的转录水平是通过半定量RT-PCR（semi-qRT-PCR）来检测的，actin蛋白被用作参考基因。2-溴棕榈酸（2-BP）对C4的亚细胞定位（G）和转录水平上的蛋白质积累（H）的影响也被研究了。同时表达C4-GFP或C4-Flag的N. benthamiana叶片与500 μM的2-BP或CH3OH（作为对照的溶液）进行了共渗透实验。比例尺为10 μm（G）。样品通过Western blot和anti-Flag抗体进行检测。C4的蛋白质积累量同样使用Image J 1.8.0软件计算，且C4在CH3OH处理下的数据被设为1.00。半定量RT-PCR用于检测C4 mRNA的转录水平（H）。

为了探究TYLCCxV C4蛋白定位于质膜的原因，我们使用了在线蛋白质跨膜结构预测工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）来分析C4的蛋白质结构。分析结果显示C4蛋白不含有跨膜结构域。然而，通过CSS-Palm 4.0在线服务器（http://csspalm.biocuckoo.org/online.php）检测到C4蛋白在甘氨酸2位点有N-豆蔻酰化修饰，在半胱氨酸4位点有S-酰基化修饰（见补充图S1）。为了验证C4的S-酰基化，我们在N. benthamiana叶片中表达了C4-GFP，并在渗透后2天提取了蛋白质样本进行了生物质素交换试验（Biotin-switch assay）（Hemsley等人，2008年）。在经过羟胺处理的样本中观察到了明显的信号，表明蛋白质发生了S-酰基化。而在未经处理的对照组中则没有检测到信号。此外，经过羟胺处理的样本与未经处理的样本中C4的表达水平相似（见图1C），这证实了TYLCCxV C4确实发生了S-酰基化。为了确定C4中具体的S-酰基化位点，我们从N. benthamiana叶片中免疫沉淀了C4-Flag蛋白，并使用Q-Exactive液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）进行了分析。结果表明TYLCCxV C4在半胱氨酸4位点发生了S-酰基化（见图1D）。另外，我们将C4中的半胱氨酸4替换为丝氨酸（生成了C4C4S突变体），并通过生物质素交换试验检测了突变体C4的S-酰基化水平。在羟胺处理后，C4C4S突变体中没有检测到S-酰基化信号（见图1E），这进一步证实了C4确实在半胱氨酸4位点发生了S-酰基化。

为了评估S-酰基化对TYLCCxV C4亚细胞定位的影响，我们在表达H2B-RFP的转基因N. benthamiana叶片中同时渗透了C4-GFP或C4C4S-GFP（C4C4S的C端融合了GFP）。C4-GFP的荧光主要在质膜上被检测到，而C4C4S-GFP的荧光则分布在细胞质和细胞核中，这与单独表达GFP的情况相似（见图1A）。我们通过亚细胞分级实验进一步证实了这一观察结果。C4C4S-GFP出现在沉淀物（P30）和上清液（S30）两部分中（见图1B），这加强了S-酰基化对于C4定位于质膜的重要性。接下来，我们研究了S-酰基化是否影响C4的蛋白质周转。我们将C4-Flag和C4C4S-Flag（Flag融合在C4或C4C4S的C端）分别渗透到同一叶片的两半进行比较。使用ImageJ 1.8.0软件量化了蛋白质表达水平，其中C4-Flag的表达被设为1.00。Western blot分析显示，与野生型C4-Flag相比，C4C4S-Flag的蛋白质水平显著降低（分别为0.11和0.05，而野生型为1.00和1.00，见图1F）。为了确定C4蛋白水平的下降是否由于转录量的变化，我们从同一植物样本中提取了总RNA。半定量RT-PCR分析显示，野生型C4和C4C4S的转录量相当（见图1F）。这些结果表明，TYLCCxV C4通过半胱氨酸4位的S-酰基化定位于质膜，并且S-酰基化增强了C4蛋白的积累和稳定性。

为了研究S-酰基化对C4蛋白亚细胞定位和稳定性的影响，我们用500 μM的2-溴棕榈酸（2-BP）处理了表达C4-GFP或C4-Flag的N. benthamiana植物，2-BP是一种特异性蛋白质棕榈酰化抑制剂（Hemsley等人，2005年）。与C4-GFP或C4-Flag以及2-BP的溶剂甲醇（CH3OH）共渗透的植物作为阴性对照。在2-BP处理下，C4-GFP的荧光主要分布在细胞质中，而在对照组（CH3OH处理）中，C4-GFP的荧光主要位于质膜上（见图1G）。Western blot分析显示，与对照组相比，2-BP处理下的C4蛋白积累显著减少（分别为0.48和0.47，而对照组为1.00和1.00，见图1F）。这种蛋白质积累的减少并非由于转录量下降，因为半定量RT-PCR显示两种处理下的mRNA水平相当（见图1H）。这些结果表明，棕榈酰化抑制剂2-BP通过降低C4的S-酰基化水平影响了其亚细胞定位和积累。综合这些实验结果，我们有充分的证据表明TYLCCxV C4在体内确实经历了S-酰基化，并且S-酰基化对于C4的质膜定位和蛋白质稳定性至关重要。

C4蛋白的S-酰基化影响TYLCCxV的致病性。为了研究C4的S-酰基化在病毒感染中的作用，我们使用携带C4或其突变体C4C4S的农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）通过PVX载体（pGR106）感染了N. benthamiana植物。接种PVX::C4的植物在14天时出现了系统性的叶片卷曲和茎部伸长现象，而接种PVX::C4C4S的植物仅表现出轻微的黄化症状，与阴性对照PVX相似（见图2A）。使用anti-C4和anti-PVX-CP抗体对这些植物的蛋白质提取物进行Western blot分析后发现，PVX::C4和PVX::C4C4S感染植物中的C4表达水平相当。此外，所有接种PVX载体构建体的植物中PVX CP的积累量也相似（见图2B）。

C4蛋白的S-酰基化调节病毒感染过程。A. 在14天时接种PVX、PVX::C4C4S和PVX::C4的N. benthamiana植物的症状。比例尺为2厘米。B. 使用anti-C4和anti-PVX-CP抗体对A面板中农杆菌渗透叶片中的C4表达水平和PVX积累情况进行Western blot分析。使用anti-Actin抗体检测actin蛋白作为加载对照。C. 在15/30天时接种TYLCCxV或突变体TYLCCxV（C4C4S）的N. benthamiana植物的症状。比例尺为2厘米。D. 在15/30天时，对C面板中N. benthamiana植物中的TYLCCxV DNA积累情况进行Southern blot分析。Southern blot使用了来自三株幼苗的混合总基因组DNA（每个泳道10微克），并与TYLCCxV包被蛋白（CP）探针杂交。下面的溴化乙锭染色凝胶提供了DNA加载对照。单链（ss）DNA和亚基因组（sg）DNA的形式在图中标出。

