土耳其马尔马拉地区野生鸟类中β-内酰胺类抗生素耐药的大肠埃希菌的分布特征及耐药性分析

《Brazilian Journal of Microbiology》：Frequency and characterization of β-lactam-resistant Escherichia coli from wild birds from Marmara Region in Turkey

　　**摘要**
本研究旨在通过表型和基因型检测位于马尔马拉地区或在该地区迁徙的野生鸟类和候鸟粪便中的耐β-内酰胺类大肠杆菌。共收集了272份新鲜粪便样本，并将其分为以下几类：（1）常驻野生水禽；（2）常驻城市鸟类（如鸽子、乌鸦、麻雀）；（3）在土耳其过冬的候鸟；（4）春季和夏季停留的候鸟。样本分别在添加了或不添加头孢他肟（1 mg/L）的MacConkey琼脂上培养。使用改良Hodge试验评估碳青霉烯类耐药性，结果212个分离株均未检出阳性结果。在所检测的272只鸟类中，有62只（22.8%）携带产ESBL和/或AmpC酶的分离株。在272只鸟类中，有59只（21.7%）发现了耐抗菌药物的大肠杆菌，其中包括47只产ESBL的分离株、6只产AmpC的分离株以及5只同时具有这两种耐药性的分离株。其中，第1组（主要是鸥类）的耐药率最高。PCR分析显示，在84个分离株中，48个仅携带β-内酰胺酶基因，3个仅携带AmpC基因，5个同时携带这两种基因。检测到的基因包括：blaCTX-M（n=50）、blaSHV（n=2）和blaOXA10（n=10）；至于AmpC基因，有blaMOX（n=6）和blaCIT（n=2）。物种特异性分析证实了鸥类中耐药基因的频率最高。第1组和第2组中的耐药分离株比例显著高于其他组（P<0.001）。在垃圾填埋场觅食或与人类、动物和农业废弃物直接接触的鸥类中发现的耐药性表明，马尔马拉地区观察到的β-内酰胺类耐药性很可能具有的人为或动物源性。

**引言**
抗菌药物的广泛使用在人类和兽医医学中对传染病的治疗取得了显著进展。然而，全球人口的增长、密集的动物生产系统以及抗生素的无控制或不适当使用加速了抗菌药物耐药性的出现和全球传播。如今，耐药细菌不仅在临床环境中被检测到，也在与环境和野生动物相关的生态系统中出现；甚至在秘鲁亚马逊等偏远地区也发现了它们的存在[1]。这种情况表明，抗菌药物耐药性不能仅通过直接的抗生素暴露来解释，而是一个由人类、动物和环境相互作用形成的复杂生态过程。
近年来，野生鸟类作为抗菌药物耐药性细菌的储存库及其潜在传播媒介越来越受到关注。由于它们具有较高的移动性、多样的饮食习惯以及频繁与人为来源的接触，这些鸟类可以从农业区、垃圾填埋场、废水系统和其他受污染的水源中获取耐药微生物[2,3,4]。这些微生物及其相关的耐药基因可以通过鸟类的迁徙和日常活动传播到广阔的地理区域，并在人类、家畜和其他野生动物群体中循环[5,6]。然而，野生鸟类在这一过程中的真实流行病学作用尚未完全阐明。
在不同地理区域进行的研究表明，在野生鸟类中存在产GSBL和/或AmpC酶的肠杆菌目细菌，尤其是与城市和水生生态系统相关的鸟类。然而，报告的耐药率及其耐药基因的分布因区域环境条件、鸟类物种和人为影响程度而异。此外，现有的许多研究仅关注表型耐药性特征或有限的基因型标记物，同时评估表型和基因型数据的综合研究相对较少。此外，文献中的大多数数据来自西欧和亚洲的特定地区，对于生态多样性高和地理位置重要的区域的数据仍然不足[7,8,9,10,11]。尽管在土耳其的各种动物群体中（特别是农场动物中）已经证实了产GSBL细菌的存在，但关于野生鸟类的数据还非常有限[12,13]。考虑到土耳其位于欧洲、亚洲和非洲之间的主要迁徙路线，这一情况更加显著。特别是马尔马拉地区由于其湿地生态系统，成为了许多常驻和候鸟物种的重要停留、觅食和繁殖地。这些鸟类与密集的人口、农业活动和沿海生态系统的相互作用为抗菌药物耐药性的环境传播创造了有利条件。
鉴于马尔马拉地区常驻和候鸟种群中耐药性特征在表型和基因型水平上的研究数量有限，这表明存在显著的知识空白。此类研究不仅有助于填补区域数据空白，还将为“同一健康”框架（One Health）下的综合评估做出贡献，该框架关注抗菌药物在人类、动物和环境之间的相互作用。

