Rachiplusia nu（来自几内亚）虽然已经通过自然选择获得了对Bt转基因大豆的抗性，但仍然对基于Bt技术的生物农药敏感

《BioControl》：Rachiplusia nu (Guenée) with field-evolved resistance to Bt soybean is susceptible to Bt-based biopesticides

　　摘要：在巴西和阿根廷，发现Rachiplusia nu（Guenée）（鳞翅目：夜蛾科）对表达来自苏云金芽孢杆菌（Bt）的Cry1Ac毒素的大豆事件MON 87701 × MON 89788产生了田间进化抗性。鉴于这一情况，进行了 dietary-overlay 生物测定，以评估巴西R. nu种群对基于Bt的杀虫剂DiPel WP和XenTari WG的敏感性，并使用实验室筛选的R. nu菌株研究潜在的交叉抗性。此外，还使用叶生物测定来测试这些生物农药的田间剂量对田间收集的R. nu种群和实验室筛选菌株的有效性。DiPel WP和XenTari WG对R. nu田间种群的LC50值分别为0.03至0.09微克活性成分/平方厘米和0.46至0.60微克活性成分/平方厘米，表明其抗性比率≤4.0倍于敏感种群。Cry1Ac抗性和Cry1Ac敏感性的互交F1后代（杂合子）对DiPel WP和XenTari WG的敏感性相对相似（抗性比率≤5.3倍），表明存在低但可检测的交叉抗性。叶生物测定显示，田间剂量的DiPel WP和XenTari WG在所有种群和菌株中导致了超过95%的死亡率。这些结果表明，即使在对Cry1Ac大豆产生抗性后，巴西的R. nu种群仍然对DiPel WP和XenTari WG敏感，这突显了这些产品作为控制这种多食性害虫的有效工具。

引言：在巴西和阿根廷，向日葵尺蠖Rachiplusia nu（Guenée）（鳞翅目：夜蛾科）已经进化出对表达于转基因大豆事件MON 87701 × MON 89788中的苏云金芽孢杆菌Berliner（Bt）Cry1Ac毒素的抗性（Horikoshi等人，2021a；Hill等人，2023；Nardon等人，2021；Reis等人，2024）。在巴西，R. nu历史上是一种次要的大豆害虫，仅在该国中南部地区的大豆上造成低水平的侵害，而在阿根廷则多年来一直是主要的大豆害虫（Horikoshi等人，2021b；Decker-Franco等人，2023）。最近，R. nu已成为巴西的主要大豆害虫。该物种已在该国所有大豆生产区域出现，目前是Cry1Ac大豆田中发现的主要害虫之一，因为已经进化出实际的抗性（Godói等人，2025）。目前，巴西超过90%（约4200万公顷）的大豆种植面积使用了表达Cry1Ac的技术（Bueno等人，2025）。Bt植物目标害虫的抗性进化可能会降低它们对基于Bt的生物农药的敏感性。这一假设得到了植物中表达的Bt毒素与制剂中的Bt毒素之间可能存在交叉抗性的支持，因为这两种产品中的Bt毒素可以在目标害虫的中肠中共享相同的结合位点（Federici 1998；Ferré和van Rie 2002；Jakka等人，2014；Welch等人，2015）。相比之下，对于具有不同结合位点的Bt毒素，不预期存在交叉抗性（Sena等人，2009；Gouffon等人，2011；Souza等人，2019）。先前的研究报告称，对Bt玉米品种的抗性与Spodoptera frugiperda（J. E. Smith）对两种Bt产品DiPel WP和XenTari的显著交叉抗性无关（Jakka等人，2014；Welch等人，2015；Horikoshi等人，2019）。同样，对Cry1Ac毒素具有抗性的Helicoverpa zea（Boddie）对DiPel ES和Agree WG的交叉抗性也很低（Welch等人，2015）。R. nu对基于Bt的杀虫剂的潜在交叉抗性以及其对Cry1Ac大豆的抗性将限制控制选项，特别是对于有机农民和/或种植其他受R. nu侵害作物的农民。因此，评估R. nu对基于Bt的杀虫剂的敏感性以及Cry1Ac抗性是否影响制剂Bt杀虫剂的效果非常重要。因此，本研究的目标是：（1）评估四个巴西R. nu种群对基于Bt的杀虫剂DiPel WP和XenTari WG的敏感性；（2）研究R. nu中Bt含杀虫剂与Cry1Ac毒素之间的交叉抗性模式；（3）评估Bt杀虫剂对R. nu菌株和种群的控制效果。