为了进一步探讨C4 S-酰基化在病毒感染过程中的生物学功能，我们生成了一种TYLCCxV突变体（C4C4S）的 infectious clone，其中C4蛋白的第四位半胱氨酸被丝氨酸取代。我们将TYLCCxV infectious clone（C4C4S）或空pBinPLUS载体接种到N. benthamiana植物中。值得注意的是，接种TYLCCxV（C4C4S）的植物表现出的症状比接种野生型TYLCCxV的植物更轻微。接种TYLCCxV（C4C4S）的植物系统性叶片没有明显的病毒症状，类似于接种pBinPLUS的植物。相反，接种TYLCCxV的植物在15天时出现了叶片向上卷曲的现象。在30天时，TYLCCxV感染的植物表现出严重的叶片向上卷曲和叶脉肿胀，而接种TYLCCxV（C4C4S）的植物仅表现出轻微的叶片卷曲和生长受阻（见图2C）。Southern blot分析显示，在15天时TYLCCxV（C4C4S）感染植物中的病毒信号较弱，在30天时进一步减弱。而在接种pBinPLUS的植物中未检测到病毒信号（见图2D）。这些结果表明，C4在半胱氨酸4位的S-酰基化在调控TYLCCxV感染中起着关键作用。

C4蛋白的S-酰基化在体外和体内与棕榈酰转移酶（NbPAT4）相互作用。为了研究TYLCCxV C4是否与N. benthamiana中的棕榈酰转移酶相互作用，我们使用酵母裂解泛素测定法（Yeast Split-ubiquitin assay）筛选了四种棕榈酰转移酶（NbPAT1、NbPAT2、NbPAT4、NbPAT6）。将这些候选酶克隆到pPR3-N载体中，并将TYLCCxV C4引入pDHB1载体中。然后将这两种构建体共同转化到酵母菌株NMY51中。使用pPR3-N-p53/pDHB1-largeT组合和空的pPR3-N/pDHB1-largeT建立了阳性和阴性对照。结果显示，携带pPR3-N-NbPAT4或pPR3-N-NbPAT6和pDHB1-C4的酵母菌株在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上生长正常（见图3A）。鉴于它们的功能冗余性，我们选择了NbPAT4在转基因H2B-RFP N. benthamiana叶片中进行了双分子荧光互补（BiFC）分析。将TYLCCxV C4和NbPAT4分别与黄色荧光蛋白（YFP）的N端或C端片段融合，生成了2YN-C4和2YC-NbPAT4构建体。共聚焦显微镜显示YFP荧光主要位于细胞膜上，而细胞核中的荧光非常微弱（见图3B），表明TYLCCxV C4在体内与NbPAT4发生相互作用。为了进一步确认这种相互作用，我们在共渗透了NbPAT4-Flag和C4-GFP或GFP的N. benthamiana叶片中进行了共免疫沉淀（Co-IP）分析。使用GFP mAb磁珠进行免疫沉淀后，再用anti-GFP或anti-Flag抗体进行Western blot分析，结果显示NbPAT4-Flag与C4-GFP有特定的相互作用（见图3C）。这些结果表明TYLCCxV C4在体外和体内都与NbPAT4直接相互作用。

C4与NbPAT4的相互作用在体外和体内都有体现。A. 使用酵母裂解泛素测定法分析了TYLCCxV C4与四种棕榈酰转移酶（NbPAT1-2、NbPAT4、NbPAT6）之间的相互作用。将表达相应质粒的酵母菌株NMY51进行十倍系列稀释并在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上培养。携带pPR3-N-p53/pDHB1-largeT组合的菌株作为阳性对照，而携带空pPR3-N/PDHB1-largeT的菌株作为阴性对照。B. BiFC分析显示C4与NbPAT4之间的相互作用。将转基因H2B-RFP N. benthamiana植物分别与2YN-C4和2YC-NbPAT4、2YN-C4、2YC或2YN和2YC-NbPAT4共渗透。H2B被用作细胞核标记。从上到下的列分别代表YFP、RFP和合并信号。比例尺为20微米。C. 通过Co-IP测定分析TYLCCxV C4与NbPAT4之间的相互作用。将NbPAT4-Flag与C4-GFP或GFP共渗透到N. benthamiana叶片中。总蛋白质提取物与anti-GFP mAb磁珠共沉淀后，使用anti-GFP或anti-Flag抗体进行Western blot分析。

NbPAT4的参与促进了TYLCCxV的感染，并参与了C4的S-酰基化过程。为了研究NbPAT4在病毒感染中的生物学作用，我们用TYLCCxV感染了转基因N. benthamiana植物。这些植物包括了NbPAT4敲除（Nbpat4）和过表达（OE-NbPAT4）的品系。在15天时，Nbpat4植物表现出轻微的叶片向上卷曲，而野生型（WT）植物表现出严重的叶片卷曲。在30天时，WT植物表现出明显的叶片向上卷曲，而Nbpat4植物的症状较轻（见图4A）。Southern blot分析显示，Nbpat4植物在15和30天时的病毒基因组DNA水平低于WT植物（见图4B）。相比之下，OE-NbPAT4植物在15和30天时表现出更严重的症状，包括更明显的叶片向上卷曲、叶脉肿胀和叶片聚集（见图4C）。此外，Southern blot分析显示OE-NbPAT4植物中的病毒基因组DNA水平高于WT植物（见图4D）。这些结果表明NbPAT4增强了TYLCCxV在N. benthamiana中的感染。