**材料与方法**
共从土耳其马尔马拉地区的常驻和候鸟中非侵入性地收集了272份新鲜粪便样本。样本量基于50%的估计患病率、90%的置信度和5%的绝对确定性确定。样本根据野生鸟类是常驻还是候鸟以及它们的迁徙时期进行分类。此外，在分类过程中还考虑了鸟类物种的生态特征及其受人为环境影响的程度。分类基于野生鸟类栖息在不同环境并与人类或家养/野生动物接触的可能性。将鸟类分为四组，每组包含68个样本，详见表1：
- 第1组：常驻野生水禽（如大鸬鹚-Phalacrocorax carbo、鸥类-Larus spp.、灰鹭-Ardea cinerea），这些鸟类在靠近人类活动的湿地附近被捕获。
- 第2组：常驻城市陆鸟（如鸽子、乌鸦-Corvus corone、麻雀-Passer domesticus）。
- 第3组：在土耳其过冬的候鸟。
- 第4组：在春季到达的候鸟。这种分组旨在能够比较不同环境暴露程度和迁徙行为鸟类之间的β-内酰胺类耐药模式。

**表1** 收集的粪便样本的物种和亚种分布

**粪便采样**
采用非侵入性技术从野生鸟类种群中采集粪便样本，以尽量减少对鸟类的生理压力。新鲜粪便样本来自被送往私人兽医诊所或伊斯坦布尔大学-Cerrahpa?a兽医学院野生动物康复中心的鸟类，这些鸟类接受检查、护理、康复或治疗。样本在它们排便后立即收集。此外，还在伊斯坦布尔省各地区的森林区域内聚集的大量鸟类群体中采集粪便样本。在Manyas鸟类天堂，兽医在野生水鸟上岸时监督下收集了它们的新鲜粪便。在马尔马拉地区的沿海区域，还从商业建筑屋顶上筑巢的水鸟那里采集了粪便样本，收集也是在它们排便后立即进行的。所有粪便样本均使用Cary-Blair运输拭子运送到实验室。

**细菌分离与鉴定**
粪便样本在添加了头孢他肟（1 mg/L）和普通MacConkey琼脂的培养基中于37°C下 aerobic 条件下培养24小时。欧洲食品安全局（EFSA）报告称，使用添加头孢他肟的MacConkey琼脂可以提高初次分离的成功率[12,13,14]。通过标准生化测试鉴定出具有典型大肠杆菌形态的菌落。每个样本允许多个分离株[15]。