材料与方法：
昆虫
为了评估对基于Bt的杀虫剂的敏感性，在2023年至2025年间从不同地理区域种植了表达Cry1Ac的转基因大豆田中收集了六个巴西R. nu种群（每个收集点500-1200只L3-L6阶段的幼虫），这些地区都记录有Cry1Ac大豆的抗性（表1，图1）。由于这些种群是从Cry1Ac大豆田中收集的，并且考虑到只有纯合抗性幼虫才能在Cry1Ac大豆叶片上发育并达到成虫阶段（Reis等人，2024），可以合理假设它们主要由携带Cry1Ac毒素抗性的个体组成。收集后，R. nu幼虫被运送到实验室，并在含有Greene等人（1976）描述的人工饲料的50毫升塑料杯中饲养至蛹期。除了这些田间种群外，还纳入了一个敏感的R. nu种群（Rnu-S）。Rnu-S种群于2022年在巴西Santana do Livramento（南纬30° 50′ 15″，西经55° 23′ 43″）的非Bt大豆田中收集，并在实验室条件下保存了约16代，未接触杀虫剂。该种群也作为对杀虫剂、Bt毒素和Bt性状研究的敏感参考种群（Godoy等人，2024；Reis等人，2024）。

表1 用于评估对基于Bt的杀虫剂敏感性的巴西R. nu种群

图1 该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

R. nu在巴西大豆田中的采样地点
为了评估基于Bt的杀虫剂与R. nu中的Cry1Ac毒素之间的交叉抗性，研究还包括了一个实验室筛选的Cry1Ac抗性种群（Rnu-R）。该种群最初是从种植Cry1Ac大豆的田地中收集的，随后在实验室中根据Reis等人（2024）的描述筛选出Cry1Ac抗性。Rnu-R种群在diet-overlay生物测定中表现出超过736倍的抗性，抗性遗传方式被确定为常染色体隐性、单基因的，并且没有明显的适应性成本。自最初筛选以来，Rnu-R已在实验室中保存了16代，并每两代暴露于Cry1Ac大豆叶片。存活到L3阶段（约1厘米长）的幼虫被转移到人工饲料上完成其生命周期。在本研究开始时，在Cry1Ac大豆叶片上的存活率超过了92%。

互交（Rnu-R♀ × Rnu-S♂ 和 Rnu-R♂ × Rnu-S♀；每组至少20对）用于生成杂合子。测试这些杂合子有助于确定对Bt制剂杀虫剂的抗性遗传模式，为抗性管理提供重要信息。

杀虫剂
评估中使用的基于Bt的杀虫剂包括DiPel WP（B. thuringiensis var. kurstaki菌株HD-1；32克/千克；Sumitomo Chemical Brasil Indústria Química S.A.，Maracanaú，CE，巴西），含有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac和Cry2A；以及XenTari WG（B. thuringiensis var. aizawai菌株ABTS-1857；540克/千克；Sumitomo Chemical Brasil Indústria Química S.A.），含有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1C和Cry1D。

生物测定
为了评估R. nu对基于Bt的杀虫剂的敏感性，在24孔丙烯酸板（Costar?，圣保罗，SP，巴西）中对六个种群中的四个进行了diet-overlay生物测定（表1；图1）（Parapanema-1；Braga；Mineiros；Barreiras）。Parapanema-2和Júlio de Castilhos种群表现出高水平的寄生，这影响了菌落的建立和生物测定的进行。最初，每个孔中加入1毫升通常用于饲养R. nu的人工饲料（Greene等人，1976）。制备好平板后，将每种基于Bt的杀虫剂稀释在蒸馏水中，以准备要测试的浓度范围。然后向每种稀释液中加入0.1%（v/v）的表面活性剂Triton X-100（Sigma–Aldrich，圣保罗，SP，巴西），以便均匀分布在饲料表面。接着测试了每种Bt杀虫剂的5-7个浓度，以标记的Bt含量表示（DiPel WP：0.005-0.89微克活性成分/平方厘米的饲料，相当于0.32-56 ppm；XenTari WG：0.005-8.96微克活性成分/平方厘米的饲料，相当于0.32-560 ppm）。使用自动重复移液器（Multipette? E3x；Eppendorf，圣保罗，SP，巴西）将30微升溶液滴加到饲料表面（1.88平方厘米）。对照组处理使用蒸馏水+表面活性剂。平板在层流风柜中干燥后，将一个来自田间种群的F1至F3代早期L3阶段的R. nu幼虫转移到每个孔中。平板用盖子封闭，并储存在25±2°C、65%±10%相对湿度和14:10光周期的气候室中。实验设计完全随机，每个 concentration 每个种群有2-4个重复，每个浓度或对照组处理共测试48-96只幼虫。七天后评估幼虫死亡率。不动的幼虫被视为死亡。