NbPAT4调节TYLCCxV感染，并参与了C4的S-酰基化过程。A. 在15/30天时，野生型（WT）和转基因Nbpat4（A）或OE-NbPAT4（C）的N. benthamiana植物中由TYLCCxV引起的症状。比例尺为2厘米。B和D. 在15/30天时，对A面板（B）或C面板（D）中农杆菌渗透叶片中的TYLCCxV DNA积累情况进行Southern blot分析。Southern blot使用了来自三株幼苗的总基因组DNA（每个泳道10微克），并与TYLCCxV的CP探针杂交。图中标记的“Palmitoylation”表示C4-GFP在NeutrAvidin磁珠上的回收量，表明了C4的S-酰基化程度。Hyd表示羟胺处理。C4的S-酰化水平和蛋白质积累是使用Image J 1.8.0计算的，野生型植物中经过Hyd处理的C4的数据被设定为1.00。图e中显示的C4的S-酰化水平是使用GraphPad Prism 8量化的。野生型N. benthamiana植物中C4的S-酰化水平被设定为1.0。数据以三次生物学重复实验的平均值和标准差表示。两个星号通过Student’s t检验标记在p<0.01时两种处理之间的显著差异。为了进一步探讨NbPAT4是否参与TYLCCxV C4蛋白的S-酰化，我们使用生物素切换实验测量了C4-GFP渗透的WT、Nbpat4和OE-NbPAT4植物中C4蛋白的S-酰化水平。如图4E所示，无论是否经过Hyd处理，WT、Nbpat4和OE-NbPAT4植物的输入样本中都检测到了相似水平的C4-GFP。重要的是，只有在Hyd处理后观察到S-酰化，这证实了C4会发生S-酰化。Nbpat4植物中C4蛋白的S-酰化水平约为0.51（相比之下WT植物为1.00），而在OE-NbPAT4植物中，这一水平增加到了1.92。这些结果通过三次独立的生物学重复实验得到验证，并使用GraphPad Prism 8进行了统计分析（图4F）。这些数据共同表明，作为棕榈酰转移酶的NbPAT4直接参与了C4的S-酰化。

TYLCCxV C4在体外和体内与去酰化酶NbABHD6相互作用。蛋白质的棕榈酰化是一种可逆的脂质修饰过程，涉及棕榈酰化和去棕榈酰化两个步骤，这两个步骤分别由棕榈酰转移酶和去棕榈酰化酶介导。为了识别与TYLCCxV C4相互作用的去棕榈酰化酶，我们从N. benthamiana cDNA文库中扩增了19种去酰化酶，包括NbAPT1-4和NbABHD1-15（补充表S1）。然后这些酶被融合到pPR3-N载体上，用于酵母分裂-泛素化实验（Yeast Split-ubiquitin assay）。阳性对照和阴性对照分别包含携带pPR3-N-p53/pDHB1-largeT和空pPR3-N/pDHB1-largeT或C4的菌株。实验结果显示，携带pPR3-N-NbABHD6/pDHB1-C4的菌株生长旺盛，与阳性对照相似，而其他菌株则无法生长（图5A, B）。

C4与NbABHD6在体外和体内的相互作用以及NbABHD6的示意图。通过酵母分裂-泛素化实验（Yeast Split-ubiquitin assay）筛选与TYLCCxV C4相互作用的去酰化酶。分别使用携带pPR3-N-p53/pDHB1-largeT和空pPR3-N/pDHB1-C4或largeT的组合作为阳性对照和阴性对照。B 使用BiFC测定TYLCCxV C4与NbABHD6的相互作用。转基因H2B-RFP N. benthamiana植物分别与2YN-C4和2YC-NbABHD6、2YN-C4和2YC或2YN和2YC-NbABHD6共渗。刻度尺，20 μm。D 共免疫沉淀（Co-IP）实验显示TYLCCxV C4与NbABHD6的相互作用。N. benthamiana叶片分别与C4-Flag和NbABHD6-GFP或GFP共渗，然后蛋白提取物与抗GFP mAb-磁珠孵育。输入样本和共免疫沉淀的蛋白通过抗GFP或抗Flag抗体进行免疫印迹（immunoblot）检测。E NbABHD6蛋白结构的示意图。ABHD：α/beta水解酶结构域。数字表示NbABHD6蛋白的氨基酸位置。参与NbABHD6催化作用的三个残基（S147、D212和H241）用黑点标出。

我们进一步使用BiFC测定验证了这种相互作用。在这个实验中，2YN-C4和2YC-NbABHD6（其中NbABHD6与2YC融合）在转基因H2B-RFP N. benthamiana中共同表达。共聚焦荧光成像显示，在共同表达2YN-C4和2YC-NbABHD6的细胞胞质中检测到了强烈的YFP荧光信号，而在阴性对照中没有检测到荧光（图5C）。通过体内共免疫沉淀（Co-IP）也获得了类似的结果。N. benthamiana叶片分别与C4-Flag和NbABHD6-GFP或GFP（作为阴性对照）共表达。共免疫沉淀产物使用抗GFP和抗Flag抗体进行Western blot分析。在输入样本中均检测到了NbABHD6-GFP、GFP和C4-Flag。重要的是，C4-Flag仅被NbABHD6-GFP特异性共免疫沉淀，而不会被GFP单独沉淀（图5D）。这些发现证实了TYLCCxV C4与NbABHD6在体外和体内的直接特异性相互作用。

哺乳动物的ABHD17家族包含一个保守的α/beta水解酶结构域（ABHD），其催化三联体由丝氨酸（S）、天冬氨酸（D）和组氨酸（H）残基组成。这个三联体对其去酰化活性至关重要（Yokoi等人，2016年）。使用InterPro网站（https://www.ebi.ac.uk/interpro）进行的结构分析显示，NbABHD6蛋白由274个氨基酸组成，并包含一个典型的ABHD区域。我们使用Mega 7.0软件对大鼠、N. benthamiana和拟南芥的ABHDs氨基酸序列进行了比对。比对结果显示，这些ABHD17家族蛋白共享高度保守的催化三联体残基。对于NbABHD6，催化三联体由S147、D212和H241组成（图5E, S2），表明NbABHD6可能遵循与其同源物相似的反应机制。

NbABHD6干扰TYLCCxV C4的去棕榈酰化。为了评估去酰化酶NbABHD6是否参与C4的去棕榈酰化，我们在N. benthamiana叶片的不同半部分暂时共表达了C4-Flag与NbABHD6-GFP或GFP（作为对照）。之后，我们进行了生物素切换实验。结果显示，与NbABHD6-GFP或GFP共表达的C4-Flag在输入蛋白样本中的积累水平相似（1.00, 0.98, 1.00, 0.97）。仅在Hyd处理后检测到C4-Flag，表明C4蛋白发生了S-酰化。当将C4-Flag与NbABHD6-GFP共表达时的S-酰化水平与对照组（1.00）比较时，S-酰化水平显著降低至0.59或0.56（图6A）。GraphPad Prism 8分析证实了这些发现，显示与NbABHD6共表达时C4的S-酰化显著受到抑制（图6B）。这些结果表明NbABHD6促进了TYLCCxV C4的去棕榈酰化。