**ESBL、AmpC β-内酰胺酶和碳青霉烯酶产生大肠杆菌的表型检测**
从添加了头孢他肟的MacConkey琼脂中分离出的大肠杆菌株被筛查是否产生ESBL和AmpC β-内酰胺酶。通常每只鸟只收集一个分离株。但对于形态多样的菌落，样本被分为“a”和“b”两个子集以区分不同的分离株。最初通过检测对头孢泊肟、头孢他啶、阿扎酮胺、头孢他肟和头孢曲松的敏感性来筛查ESBL的产生[16]。随后使用头孢他肟（30 μg）、头孢他啶（30 μg）以及两者与克拉维酸（30/10 μg）的组合进行disk扩散确认[17]。对于对头孢氧嗪（≤14 mm）耐药但对头孢吡肟（≥18 mm）敏感的分离株，推断其具有AmpC β-内酰胺酶[18]。此外，使用改良Hodge试验评估在未添加头孢他肟的MacConkey琼脂上生长的分离株的碳青霉烯酶产生情况[16]。

**大肠杆菌分离株中的β-内酰胺类耐药基因**
无论表型结果如何，所有从添加了头孢他肟的MacConkey琼脂中分离出的大肠杆菌菌株都通过常规PCR方法检测了ESBL和AmpC β-内酰胺酶耐药基因（blaTEM、blaCTX-M、blaSHV、blaCMY、blaOXA-10、blaPER-2、blaCIT、blaDHA、blaMOX、blaFOX、blaEBR和blaACC）的存在。相反，在未添加头孢他肟的MacConkey琼脂中分离出的大肠杆菌菌株则筛查了碳青霉烯酶耐药基因（blaKPC、blaVIM、blaOXA、blaNDM-1）的存在[18,19]。所有基因和循环条件详见补充文件。根据Sigirci等人的方法从大肠杆菌分离株中提取DNA[18]。将每个24小时新鲜培养物的一环放入100 μl无DNase/RNase的超纯水中进行匀浆。在95°C下孵育10分钟后，样品在6000 rpm下离心4分钟。收集的上清液随后用作后续PCR测定的DNA模板。

**数据分析**
研究中检视的变量的描述性统计以绝对频率（n）和相对频率（%）表示。抗菌药物耐药性的患病率（PR）分别针对表型和基因型耐药性进行计算。患病率是通过将耐抗菌药物的大肠杆菌分离株数量除以总大肠杆菌分离株数量来确定的。所有统计分析均在分离株水平上进行。患病率的置信区间以90%的置信水平（90% CI）计算。分析中评估的主要变量包括直肠定植的存在、表型抗生素耐药性、基因型抗生素耐药性和样本所属的组别。直肠定植变量是通过从野生鸟类获得的直肠样本中分离出大肠杆菌并随后确定这些分离株的抗生素耐药性谱型来表征的。在此框架内，评估了直肠定植与抗生素耐药性存在之间的关系。首先计算了所有样本的总抗生素耐药率。随后分别确定了每个研究组的表型和基因型抗生素耐药性患病率。使用卡方（$\chi^2$）检验比较各组之间的差异。当预期细胞频率小于5时，采用了Fisher精确检验。为了减少多组比较带来的I型错误风险，实施了Bonferroni校正。所有分析均使用SPSS for Windows Version 30.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）进行。

**结果**
在272个样本中，从普通MacConkey琼脂和添加了头孢他肟的MacConkey琼脂中分别分离出212个和84个大肠杆菌菌落。已鉴定的大肠杆菌分离株的组别分布总结在表2中。关于表型检测到的ESBL、AmpC和碳青霉烯酶活性的数据：在84株对头孢噻肟具有抗性的大肠杆菌分离株中，有55株（65.47%）具有表型ESBL活性，12株（14.28%）具有AmpC活性。在这些大肠杆菌菌株中，50株仅具有ESBL活性，7株仅具有AmpC活性，5株同时具有ESBL和AmpC活性。ESBL和/或AmpC阳性分离株的总数为62/272（22.8%）（见表2）。表2显示了表型特征为ESBL和/或AmpC产生的大肠杆菌分离株的组别分布。全尺寸表格。