R. nu中对基于Bt的杀虫剂与Cry1Ac毒素的交叉抗性
在本研究中，来自Rnu-S、Rnu-R和互交F1后代（杂合子）的早期L3阶段幼虫在diet-overlay生物测定中暴露于DiPel WP和XenTari WG。生物测定程序、环境条件、实验设计和死亡率评估如上所述。

Bt杀虫剂对R. nu的控制效果
为了评估基于Bt的杀虫剂对田间种群和Rnu-S、Rnu-R及杂合子的控制效果，在田间条件下播种了一种非Bt大豆品种（BMX Valente RR 6968 RSF；Brasmax Genética，Passo Fundo，RS，巴西），密度为每米10株，行间距为0.45米，遵循巴西南部大豆生产的技术建议（Martin等人，2022）。在V5物候阶段，用田间剂量的DiPel WP（16克活性成分/公顷）或XenTari WG（270克活性成分/公顷）喷洒大豆植株，模拟喷洒体积为每公顷100升。生物杀虫剂使用压力CO2背包喷雾器喷洒，喷头间距为3米和0.5米（XR110.02风扇型喷嘴；TeeJet Technologies Co., Glendale Heights，IL，美国）。喷洒时，空气温度为24°C，相对湿度为68%。喷洒后45分钟，从植株的上三分之一去除三出叶，并在实验室中将其单独放置在2.5%琼脂-水凝胶混合物（每个孔3毫升）的滤纸上（42孔塑料板，Biosupply Comércio de Plásticos，Embalagens，Químicos e Suprimentos Ltda，圣保罗，巴西）。然后，每个孔立即放入一只早期L3阶段的R. nu幼虫。三天后，每种杀虫剂处理的叶子被替换为最初用相同杀虫剂喷洒的植株的叶子。实验设计随机化，每个种群每个杀虫剂有12个重复，每个种群总共测试84只幼虫。对照组处理每个种群有六个重复，每个种群共42只幼虫暴露于未处理的大豆叶子上。环境和死亡率评估与生物测定部分相同。

统计分析
diet-overlay生物测定中的浓度-死亡率数据使用假设二项分布和probit链接函数的广义线性模型（GLM）进行分析。使用hnp包（Moral等人，2017）进行拟合优度检验（χ2检验），以验证数据是否符合probit模型的假设。观察到的χ2值与预期χ2值之间无显著偏差（p＞0.05）表明拟合良好。然后，使用MASS包估计了LC50和LC90（分别对50%和90%的昆虫致命的浓度）以及95%的置信区间（CIs）。使用z检验对LC值进行了成对比较，显著性水平设为p<0.05（Robertson等人，2007年）。为了考虑多重比较并控制家族错误率（FWER），使用Holm–Bonferroni程序调整了p值。这些分析是在R 4.3.1版本中进行的（R Core Team，2021年）。叶子生物测定中的死亡率数据（控制效果）使用具有二项分布和对数连接函数的广义线性模型（GLM）进行分析，并估计了一个分散参数以解释过度分散。菌株/种群、处理（处理过的叶片与未处理的叶片）及其交互作用作为固定效应。使用Tukey方法调整p值，通过估计的边际均值进行成对比较，以评估不同种群内和处理组间的差异（emmeans包；Lenth，2021年）。分析在R版本4.3.1中进行了（R Core Team，2021年）。