NbABHD6介导TYLCCxV C4的去棕榈酰化。通过生物素切换实验（biotin-switch assay）检测N. benthamiana叶片中C4蛋白的S-酰化水平，这些叶片共表达了C4-Flag与NbABHD6-GFP或GFP。C4的S-酰化水平使用Image J 1.8.0计算，C4-Flag与GFP处理的数据被设定为1.00。标记为“Palmitoylation”的泳道显示从NeutrAvidin珠中回收的C4-Flag水平，表示其发生了棕榈酰化。B 使用GraphPad Prism 8分析图A中显示的C4的S-酰化水平。C4-Flag和GFP处理的数据被设定为1.0。数据以三次生物学重复实验的平均值和标准差表示。两个星号通过Student’s t检验标记在p<0.1时两种处理之间的差异。

NbABHD6介导的去棕榈酰化通过26S蛋白酶体途径促进TYLCCxV C4蛋白的降解。为了确定NbABHD6是否影响C4蛋白的积累，我们在N. benthamiana叶片的不同半部分共表达了C4-Flag与NbABHD6-GFP或GFP。在48小时后在抗Flag或抗GFP抗体作用下通过免疫印迹（immunoblotting）分析蛋白质水平。如图7A所示，共表达C4-Flag和NbABHD6-GFP的植物中C4蛋白的积累减少至0.50或0.48，而共表达C4-Flag和GFP的植物中C4蛋白的积累为1.00。半定量RT-PCR确认这种差异不是由于转录减少，因为各处理组中的C4 mRNA水平相似。GraphPad Prism 8分析进一步验证了这些发现（图7B），进一步证实了NbABHD6在减少C4积累中的作用。

NbABHD6通过26S蛋白酶体途径增强TYLCCxV C4蛋白的降解。西方印迹（Western blot）分析和半定量RT-PCR测定在共表达C4-Flag与NbABHD6-GFP的N. benthamiana叶片中TYLCCxV C4蛋白和mRNA的水平。样品通过抗Flag或抗GFP抗体进行免疫印迹（immunoblot）检测。C4-Flag的蛋白积累使用Image J 1.8.0计算，C4与GFP共表达的数据被设定为1.00。Ponceau red染色用于加载对照。C4的转录水平通过半定量RT-PCR确定。肌动蛋白（Actin）被用作参考基因。B 使用GraphPad Prism 8分析图a中显示的C4蛋白积累。C4-Flag和GFP处理的数据被设定为1.0。数据以三次生物学重复实验的平均值和标准差表示。两个星号通过Student’s t检验标记在p<0.01时两种处理之间的差异。C和D 通过生物素切换实验（biotin switch assay）和西方印迹（Western blot analysis）检测的C4蛋白的S-酰化水平（C）和积累水平（D）。N. benthamiana分别与C4-Flag和GFP、NbABHD6（mSDH）-GFP或NbABHD6-GFP共渗。蛋白提取物使用抗Flag或抗GFP抗体进行Western blot分析。C4的S-酰化和积累水平使用Image J 1.8.0计算，C4与GFP共表达的数据被设定为1.00。标记为“Palmitoylation”的泳道显示从NeutrAvidin珠中回收的C4-Flag水平，表示其发生了棕榈酰化。E 使用酵母分裂-泛素化实验（Yeast Split-ubiquitin assay）分析NbABHD6（mSDH）与C4的相互作用。F 使用蛋白酶抑制剂MG132、E64d或3MA进行C4的半体内降解抑制分析。短暂表达C4-Flag的N. benthamiana叶片分别用100 μM CHX和100 μM MG132、100 μM E64d、5 μM E64d或DMSO处理。C4的相对积累水平使用Image J 1.8.0计算，C4在DMSO处理中的数据被设定为1.00。G 通过Western blot分析C4在体内的稳定性。短暂表达C4-Flag与NbABHD6-GFP的N. benthamiana叶片分别用100 μM MG132或DMSO处理。C4的表达量使用Image J 1.8.0计算，C4与GFP共表达在DMSO处理中的数据被设定为1.00。H 通过Western blot分析C4的蛋白积累。N. benthamiana分别与C4-Flag和GFP、NbABHD6（mSDH）-GFP或NbABHD6-GFP共表达，并分别用100 μM MG132处理。C4的积累水平使用Image J 1.8.0计算，C4与GFP共表达在DMSO处理中的数据被设定为1.00。

我们的生物信息学分析表明S147、D212和H241构成了NbABHD6的催化三联体（图5E）。为了研究这些残基是否参与NbABHD6的去棕榈酰化活性，我们同时将S147、D212和H241替换为丙氨酸，生成了一个突变体NbABHD6（mSDH）。然后我们将C4-Flag与GFP、NbABHD6（mSDH）-GFP或NbABHD6-GFP共渗到N. benthamiana中。生物素切换实验确认了C4的S-酰化，因为Hyd处理后检测到了C4-Flag条带。与NbABHD6（mSDH）-GFP共表达的C4-Flag的S-酰化水平（0.98）与对照组（1.00）相似，而与NbABHD6-GFP共表达时S-酰化水平降低至0.61（图7C）。这些结果表明，NbABHD6（mSDH）缺乏降低C4 S-酰化水平的能力，与NbABHD6不同。Western印迹分析显示，在共表达C4-Flag与NbABHD6（mSDH）-GFP（1.03）和GFP（1.00）的植物中，C4-Flag蛋白的积累没有显著差异（图7D）。这些发现以及生物素切换实验共同表明，NbABHD6（mSDH）在S147、D212和H241位置的突变使其失去了去酰化活性，不再影响C4的S-酰化水平。因此，NbABHD6（mSDH）对C4蛋白积累没有影响。我们的数据进一步支持催化三联体——由S147、D212和H241组成——对NbABHD6的去棕榈酰化活性至关重要的结论。NbABHD6对C4积累的影响因此是通过其去棕榈酰化活性介导的。为了研究NbABHD6去棕榈酰化活性的丧失是否影响其与C4的相互作用，我们将NbABHD6（mSDH）融合到pPR3-N载体上。酵母分裂-泛素化实验（Yeast Split-ubiquitin assay）显示NbABHD6（mSDH）仍能与C4相互作用（图7E），表明NbABHD6的去棕榈酰化活性对其与C4的相互作用不是必需的。