在第1、2、3和4组中，表型ESBL阳性分离株的分布分别为32株（66.6%）、13株（65%）、8株（80%）和2株（33.3%）。相反，在第1、2和4组中，表型AmpC阳性分离株的分布分别为9株（18.8%）、1株（5%）和2株（33.33%）。有5株大肠杆菌分离株同时具有ESBL和AmpC表型，其中4株来自第1组，1株来自第4组。通过改良霍奇试验（Modified Hodge Test），在任何大肠杆菌分离株（n=212）中均未检测到碳青霉烯类抗性。

关于大肠杆菌分离株的β-内酰胺抗性的物种特异性表型特征的数据：在基于动物的评估中，272只鸟类中有59只（21.7%）检测出表型抗菌素抗性。其中，47只鸟类仅表现出ESBL表型，6只只表现出AmpC表型，6只同时表现出两种抗性。大多数耐药鸟类属于第1组，尤其是银鸥（29只Larus argentatus）和小鸥（5只Hydrocoloeus minutus），以及1只灰鹭（Ardea cinerea）。在这组中，59只银鸥中有34只（57.6%）检测出β-内酰胺抗性。在第2组中，14只鸟类检测出抗性，主要表现为ESBL表型。第3组中有7只鸟类表现出ESBL阳性，而第4组中只有3只鸟类检测出抗性。

β-内酰胺抗性基因的特征：基因型分析显示，在培养于添加了头孢噻肟的麦康凯琼脂（MacConkey agar）上的84株大肠杆菌分离株中，有61株含有编码β-内酰胺酶的基因。其中，51株携带ESBL基因，包括bla CTX?M（n=50）和bla SHV（n=2），而8株携带AmpC相关基因，如bla MOX和bla CIT。值得注意的是，12株表型ESBL阴性的分离株在基因型上也是阳性的，12株AmpC阳性的分离株中有8株在基因水平上得到了确认。在表型阴性的分离株中未发现AmpC的基因型证据。此外，在非添加抗生素的麦康凯琼脂上培养的212株分离株中均未发现碳青霉烯酶基因。按组别分布显示，第1组的频率最高，有28只鸟类（包括银鸥、小鸥和灰鹭）携带抗性基因。检测到的基因包括bla CTX?M（n=25）、bla SHV（n=1）、bla OXA?10（n=6）、bla MOX（n=5）和bla CIT（n=1）。7株分离株同时携带ESBL和AmpC基因。在第2组中，15只鸟类（主要是鸽子）携带抗性基因，检测到的基因包括bla CTX?M（n=15）、bla SHV（n=1）、bla OXA?10（n=1）和bla MOX（n=1）。有一只鸽子和一只喜鹊在表型上呈阴性或部分阳性，但在基因型上是阳性的。在第3组中，7只猛禽携带抗性基因，检测到bla CTX?M（n=5）和bla OXA?10（n=2）。在第4组中，5只鸟类（包括椋鸟、 Squacco heron和侏儒鸬鹚）检测出抗性。各组及鸟类物种的基因分布总结见表3。

统计数据：在评估的大肠杆菌分离株中，表型和基因型抗性的总体流行率分别为23.5%和21%。按研究组别分析，表型和基因型抗性率如下：第1组：57.4%（表型），41.2%（基因型）；第2组：20.6%（表型），23.5%（基因型）；第3组：11.8%（表型），10.3%（基因型）；第4组：4.4%（表型），8.8%（基因型）。所有分离株中，抗生素抗性的阳性率为23.5%，阴性率为76.5%，这种差异具有统计学意义（p<0.001）。为了比较各组之间的表型和基因型抗性，使用了卡方检验（Chi-square test），当预期细胞计数小于5时使用了费希尔精确检验（Fisher’s exact test）。第1组与第2组：表型阳性率分别为57.4%和20.6%（p<0.001），基因型阳性率分别为41.2%和23.5%（p=0.028），两者均显示显著差异。第1组与第3组：表型（57.4% vs 11.8%，p<0.001）和基因型（41.2% vs 10.3%，p<0.001）抗性均存在显著差异。第1组与第4组：表型（57.4% vs 4.4%，p<0.001）和基因型（41.2% vs 8.8%，p<0.001）抗性也存在显著差异。第2组与第3组：表型抗性（20.6% vs 11.8%，p=0.162）无显著差异，而基因型抗性（23.5% vs 10.3%，p=0.040）存在显著差异。第2组与第4组：表型抗性（20.6% vs 4.4%，p=0.004）和基因型抗性（23.5% vs 8.8%，p=0.020）存在显著差异。应用Bonferroni校正后，第1组与第2组、第1组与第3组以及第2组与第4组之间的表型抗生素抗性差异仍然显著。关于基因型抗性，第1组与第3组和第1组与第4组之间的差异同样显著。

