乌干达牛群中分离出的副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis）的潜在毒力评估

《Brazilian Journal of Microbiology》：Evaluation of the potential virulence of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis isolates from cattle in Uganda

　　**摘要**
了解由副结核分枝杆菌（MAP）引起的副结核病（PTB）的发病机制对于管理这种具有经济重要性的疾病至关重要。已知MAP菌株在基因型上存在差异，这可能导致菌株毒力和疾病结果的不同。MAP在宿主体内的行为以及其克服宿主防御系统的机制尚未完全明了。本研究旨在评估乌干达牛群中不同MAP分离株的潜在毒性。通过分析RAW 264.7巨噬细胞感染四种不同MAP分离株（MAP1、MAP2、MAP3和MAP4）后的细胞因子表达谱来实现这一目标。使用特定实时PCR技术来确定不同细胞因子的表达情况、MAP可能的毒力基因以及感染后不同时间点（3小时、24小时、48小时）巨噬细胞内的MAP数量。感染不同MAP分离株的巨噬细胞之间的细胞因子表达存在显著差异。感染MAP1的巨噬细胞在感染后48小时的IL-6表达明显高于其他分离株；这是MAP在巨噬细胞内存活的已知策略。可能的毒力基因kdpC、katG、papA2、impA和抗凋亡基因（BCL-2）的调控在不同分离株之间也存在显著差异。MAP1、MAP2和MAP3分离株在细胞内复制和存活方面表现出更高的毒性。这些MAP分离株的行为清楚地表明了毒力的差异，未来的研究需要关注如何利用这些差异来设计PTB的诊断和控制策略。

**引言**
由副结核分枝杆菌（MAP）引起的副结核病（Johne’s disease）是一种在多种动物物种中严重且具有经济重要性的疾病，尤其是反刍动物。该感染会导致慢性肉芽肿性肠炎，有时会在数年后才表现为严重的消瘦性腹泻，最终导致动物消瘦并完全丧失生产力。最近，越来越多证据表明MAP是一种人畜共患病原体[1, 2]。尽管感染的确切数量仅能估计，但在许多情况下可能比假定的要高。由于动物出现临床症状之前的潜伏期很长（通常为数年），因此早期诊断该疾病较为困难；然而，它仍会继续传播。这种微生物生长极其缓慢，这使得对其在宿主细胞内的行为的研究变得复杂。因此，由于对微生物与宿主在细胞水平上相互作用的了解有限，对该疾病的预防通常效果不佳。针对MAP分离株的研究区分了两种主要基因型或菌株，基于其生长特性和宿主关联：“牛型”或“Type C”和“羊型”或“Type S”[3]。后来提出了一种第三种类型“Bison”或“B型”，但它被归类为Type C的亚型[4]。根据遗传标记的全基因组序列分析，MAP还被分为I型、II型和III型[5]。这些不同的菌株和基因型可能导致疾病的临床表现和病理变化[6]。然而，MAP菌株之间的毒力差异尚未得到广泛研究。

**微生物毒力**是指病原体通过调节不同的蛋白质分泌系统、脂质途径和其他细胞表面信号变化来定植、进入并持续存在于宿主细胞中的能力[7]。在宿主细胞内，MAP已知会影响细胞内过程，如凋亡和不同细胞因子的产生。受感染的巨噬细胞会产生大量细胞因子，这些细胞因子在调节免疫和炎症反应中起着多重作用。不同的细胞因子可能对不同的靶细胞有多种作用，这意味着它们的功能可能不是特异性的[8]。细胞因子在对感染的反应中可能具有重叠的作用。早期MAP感染与促炎细胞因子反应相关，包括产生干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素2（IL-2）、IL-6、IL-12和肿瘤坏死因子α（TNF-α）等；而晚期感染则与产生抗炎细胞因子相关，如转化生长因子-β（TGF-β）、IL-4、IL-10和IL-13[9]。MAP通过干扰这些细胞过程来在细胞内生存并克服吞噬作用[10]。已有研究表明，MAP感染与参与宿主免疫反应的基因表达谱的变化有关，这些变化使其能够在宿主巨噬细胞内存活和繁殖[11]。诸如非核糖体肽合成酶基因（pstA）、保守的多酮合酶相关蛋白（papA2）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G（pknG）、可能的氧化还原酶（fabG2_2）、潜在的肌醇单磷酸酶（impA）、可能的麦角酸合酶（umaA1）、异戊二烯生物合成（gcpE）、过氧化氢酶-过氧化物酶（katG）等分枝杆菌基因被认为在MAP进入、在宿主巨噬细胞中的存活和建立中起作用[12,13,14]。