植物中的蛋白质主要通过26S蛋白酶体或自噬途径降解。为了确定N. benthamiana中C4的降解途径，我们用这些途径的抑制剂处理表达C4-Flag的植物叶片。使用了26S蛋白酶体抑制剂MG132、自噬抑制剂E64d和3MA以及DMSO（作为对照）。叶片分别用100 μM cycloheximide（CHX）和100 μM MG132、100 μM E64d、5 μM 3MA或DMSO处理。Western印迹分析显示，MG132处理的叶片中C4的表达量更高（1.20），而DMSO处理的叶片中C4的表达量较低（1.00）。相比之下，经过E64d（1.02）、3MA（1.03）或DMSO（1.00）处理的叶片中C4的水平保持相似（图7F），这表明C4通过26S蛋白酶体途径降解。为了确定NbABHD6是否通过26S蛋白酶体途径促进C4的降解，我们将N. benthamiana植物与C4-Flag以及NbABHD6-GFP或GFP共同浸润，随后用100 μM MG132或DMSO处理。如图7G所示，Western blot分析显示，在GFP共表达对照组中，MG132处理过的植物中C4-Flag的水平（1.18）高于DMSO处理过的植物（1.00），这证实了MG132抑制了C4的降解，因此C4是通过26S蛋白酶体途径降解的。在DMSO处理的叶片中，共表达NbABHD6-GFP的植物中C4-Flag的积累减少到0.45，这证实了NbABHD6降低了C4蛋白的水平。相比之下，在MG132处理的叶片中，共表达NbABHD6-GFP的植物中C4-Flag的积累为0.74，显著高于DMSO处理组（0.45），表明NbABHD6通过26S蛋白酶体途径调节C4的降解。值得注意的是，即使蛋白酶体被抑制，共表达NbABHD6-GFP的MG132处理叶片中C4-Flag的积累（0.74）仍然低于GFP对照组（1.18）。这表明NbABHD6即使在蛋白酶体被抑制的情况下也能减少C4的积累，暗示了存在其他的调节机制——这与C4的多功能性是一致的。MG132处理组与DMSO处理组中C4-Flag的积累比例为1.64（0.74/0.45），而在GFP对照组中这一比例为1.18（1.18/1.00），进一步支持NbABHD6介导的去棕榈酰化通过26S蛋白酶体途径促进C4降解。此外，图7H中的Western blot分析显示，在MG132存在的情况下，共表达NbABHD6（mSDH）-GFP的C4-Flag积累与对照组（1.00）相似，而与NbABHD6-GFP共表达时C4-Flag的积累减少到0.65。这些发现表明NbABHD6，而非NbABHD6（mSDH），通过26S蛋白酶体途径促进C4的降解，这一效应是由其去棕榈酰化活性介导的。

讨论
我们之前的研究表明，TYLCCxV的C4作为一种症状决定因子，在PVX中异源表达时会引发叶片向上卷曲和茎部伸长（Xie等人，2024年）。然而，C4与宿主因子之间的具体相互作用机制仍不清楚。在这项研究中，我们发现C4主要通过Cys-4位置的S-酰基化定位于质膜上（补充图S1，图1A-E）。进一步的研究表明，C4的S-酰基化调节了其亚细胞定位和蛋白质稳定性（图1A，B，F-H），这与已知S-棕榈酰化在调节调节蛋白的膜结合和稳定性中的作用一致（Linder和Deschenes，2007年）。然而，C4的S-酰基化的生物学功能仍不清楚。我们的研究结果表明，PVX::C4C4S感染的植物没有表现出病毒症状，而接种了TYLCCxV（C4C4S）的N. benthamiana叶片表现出的病毒症状较轻，病毒积累也低于野生型TYLCCxV感染的植物（图2）。这些结果表明，C4的S-酰基化与病原性有关，并提出了这种翻译后修饰是如何通过酶促方式调节的问题。接下来，我们鉴定出NbPAT4是一种与C4相互作用的蛋白质（图3）。功能分析显示，NbPAT4影响TYLCCxV的病原性：在NbPAT4敲低植物中，病毒症状和积累减少，而在NbPAT4过表达（OE-NbPAT4）中，病毒病原性增强（图4A-D）。重要的是，Nbpat4植物中C4的S-酰基化水平降低，而在OE-NbPAT4植物中S-棕榈酰化水平升高（图4E，F），这表明NbPAT4通过酶促方式调节C4的S-酰基化。然而，由于当前的技术限制，尚未直接通过生化方法验证PAT4介导的催化作用（例如，通过体外酰基转移酶测定）。

C4是一种多功能病毒蛋白，已经进化出复杂的机制来抑制植物的免疫反应。先前的研究表明，C4通过膜相关相互作用破坏宿主的油菜素内酯（BR）信号通路，从而促进病毒感染。例如，甜菜卷曲顶病毒（BCTV）的C4蛋白会经历N-肉豆蔻酰化，使其锚定在质膜上。在那里，它与几个阿拉伯芥菜Shaggy样激酶（AtSKs）相互作用，促进其磷酸化和激活，最终破坏宿主细胞周期的调控（Mills-Lujan等人，2015年）。同样，甘薯叶卷曲病毒-江苏株（SPLCV-JS）的C4蛋白在质膜上与油菜素内酯不敏感2（AtBIN2）结合。这种相互作用触发AtBIN2相互作用的转录因子AtBES1和AtBZR1的核内重新定位，改变BR响应基因的表达并激活BR信号通路（Bi等人，2017年）。除了靶向BR通路外，TYLCV、BCTV和东非木薯花叶病毒（EACMV）的C4蛋白在人工诱导的模式触发免疫时从质膜重新定位到叶绿体中。这种重新定位干扰了水杨酸（SA）介导的防御反应（Medina-Puche等人，2020年）。此外，棉花叶卷曲Multan病毒（CLCuMuV）的C4蛋白与真核生物翻译起始因子eIF4A结合，后者是自噬的负调控因子。通过增强eIF4A与自噬相关蛋白5（ATG5）之间的相互作用，C4抑制自噬通路并促进病毒感染（Yang等人，2023年）。在我们的研究中，我们发现TYLCCxV的C4特异性地与棕榈酰转移酶NbPAT4相互作用。然而，C4利用宿主S-酰基化机制的分子机制——以及S-酰基化的C4是否与其他宿主因子（例如，BAM1、SnRK1、eIF4A、SKη激酶）相互作用以抑制植物多层的免疫反应——仍不清楚，需要进一步研究。

迄今为止，植物-病原体相互作用中脱棕榈酰化的酶促调节在很大程度上尚未被研究，而且除了拟南芥（A. thaliana）之外，尚未在植物物种中鉴定出ABHD17家族的功能同源物。最近，有研究表明拟南芥中的ABAPT3介导BSCTV的C4蛋白的去棕榈酰化（Zhao等人，2024年）。在我们的研究中，我们鉴定出N. benthamiana中的去S-酰基化酶NbABHD6作为TYLCCxV的C4相互作用因子（图5A-D）。我们进一步证明，NbABHD6介导的去棕榈酰化降低了C4的S-酰基化水平（图6A，B）。总之，我们的发现揭示了C4蛋白通过两种宿主酶的动态S-酰基化调节。棕榈酰转移酶NbPAT4通过S-棕榈酰化促进C4在膜上的锚定，而NbABHD6催化其去棕榈酰化，突显了这种翻译后修饰的可逆性。