讨论：抗菌素抗性是一个复杂且日益严重的全球性问题，影响着人类、动物和环境，其出现不能仅用临床或生产环境中的抗菌素使用来解释。越来越多的证据表明，包括未直接接触抗生素的野生动物在内的物种也可能参与耐药细菌及其抗性决定因子的环境传播[7]。在这种情况下，野生鸟类由于它们的移动性、生态多样性以及频繁接触人类污染的栖息地而受到特别关注。多项研究强调了它们在迁徙和日常觅食过程中在大范围地理区域内传播耐药微生物的潜力[5, 6]。在本研究中，与人类居住区和废物污染环境关系更密切的鸟类似乎在携带ESBL和/或AmpC产生的大肠杆菌方面起着更重要的作用。这一观察结果与先前的报告一致，这些报告指出，尤其是海鸥等水生和城市相关的野生鸟类可能是耐药肠杆菌的重要携带者[8, 10, 11, 16, 20, 21]。葡萄牙、法国、佛罗里达和欧洲沿海地区的研究反复证明，在垃圾填埋场、受污水影响的沿海地区、海滩和其他受人类影响的栖息地觅食的海鸥经常携带耐药大肠杆菌，包括产生ESBL的菌株[8, 10, 11, 16, 20, 21]。我们研究中阳性鸟类中海鸥的主导地位支持了这种生态模式，并表明这些鸟类中检测到的耐药菌株或抗性基因可能与人类和/或动物来源的环境暴露有关。

来自陆地城市鸟类的研究结果也支持越来越多的证据，表明城市栖息的野生鸟类可能有助于维持和传播抗菌素抗性。鸽子、鸠鸽、乌鸦等与人类生活密切相关的鸟类通常不被视为抗菌治疗的直接目标，但它们经常与人类垃圾、动物废物、受污染的水源和人口密集的公共空间接触。先前的研究表明，这些鸟类可能作为耐药细菌的储存库、哨兵或机械传播者存在于城市生态系统中[22, 23]。我们的结果与这些观察结果一致，并进一步表明城市野生鸟类不应仅被视为被动的环境指标，还应被视为抗性循环中的生物学相关组成部分。与定居水鸟和陆地城市鸟类相比，本研究中迁徙鸟类群体的抗性负担较轻。这并不意味着迁徙鸟类在流行病学上不重要；相反，它强调了抗性携带可能根据生态行为、觅食策略、停留栖息地以及与人类污染环境的接触程度而有所不同。来自加拿大、巴基斯坦、孟加拉国、西班牙、阿尔??加和突尼斯的研究表明，在迁徙鸟类中也可能检测到产生ESBL和AmpC的大肠杆菌，尽管报道的流行率因飞行路线、地区和环境背景而异[9, 10, 24, 25, 26]。因此，我们迁徙群体中较低的检测率可能反映了与持续接触人类来源废物的定居鸟类相比，它们暴露于受污染的城市生态位的程度较低。