**结果**

**R. nu对基于Bt的杀虫剂的敏感性**
使用饮食覆盖生物测定法测试的DiPel WP和XenTari WG的浓度范围对R. nu田间种群和敏感对照种群（Rnu-S）的早期L3幼虫的影响，导致死亡率在4%到98%之间。DiPel WP的LC50和LC90值在Rnu-S（分别为0.03和0.14 μg a.i. cm?2的饮食）和田间种群（分别为0.03–0.09和0.12–0.42 μg a.i. cm?2的饮食）之间没有显著差异（表2），基于LC50值的抗性比率≤3.0倍。相比之下，XenTari WG的LC50在Rnu-S（0.15 μg a.i. cm?2的饮食）和所有田间种群（0.46–0.60 μg a.i. cm?2的饮食）之间有显著差异，导致最大抗性比率≤4.0倍（表2）。同样，XenTari WG的LC90在Parapanema-1和Mineiros的田间种群中比在Rnu-S和其他测试的种群中更高。表2显示了R. nu种群暴露于基于Bt的杀虫剂时的浓度-死亡率反应（μg a.i. cm?2的饮食）。

总体而言，这些结果表明，大多数R. nu的田间种群对DiPel WP和XenTari WG的敏感性与其敏感菌株相当。这表明尽管对Cry1Ac大豆具有抗性，但田间种群仍然对这些基于Bt的生物杀虫剂敏感。虽然一些种群对XenTari WG的敏感性低于Rnu-S，但这些差异很小，不太可能影响田间效果。

**基于Bt的杀虫剂与Cry1Ac毒素之间的交叉抗性**
DiPel WP对Rnu-S、Rnu-R和杂合子的LC50和LC90值相似，分别为0.02–0.04和0.14–0.26 μg a.i. cm?2的饮食，基于LC50值的抗性比率≤1.3倍。相比之下，XenTari WG对Rnu-S的LC50（0.16 μg a.i. cm?2的饮食）显著低于Rnu-R和杂合子（0.56–0.85 μg a.i. cm?2的饮食），尽管抗性比率仍≤5.3倍（表3）。XenTari WG对Rnu-S、Rnu-R和杂合子的LC90值相似，范围为2.13至5.32 μg a.i. cm?2的饮食。这些结果表明R. nu中存在低但可检测到的基于Bt的杀虫剂与Cry1Ac毒素之间的交叉抗性。

**基于Bt的杀虫剂对R. nu的控制效果**
处理（处理过的与未处理的大豆叶片）对死亡率有显著影响（F = 933.54；df = 2, 230；p < 0.001），而菌株/种群的影响不显著（F = 1.05；df = 7, 232；p = 0.3959）。检测到菌株/种群×处理的交互作用（F = 3.38；df = 14, 216；p < 0.001）。未处理叶片（对照）的死亡率在7.1%到19.0%之间，而DiPel WP和XenTari WG在所有菌株和种群中始终导致高死亡率（>95%）（图2）。成对比较显示两种Bt制剂都比对照组具有更高的死亡率，DiPel WP和XenTari WG之间没有差异。

**图2**
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。

**讨论**
本研究记录了来自巴西的田间收集的R. nu种群对基于Bt的杀虫剂DiPel WP和XenTari WG敏感，其敏感性在地理上略有变化（LC50方面≤四倍），相对于一个敏感参考种群。报告称，针对该物种的主要杀虫剂（包括生长调节剂、肌肉作用、神经作用和呼吸作用杀虫剂）的敏感性也有类似的变化（≤6.2倍）（Godoy等人，2024年）。对于Bt毒素，在Helicoverpa armigera（Hübner）（对Cry1Ac的敏感性变化为16.5倍）和S. frugiperda（对Vip3Aa20和Cry1F的敏感性变化分别为6.6倍和20倍）中，报告了更大的种内敏感性变化，这归因于基线敏感性的自然变异（Bernardi等人，2014年；Farias等人，2014年）。鉴于此，我们认为R. nu对DiPel WP和XenTari WG的敏感性变化较小，这反映了这些生物杀虫剂预期的效果，因为该物种之前很少接触含Bt的杀虫剂，并且只是在巴西最近才在大豆中经历了种群扩张。

在R. nu中检测到轻微的交叉抗性，其对Cry1Ac大豆的抗性比率≤1.3倍（DiPel WP含有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac和Cry2A），以及对XenTari WG的抗性比率≤5.3倍（XenTari WG含有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1C和Cry1D）。这些发现与先前研究一致，这些研究报道了转基因植物中表达的Bt毒素与含Bt的杀虫剂之间的低交叉抗性。例如，对Cry1F玉米抗性的S. frugiperda对DiPel ES和XenTari WG的抗性≤1.2倍（Jakka等人，2014年）。同样，对一种或多种Bt毒素（Cry1F、Cry1F/Cry1A.105/Cry2Ab2或Vip3Aa20，均在大豆中表达）抗性的S. frugiperda对XenTari WG的抗性≤6.0倍（Horikoshi等人，2019年）。此外，对Cry1Ac抗性的H. zea对DiPel ES和Agree WP仍然敏感，与敏感菌株相比差异≤2.9倍（Welch等人，2015年）。