先前的研究表明，S-酰基化在各种系统中影响蛋白质的稳定性和积累，包括SNARE（可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体）复合体和炭疽毒素受体（Linder和Deschenes，2007年）。更 recent的研究表明，植物免疫受体激酶FLS2的S-棕榈酰化稳定了其与共受体BAK1（BRI1相关受体激酶1）在质膜上的相互作用，从而阻止FLS2进入内吞途径（Hurst等人，2023年）。在我们的研究中，我们观察到NbABHD6的共同浸润减少了C4蛋白的积累（图7A，B），表明NbABHD6负调控C4的水平。然而，这种减少是否依赖于NbABHD6的去棕榈酰化活性尚不清楚。已知ABHD17家族的成员依赖于一个催化三联体——包括丝氨酸（S）、天冬氨酸（D）和组氨酸（H）——来进行去棕榈酰化（Yokoi等人，2016年）。在拟南芥中，ABAPT8包含三个保守的催化残基（S147、D212和H241），而这些残基被丙氨酸替换的催化突变体ABAPT8（mSHD）失去了影响免疫相关蛋白RIN4的S-酰基化的能力（Liu等人，2021年）。与此机制一致，我们的生物信息学分析在NbABHD6中鉴定了相同的催化三联体（S147、D212和H241）（图5E），表明ABHD6同源物之间具有保守的酶促功能。我们进一步证明NbABHD6通过其去棕榈酰化活性调节C4的积累。当与GFP或催化失活的NbABHD6突变体（mSDH）-GFP共表达时，C4的S-酰基化水平和蛋白积累保持不变（图7C，D）。体内降解抑制实验表明，C4通过26S蛋白酶体进行蛋白酶体降解（图7F）。此外，NbABHD6介导的去棕榈酰化通过泛素-蛋白酶体系统促进C4的周转（图7G，H），从而调节其蛋白的丰度。

研究人员通常通过评估S-酰基化水平和亚细胞定位来评估蛋白质的S-酰基化（Liu等人，2021年）。在我们的研究中，我们发现NbABHD6并未显著改变C4在质膜上的定位（数据未显示），可能是因为C4的第二个氨基酸位置有一个肉豆蔻酰化位点（补充图S1A）。此外，S-酰基化缺陷突变体C4C4S（图1E）仍部分定位于质膜上（图1A-B），表明C4的膜结合也由其他修饰（如肉豆蔻酰化）介导。这些观察结果表明，仅凭亚细胞定位不能可靠地反映C4的S-酰基化状态。因此，我们使用生物素切换实验直接评估NbABHD6调节的C4的S-酰基化水平。为了全面验证C4的S-酰基化状态，我们结合了多种互补方法，包括生物信息学预测、亚细胞定位分析、生物素切换实验和质谱分析。

S-棕榈酰化可能与其他翻译后修饰（包括磷酸化、泛素化和S-硝基化）协同作用。例如，PD-L1（程序性死亡配体1）在半胱氨酸272位置的S-酰基化抑制了其泛素化并防止其向多囊体的转运（Yang等人，2019年；Yao等人，2019年）。在拟南芥中，免疫受体P2K1磷酸化棕榈酰转移酶PAT5和PAT9，增强它们对P2K1本身的S-酰基转移活性并减弱免疫信号（Chen等人，2021年）。某些修饰，如S-硝基化和氧化，与S-棕榈酰化竞争半胱氨酸残基（Lennicke和Cochemé，2021年）。S-硝基化和S-酰基化之间的相互作用影响突触后密度蛋白的转运和定位，破坏突触网络（Zareba-Koziol等人，2019年）。此外，棉花叶卷曲Multan病毒（CLCuMuV）的C4蛋白与真核生物翻译起始因子eIF4A结合，后者是自噬的负调控因子。通过增强eIF4A与自噬相关蛋白5（ATG5）之间的相互作用，C4抑制自噬通路并促进病毒感染（Yang等人，2023年）。在我们的研究中，我们发现TYLCCxV的C4特异性地与棕榈酰转移酶NbPAT4相互作用。然而，C4利用宿主S-酰基化机制的分子机制——以及S-酰基化的C4是否与其他宿主因子（如BAM1、SnRK1、eIF4A、SKη激酶）相互作用以抑制多层的植物免疫反应——仍不清楚，需要进一步研究。

到目前为止，植物-病原体相互作用中脱棕榈酰化的酶促调节在很大程度上尚未被研究，而且在拟南芥以外的植物物种中尚未鉴定出ABHD17家族的功能同源物。最近，有研究报告称拟南芥中的ABAPT3介导BSCTV的C4蛋白的去棕榈酰化（Zhao等人，2024年）。在我们的研究中，我们鉴定出N. benthamiana中的去S-酰基化酶NbABHD6作为TYLCCxV的C4相互作用因子（图5A-D）。我们进一步证明，NbABHD6介导的去棕榈酰化降低了C4的S-酰基化水平（图6A，B）。总之，我们的发现揭示了C4蛋白通过两种宿主酶的动态S-酰基化调节。棕榈酰转移酶NbPAT4通过S-棕榈酰化促进C4在膜上的锚定，而NbABHD6催化其去棕榈酰化，突显了这种翻译后修饰的可逆性。

先前的研究表明，S-酰基化在各种系统中影响蛋白质的稳定性和积累，包括SNARE（可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体）复合体和炭疽毒素受体（Linder和Deschenes，2007年）。更 recent的研究表明，植物免疫受体激酶FLS2的S-棕榈酰化稳定了其与共受体BAK1（BRI1相关受体激酶1）在质膜上的相互作用，从而阻止FLS2进入内吞途径（Hurst等人，2023年）。在我们的研究中，我们观察到NbABHD6的共同浸润减少了C4蛋白的积累（图7A，B），表明NbABHD6负调控C4的水平。然而，这种减少是否依赖于NbABHD6的去棕榈酰化活性尚不清楚。已知ABHD17家族的成员依赖于一个催化三联体——包括丝氨酸（S）、天冬氨酸（D）和组氨酸（H）——来进行去棕榈酰化（Yokoi等人，2016年）。在拟南芥中，ABAPT8包含三个保守的催化残基（S147、D212和H241），而这些残基被丙氨酸替换的催化突变体ABAPT8（mSHD）失去了影响免疫相关蛋白RIN4的S-酰基化的能力（Liu等人，2021年）。与此机制一致，我们的生物信息学分析在NbABHD6中也鉴定出了相同的催化三联体（S147、D212和H241）（图5E），表明ABHD6同源物之间具有保守的酶促功能。我们进一步证明NbABHD6通过其去棕榈酰化活性调节C4的积累。当与GFP或催化失活的NbABHD6突变体（mSDH）-GFP共表达时，C4的S-酰基化水平和蛋白积累保持不变（图7C，D）。体内降解抑制实验表明，C4通过26S蛋白酶体进行蛋白酶体降解（图7F）。此外，NbABHD6介导的去棕榈酰化通过泛素-蛋白酶体系统促进C4的周转（图7G，H），从而调节其蛋白的丰度。