从基因型角度来看，blaCTX?M在ESBL相关基因中的优势与全球大肠杆菌抗性的流行病学特征一致。CTX-M型β-内酰胺酶已成为人类和兽医医学中主要的ESBL，它们也广泛存在于环境和野生动物相关的分离株中。本研究中检测到的blaCTX?M，特别是blaCTX?M?1基因群，也与土耳其和其他地区的报告一致，表明这些基因在来自人类、牲畜、家禽和野生动物的分离株中普遍存在[12, 13, 27]。此外，blaSHV、blaOXA10、blaMOX和blaCIT的检测进一步表明，这些鸟类中的抗性谱系具有遗传多样性，不能归因于单一的抗性机制。本研究的另一个有趣发现是缺少在欧洲和非洲野生鸟类及环境分离株中频繁出现的blaCTX?M?15[19]。这种差异可能反映了抗性基因池的区域性变异、当地生态条件或环境暴露模式的差异。这一发现并不表示矛盾，而是表明马尔马拉地区的野生鸟类抗性生态具有其自身的地方特征。这也强调了区域特定监测数据的重要性，因为抗菌素抗性基因的传播动态在不同生态系统和地理环境中可能存在显著差异。

除了微生物发现外，本研究还对公共卫生和环境监测具有意义。生活在城市沿海地区、公园、垃圾填埋场相关栖息地和受污水影响环境中的野生鸟类可能促进耐药细菌在不同环境之间的传播。通过粪便排出，这些鸟类可能污染水、土壤、休闲区、动物栖息地，甚至可能与食物相关的环境[11, 22]。因此，在野生鸟类中检测到产生ESBL和/或AmpC的大肠杆菌应被视为不仅仅是兽医或生态学观察的结果，也可能是更广泛环境暴露和人畜共患风险的潜在指标。同时，在解释这一现象时需要谨慎。野生鸟类中存在耐药大肠杆菌本身并不直接证明其会传播给人类。需要更详细的流行病学和基因组学研究来澄清这种传播途径的方向、频率和重要性。本研究的另一个重要贡献是提供了来自土耳其的区域数据，涉及抗菌素抗性生态学中一个相对未被充分探索的方面。虽然该国已有许多研究记录了人类、牲畜和家禽分离株中的β-内酰胺酶基因，但关于野生鸟类的数据仍然有限[12, 13, 18, 27]。在这方面，本研究的结果支持将野生鸟类种群纳入综合监测策略。如海鸥和鸽子等物种，尤其是那些栖息在人口密集城市环境中的鸟类，可以作为监测环境抗菌素抗性的有用的哨兵宿主。总的来说，这些发现支持“同一健康”（One Health）的观点，即抗菌素抗性是通过相互关联的人类、动物和环境途径维持的。野生鸟类似乎是这一过程中的一个组成部分，尤其是在受人类活动影响的生态系统中。未来的研究将野生鸟类采样与废水、垃圾填埋场、沿海水域和与牲畜相关的环境样本结合，结合全基因组测序和质粒分析，将有助于澄清该地区抗性决定因子的传播路线和流行病学相关性。

结论：本研究证明了在马尔马拉地区居住或季节性经过的野生鸟类中存在产生ESBL和/或AmpC的大肠杆菌。研究结果表明，那些更频繁接触人类活动、动物相关环境以及受废物污染栖息地的鸟类，比那些与这些环境接触较少的鸟类更有可能携带耐药性大肠杆菌。blaCTX?M相关耐药性的普遍存在支持了这样的观点：野生鸟类参与了临床相关耐药基因在更广泛环境中的传播。特别是海鸥和其他与城市相关的鸟类物种，似乎值得作为监测抗菌药物耐药性循环中的潜在哨兵和携带者而被重点关注。总体而言，这些结果强调了将野生鸟类群体纳入基于“同一健康”（One Health）理念的抗菌药物耐药性监测体系中的重要性。同时监测野生动物与人类、动物和环境之间的相互作用，有助于更准确地了解耐药性的传播情况，并有助于加强以公共卫生为导向的控制策略。