尽管杂合子和抗性R. nu幼虫在暴露于XenTari WG时表现出更高的LC50值，但在LC90值或田间死亡率方面没有观察到差异。杂合子中较高的LC50可以归因于低剂量下的部分显性抗性，这可能会降低死亡率并增加LC50的估计值，正如在Ostrinia nubilalis（Hübner）和Plutella xylostella（Linnaeus, 1758）中对DiPel ES的观察（Huang等人，1999年；Sayyed等人，2000年）中所报告的那样。这些作者进一步指出，杂合子中较高的抗性比率可能反映了在共享位点上存在抗性等位基因，或者是由具有不同遗传背景的菌株杂交产生的杂种优势，从而增强了整体适应性并影响了杀虫剂的效果。从实际角度来看，早期检测抗性等位基因频率的增加对于防止控制失败至关重要。

**结论**
基于Bt的杀虫剂之间的轻微交叉抗性归因于Bt产品中存在其他Bt毒素和活性孢子，这些成分协同作用导致对已经进化出抗性的昆虫的死亡（Ferré和van Rie，2002年；Bravo等人，2011年；Ragasruthi等人，2024年）。这一特性扩大了活性范围，并减少了单一抗性机制损害整个生物杀虫剂效果的风险（Welch等人，2015年；Jurat-Fuentes等人，2021年）。因此，Bt产品的毒素多样性以及原毒素和活性孢子的存在有助于保持其对进化出抗性昆虫的有效性（Jakka等人，2014年；Souza等人，2019年；Jurat-Fuentes等人，2021年）。由于目前尚不清楚R. nu对Cry1Ac的抗性机制，需要进一步研究来阐明潜在的交叉抗性模式。

此外，我们的研究还表明，R. nu对Cry1Ac大豆的抗性进化并没有降低基于Bt的杀虫剂DiPel WP和XenTari WG的效果。然而，重要的是要强调影响田间效果的因素——如残留物持久性、紫外线降解和耐雨性——尚未得到评估，这些因素可能会限制Bt杀虫剂的效果。因此，应在未来的研究中考虑这些问题。尽管存在这些局限性，这些结果对于有机农民特别相关，他们通常使用Bt杀虫剂来控制侵染巴西和阿根廷大豆、向日葵、苜蓿和园艺作物的鳞翅目害虫的R. nu。尽管如此，记录的对Cry1Ac的抗性表明，R. nu种群也可能对商业Bt杀虫剂和Bt作物中存在的其他Cry毒素产生抗性。

在这种情况下，观察到R. nu菌株和田间种群对DiPel WP和XenTari WG的抗性比率虽然较低，但由于其潜在的进化意义，仍需谨慎考虑。根据Carrière等人（2010年）的研究，即使是对Bt毒素的敏感性有很小变化，也可能表明抗性个体的选择潜力，导致抗性等位基因的频率逐渐增加。这些发现强调了持续监测R. nu对Bt毒素敏感性的重要性，因为及早发现敏感性的变化对于及时实施抗性管理（IRM）策略和保持基于Bt的杀虫剂和Bt作物的长期效果至关重要。总之，尽管R. nu对Cry1Ac具有抗性，DiPel WP和XenTari WG仍然对R. nu有效。然而，它们的可持续性取决于稳健的IRM措施，包括与具有不同作用机制的杀虫剂轮换和使用其他控制策略的整合。

总之，本研究记录了来自巴西大豆田间的R. nu种群对基于Bt的杀虫剂DiPel WP和XenTari WG仍然敏感。虽然观察到这些产品与Cry1Ac毒素之间存在轻微但可检测的交叉抗性，但两种生物杀虫剂对R. nu仍然有效，包括对Cry1Ac大豆具有抗性的个体。这些发现表明，即使在R. nu对Cry1Ac产生抗性之后，DiPel WP和XenTari WG仍然是管理R. nu的有价值工具。