虽然小鼠不是MAP的自然宿主，但它们在过去的研究中被用于了解病原体在早期感染期间的与宿主的相互作用[15]。此前进行了体外感染实验，使用原代巨噬细胞（单核细胞衍生的巨噬细胞MDM）或特殊细胞系（如RAW 264.7和J774）来研究MAP的毒力特性，如存活能力（生存和繁殖）、对凋亡的影响、细胞因子产生和不同的基因表达谱，以推断MAP在巨噬细胞内的命运[16,17,18,19]。已知副结核分枝杆菌在不同宿主物种中的毒力存在差异[3]。不同菌株的毒力变化可能与MAP基因组内的突变或单核苷酸多态性（SNPs）有关。对不同潜在MAP毒力基因的系统发育分析对于确定这些变化的来源是必要的。这种差异性毒力可以被利用来识别高免疫原性的分离株，从而用于疫苗开发以控制PTB。

不幸的是，关于不同MAP菌株毒力的信息非常有限。尤其是在许多非洲国家，这方面的数据尤其匮乏[20]。主要原因在于人们对这种疾病在家和野生动物群体中的发生缺乏普遍认识，以及报告病例的频率较低，导致对该疾病及其病因的研究被忽视。最后，值得注意的是，PTB主要被视为一种动物疾病，因此在控制或研究计划中的优先级较低，例如疟疾或结核病。然而，这也意味着缺乏进一步的了解，病原体可能会继续不受阻碍地传播，从而无法评估其对人类和动物的影响。

在这项研究中，探讨了MAP在感染期间的行为。研究了来自乌干达的四个野外MAP分离株在RAW 264.7巨噬细胞中感染3至48小时内的毒力基因表达情况，以及相应的细胞因子对MAP感染的反应。还观察了这些时间段内MAP分离株的复制和细胞内存活行为。了解MAP的行为和毒力机制对于设计副结核病的控制和预防措施非常重要。

**材料与方法**
**MAP培养**
本研究中使用的样本来自最近在乌干达进行的MAP监测研究[21]。通过将MAP阳性的牛的粪便样本培养在含有万古霉素、两性霉素B和萘啶酸的Herrold’s Egg Yolk琼脂斜面（HEYM，Becton, Dickinson and Co., Sparks MD, USA）上，并加入Mycobactin J，培养温度为37°C，培养时间为6周到6个月，从而分离出MAP。所有形成典型MAP菌落的斜面均通过LightCycler? 96仪器（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）上的实时PCR检测进行确认，使用的引物针对IS900基因（表2）。PCR混合液包括10 μl LightCycler? 480 Probes Master、3 μl PCR用水、每种正向和反向引物各0.5 μl（10 μM）、1 μl探针（10 μM）和5 μl DNA模板。温度程序为：首先在95°C下变性10分钟，然后进行45个循环，每个循环包括在95°C下变性15秒、在60°C下退火30秒和在72°C下延伸35秒，具体步骤按照制造商的建议进行。MAP阳性菌落被转接到HEYM上以实现纯化。然后，将单个菌落接种到约5 ml BBL? Middlebrook 7H9培养基中，该培养基含有由Becton, Dickinson and Co.生产的甘油，并添加Mycobactin J（IDvet, Grabels - France）和OADC富集剂（BD BBL? Middlebrook, Becton, Dickinson and Co.），置于15 ml离心管（Sarstedt, Numbrecht, Germany）中，在37°C下培养3周，以获得最佳的细菌生长（Heratherm Incubator, ThermoScientific, Langenselbold, Germany）（图1）。四种成功培养的MAP分离株：MAP1、MAP2、MAP3和MAP4被用于感染实验，并进行了全基因组分析。这些分离株分别来自乌干达四个不同的地区。这些牛是Friesian杂交品种，年龄在2岁及以上，据报道有持续性腹泻，身体状况评分各不相同。