研究人员通常通过评估S-酰基化水平和亚细胞定位来评估蛋白质的S-酰基化（Liu等人，2021年）。在我们的研究中，我们发现NbABHD6并未显著改变C4在质膜上的定位（数据未显示），可能是因为C4的第二个氨基酸位置有一个肉豆蔻酰化位点（补充图S1A）。此外，S-酰基化缺陷突变体C4C4S（图1E）仍部分定位于质膜上（图1A-B），表明C4的膜结合也由其他修饰（如肉豆蔻酰化）介导。这些观察结果表明，仅凭亚细胞定位不能可靠地反映C4的S-酰基化状态。因此，我们使用生物素切换实验直接评估NbABHD6调节的C4的S-酰基化水平。为了全面验证C4的S-酰基化状态，我们结合了几种互补方法，包括生物信息学预测、亚细胞定位分析、生物素切换实验和质谱分析。

S-棕榈酰化可能与其他翻译后修饰（包括磷酸化、泛素化和S-硝基化）协同作用。例如，PD-L1（程序性死亡配体1）在半胱氨酸272位置的S-酰基化抑制了其泛素化，并防止其向多囊体的转运（Yang等人，2019年；Yao等人，2019年）。在拟南芥中，免疫受体P2K1磷酸化棕榈酰转移酶PAT5和PAT9，增强它们对P2K1本身的S-酰基转移活性并减弱免疫信号（Chen等人，2021年）。某些修饰，如S-硝基化和氧化，与S-棕榈酰化竞争半胱氨酸残基（Lennicke和Cochemé，2021年）。S-硝基化和S-酰基化之间的相互作用影响突触后密度蛋白的转运和定位，破坏突触网络（Zareba-Koziol等人，2019年）。此外，S-酰基化在植物防御通路中起核心作用。在拟南芥中，PAT13和PAT16对R5L1（抗假单胞菌5样1）的S-酰基化对于R5L1在膜上的定位和免疫反应的激活至关重要（Gao等人，2022年）。SA通过ABAPT棕榈酰酰基转移酶 NbPAT4 催化 C4 的棕榈酰化反应，促进其积累并定位于质膜上，从而增强病毒感染。相反，去棕榈酰化酶 NbABHD6 介导 C4 的去棕榈酰化，使其通过 26S 蛋白酶体途径降解。这种动态的棕榈酰化-去棕榈酰化循环揭示了双生病毒与宿主防御机制之间一个先前未被认识的调控层。基于这些发现，我们提出了一个以 S-棕榈酰化循环为中心的植物-双生病毒相互作用新模型。这一循环体现了 AIB（RNA 诱导的细胞死亡）的概念，并支持了一种宿主-病原体酶学拔河模型，在该模型中，病毒（通过 NbPAT4）和宿主（通过 NbABHD6）竞争对 C4 稳定性的控制。这种酶学冲突推动了双生病毒与植物共同进化的动态平衡。

**材料与方法**

**植物材料及生长条件**
表达核标记 H2B-RFP（全长的红色荧光蛋白与组蛋白 2B 的 C 端融合）的转基因 Nicotiana benthamiana 植物由 Michael M. Goodin 博士（美国肯塔基大学）提供（Martin 等人，2009 年）。通过使用二元载体 BGK01-NbPAT4 和 pCAMBIA-NbPAT4（中国武汉，Biorun）进行转化，获得了 NbPAT4 基因敲除（Nbpat4）和过表达（OE-NbPAT4）的 N. benthamiana 植物。使用 CRISPR-P 工具 V2.0（http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）设计了针对 NbPAT4 开放阅读框的单导向 RNA，并在补充表 S2 中列出。T2 纯合子转基因植物在接种病毒前被确认为阳性。植物在无虫害的生长培养箱中以 25°C 的温度培养，光照周期为 16 小时/8 小时。

**质粒构建**
NbPAT4 分别克隆到 pPR3-N、p2YC 和 pCambia-2 × 35S-3 × Flag 载体中。NbABHD6 分别克隆到 pPR3-N、p2YC 和 pCambia-2 × 35S-GFP 载体中，NbABHD6 (mSDH) 突变体克隆到 pPR3-N 和 pCambia-2 × 35S-GFP 载体中。NbPAT1-2、NbPAT6、NbAPT1-4 和 NbABHD1-15 克隆到 pPR3-N 载体中。TYLCCxV C4 分别克隆到 pDHB1、p2YN、pCambia-2 × 35S-GFP、pCambia-2 × 35S-3 × Flag 和 PVX 载体 pGR106 中。C4 (C4S) 突变体克隆到 pGR106、pCambia-2 × 35S-GFP 和 pCambia-2 × 35S-3 × Flag 中。所有片段均使用 KOD One? PCR Master Mix（中国上海，Toyobo）进行 PCR 扩增。通过 MonClone? Single Assembly Cloning Mix（中国苏州，Monad）进行同源重组后插入载体，并通过 DNA 测序验证。NbABHD6 (mSDH) 突变体是根据 Tao 等人（2002 年）的方法通过重叠 PCR 生成的。用于质粒构建的所有引物列在补充表 S2 中。

**感染性克隆的构建**
TYLCCxV 的感染性克隆（pBinPLUS-TYLCCxV-1.4A）和质粒 pLB-TYLCCxV-1A 已在先前的研究中描述过（Xie 等人，2024 年）。通过同源重组在 C4 中引入 C4S 突变，生成了突变体 pLB-TYLCCxV (C4C4S)?1A（中国苏州，Monad）。测序后，将 pLB-TYLCCxV (C4C4S)?1A 的 KpnI-ClaI 片段（包括基因间区域）克隆到二元载体 pBinPLUS 中，得到 pBinPLUS-TYLCCxV (C4C4S)?0.4A。将 pLB-TYLCCxV (C4C4S)?1A 的全长 KpnI 切片插入 pBinPLUS-TYLCCxV (C4C4S)?0.4A 的独特 KpnI 位点，生成 pBinPLUS-TYLCCxV (C4C4S)?1.4A。然后将此构建物转入 Agrobacterium tumefaciens 菌株 EH105 中，以创建突变病毒 TYLCCxV (C4C4S) 的感染性克隆。