**实验设计**
**48小时RAW 264.7小鼠巨噬细胞体外感染模型的实验布局，其中包含四种不同的MAP分离株**
**四种MAP分离株的测序**
**MAP DNA的提取**
使用改进后的Cetyltrimethylammonium bromide（CTAB）方法进行DNA提取[22]。简要来说，10 ml细胞悬浮液被变性并离心得到沉淀物，然后进行均质化、混合和离心，以获得用于测序的所需混合物。

**序列数据分析**
为了表征这些分离株，使用PacBio?（外包服务）进行全基因组测序（WGS），并对四种分离株进行分型。使用FastQC工具包[23]评估原始读数的质量。然后使用fastp处理读数，这是一种快速处理工具，可以去除读取中的接头序列并去除不良读数。使用SPADES v3.9.1软件和“-careful”选项将修剪后的读数组装成草图基因组，并进行错误校正。使用PROKKA v1.13.3对生成的草图基因组进行注释。为了确定这四个基因组与已知基因组的系统发育关系，构建了一个系统发育树，其中包括从国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中检索的二十三个完整的MAP基因组。总共对齐了二十七个基因组序列，并使用MacVector Pro 18.6软件绘制了系统发育树。用于构建系统发育树的参数包括：使用Neighbor Joining方法进行树状结构构建，Best-tree算法确定最优树形，以及Kimura 2参数模型计算基因距离。巨噬细胞准备：选择对MAP敏感的RAW 264.7小鼠巨噬细胞（CLS Cell Lines Service GmbH，德国埃佩尔海姆）进行这些感染研究。细胞培养在标准条件下进行，温度为37°C，二氧化碳浓度为5%（ESCO CelCulture CO2培养箱；CCL-170 A-8，新加坡），使用RPMI 1640培养基（Sigma-Aldrich，美国圣路易斯），并添加10%胎牛血清（FCS，PAA Laboratories，奥地利帕辛），1%非必需氨基酸和1%青霉素/链霉素（Life Technologies，美国格兰德岛）。培养在25 cm2和75 cm2的组织培养瓶中（avantor?，美国拉德诺尔；TPP?，瑞士特拉辛根）。巨噬细胞培养24小时达到融合状态后进行感染实验。

感染实验中，将约10毫升细菌悬浮液以3000 g离心10分钟，然后将沉淀的MAP细胞重新悬浮在PBS中。通过涡旋混合进行简单匀化处理以分散MAP细胞。为了估算悬浮液中的细菌数量，使用分光光度计（SPECTROstar Nano S/N 601–1258，BMG LABTECH，德国奥尔滕贝格）在600 nm波长测量其光密度（OD），并根据标准校准曲线进行稀释。最终使用的感染剂稀释度使得在600 nm处的OD为0.2615，相当于3×10^8 CFU/ml。

感染实验在24孔培养板（Cellstar? Greiner bio-one，奥地利克雷姆斯明斯特）中重复进行，每个孔含有约10^5?10^6个RAW 264.7细胞的单层。加入新鲜RPMI培养基，并分别加入100 μl之前制备的MAP悬浮液（3×10^8 CFU/ml），感染比例为30:1。在37°C和5%二氧化碳的环境下（ESCO CelCulture CO2培养箱；CCL-170 A-8，新加坡）培养3小时、24小时和48小时。培养3小时后，用移液器完全移除细胞培养基，然后用新鲜RPMI 1640培养基洗涤单层细胞两次以去除细胞外的MAP。随后向每个孔中加入1000 μl新鲜RPMI培养基并继续培养。每个时间点都设置一个未感染细胞的对照孔。实验布局总结见图1。