**病毒接种及农杆菌浸灌**
对于双生病毒的农杆菌浸灌，携带 TYLCCxV 或 TYLCCxV (C4C4S) 感染性克隆的 Agrobacterium 菌株在 N. benthamiana 植物 5-6 叶期进行浸灌。用空 pBinPLUS 载体浸灌的植物作为对照组。对于 PVX 实验，将重组 PVX::C4 和 PVX::C4C4S 构建物通过电穿孔导入 A. tumefaciens 菌株 GV3101 中。使用空 PVX 载体 pGR106（PVX）作为阴性对照。浸灌前，将每种 Agrobacterium 菌株的光密度（OD600）调整至 0.8–1.0。每组处理浸灌 12 株幼苗，实验重复三次。

**其他实验方法**

**酵母裂解泛素测定**
酵母转化实验在 NMY51 细胞中根据 DUALhunter Starter Kit（中国大连，Takara）进行。转化体在合成培养基（SD-Trp/-Leu）中 30°C 下培养 72 小时。随后将培养物转移至选择性培养基（SD-Trp/-Leu/-His/-Ade）中评估结合活性，实验重复三次。

**BiFC 测定**
BiFC 测定按照 Li 等人（2020 年）的方法进行。2YN-C4 和 2YC-NbPAT4 或 2YC-NbABHD6 共同浸灌到 5-6 叶期的转基因 H2B-RFP N. benthamiana 叶片中。48 小时后，在 1–2 cm2 的叶片外皮细胞中使用 Zeiss LSM780 激光共聚焦显微镜（德国 Oberkochen，Zeiss）进行观察。实验重复三次。

**共免疫沉淀测定**
共浸灌了 C4-GFP 和 NbPAT4-Flag 或 C4-Flag 与 NbABHD6-GFP 的 N. benthamiana 叶片在 48 小时时收获。叶片在 1 mL IP 缓冲液（50 mM Tris–HCl、150 mM NaCl、10 mM MgCl?、5 mM DTT 和 0.1% Triton X-100）中研磨，然后在 4°C 下 8,000 g 离心 15 分钟。免疫沉淀使用 anti-GFP mAb 磁珠（中国北京，MBL）进行，方法如 Mei 等人（2018 年）所述。实验重复三次。

**亚细胞定位及分级**
转基因 H2B-RFP N. benthamiana 植物共浸灌了 C4-GFP、C4C4S-GFP 或 GFP。48 小时时使用 Zeiss LSM780 激光共聚焦显微镜（德国 Oberkochen，Zeiss）捕获荧光信号。48 小时后，将浸灌的 N. benthamiana 叶片在匀浆缓冲液（50 mM Tris–HCl，pH 8.0、10 mM KCl、3 mM MgCl?、1 mM EDTA、1 mM DTT、0.1% BSA 和 13% [w/v] 蔗糖）中研磨。蛋白质样品在 4°C 下 3,000 g 离心 20 分钟以去除细胞核和大颗粒。上清液在 4°C 下 30,000 g 离心 1 小时，分离可溶性（S30）和沉淀（P30）组分。所有组分按照 Mei 等人（2018 年）的方法进行 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。GFP 和 PIP2A-DsRed（质膜内在蛋白 2A，其 C 端融合了完整的 DsRed）分别作为可溶性和膜富集组分的标记。实验重复三次。

**LC–MS/MS 和生物素交换测定**
N. benthamiana 叶片共浸灌了 C4-Flag，然后使用 Q-Exactive LC–MS/MS（中国杭州，Jingjie）和 Q-Exactive HF 系统进行 SDS-PAGE 分析。C4 蛋白的 S-酰化测定按照 Hemsley 等人（2008 年）和 Yue 等人（2022 年）的方法进行。蛋白质提取物用羟胺（Hyd）处理以选择性切割硫键，然后与生物素-HPDP（Thermo Scientific，上海，中国）结合。蛋白质与中性亲和素-琼脂糖珠（Thermo Scientific）孵育，最终蛋白质样本使用抗 Flag 和抗 GFP 抗体进行 Western blot 分析，实验重复三次。

**RNA 提取、定量 RT-PCR (qRT-PCR) 和定量实时 PCR (qPCR)**
使用 TRIzol 试剂（中国大连，Takara）从 N. benthamiana 叶片中提取总 RNA，按照制造商说明操作。cDNA 使用 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix 和 gDNA Remover（日本大阪，Toyobo）合成。qPCR 使用 ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（中国南京，Vazyme）进行，表达水平以 Nbactin 为基准进行归一化。实验重复三次，实验中使用的具体引物列在补充表 S2 中。

**DNA 提取及 Southern blot 分析**
使用 cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) 方法提取总 DNA，并按照 Li 等人（2024 年）的方法进行 Southern blot 分析。变性中和后，DNA 样品转移到 Hybond N + nylon 膜（美国匹兹堡，GE Healthcare）上。通过与 TYLCCxV 衣壳蛋白地高辛标记探针杂交检测病毒基因组 DNA，使用 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II（德国 Mannheim，Roche Diagnostics）。

**蛋白质提取及 Western blot**
总蛋白质提取和 Western blot 按照 Porcellato 等人（2022 年）的方法进行。免疫印迹使用 Mouse anti-GFP-Tag 单克隆抗体（ABclonal，武汉，中国）、Mouse anti-Flag-Tag 单克隆抗体（ABclonal）和 HRP 结合的 Goat anti-Mouse 或 anti-Rabbit IgG 抗体（ImmunoWay，苏州，中国）进行。实验重复三次。

**化学处理**
N. benthamiana 叶片共浸灌了 C4-GFP，并分别用 500 μM 2-BP（棕榈酰化抑制剂，Aladdin，上海，中国）或 CH3OH 处理，以评估 2-BP 对亚细胞定位的影响。对于蛋白质降解实验，将 100 μM MG132（26S 蛋白酶体途径抑制剂，MCE，上海，中国）、100 μM E64d（MCE）、5 mM 3-MA（自噬途径抑制剂，MCE）或 DMSO 与 100 μM CHX（MCE）与 C4-Flag 共同浸灌到 N. benthamiana 叶片中。4 小时后按以前的方法（Li 等人，2024 年）收获样本。实验重复三次。