在相应时间点后，完全移除细胞培养基，并用PBS洗涤单层细胞。接着加入0.25% Triton? X-100（AppliChem，德国达姆施塔特）处理1分钟以裂解细胞并释放细胞内的MAP。将裂解液转移到1.5 ml试管中，以5000 g离心2分钟。之后将沉淀重新悬浮在150 μl新鲜Middlebrook 7H9肉汤中，涡旋混合后短暂离心。然后将所有悬浮液转移到96孔板的每个孔中，每个样本重复两次。

为了测定细胞存活率，在每个孔中加入15 μl AlamarBlue（Life Technologies，美国尤金），比例为10:1。培养24小时后（这是减少氧化AlamarBlue的最佳时间），使用分光光度计（SPECTROstar Nano，S/n 601–1258 – BMG LABTECH，德国奥尔滕贝格）在570 nm和600 nm波长处测量吸光度。根据适当公式[24]计算AlamarBlue的减少百分比。首先计算校正因子（Ro），即570 nm处培养基与含AlamarBlue培养基的平均吸光度之差与600 nm处吸光度之比，然后将其应用于公式中，详见表1。

感染期间细胞因子和毒力基因的表达：在相应时间点后，完全吸取培养基并用PBS洗涤单层细胞。接着加入含有2-mercaptoethanol（Sigma Aldrich）的裂解缓冲液，并通过移液手动匀化以释放细胞内的MAP。按照制造商的建议，使用PureLink? RNA Mini Kit（Invitrogen，美国卡尔斯巴德）从300 μl细胞裂解物中提取RNA。随后使用SYBR Green RT-PCR试剂盒（Sigma Aldrich）在QuantStudio? 5 PCR Cycler（ThermoFischer Scientific，美国沃尔瑟姆）上进行实时RT-PCR，检测细胞因子和毒力基因的表达。反应总体积为25 μl，包含1 μl每个引物（10 μM），0.025 μl参考染料，0.125 μl逆转录酶（M-MLV RT），12.5 μl SYBR Green Taq Ready-Mix和3 μl模板DNA。温度程序为：首先94°C预热2分钟，然后进行40个循环的94°C变性15秒，60°C退火/延伸1分钟。同时检测参考基因Ig2和癌症易感候选基因3A/转移淋巴结51（casc3A/mln51a）作为MAP毒力基因的对照，以及RAW 264.7细胞的细胞因子表达。

在相应时间点后，完全吸除孔中的培养基并用PBS洗涤单层细胞。接着加入含2-mercaptoethanol的裂解缓冲液，并通过移液手动匀化以释放细胞内的MAP。使用PureLink? RNA Mini Kit（Invitrogen，美国卡尔斯巴德）从300 μl细胞裂解物中提取RNA。随后使用LightCycler? 480 Probes Master（Roche Diagnostics，德国曼海姆）和QuantStudio? 5 PCR Cycler（ThermoFischer Scientific）进行实时qPCR检测细胞因子和毒力基因的表达。反应总体积为20 μl，包含1.0 μl每个引物（10 μM），0.5 μl探针（10 μM），10 μl Light Cycler 480 Probe Master和5.0 μl模板/MAP DNA标准品。温度程序为：首先95°C预热5分钟，然后进行45个循环的95°C变性10秒，60°C退火/延伸40秒，使用针对F57基因的引物（表2）。表2列出了特定细胞因子、抗凋亡基因、MAP鉴定基因和毒力基因的引物。

在不同时间点后，完全吸除孔中的培养基并用PBS洗涤单层细胞。接着加入Buffer AL和Proteinase（Qiagen - 德国希伦）进行细胞裂解，并通过移液手动匀化以释放细胞内的MAP。使用QIAamp? DNA Blood Mini Kit（Qiagen）从560 μl细胞裂解物中提取DNA。然后使用LightCycler? 480 Probes Master（Roche Diagnostics，德国曼海姆）进行实时qPCR检测。反应总体积为20 μl，包含1.0 μl每个引物（10 μM），0.5 μl探针（10 μM），10 μl Light Cycler 480 Probe Master和5.0 μl模板/MAP DNA标准品。温度程序为：首先95°C预热5分钟，然后进行45个循环的95°C变性10秒，60°C退火和延伸40秒，使用针对F57基因的引物（表2）。为此，使用了Invitrogen（美国卡尔斯巴德）制备的已知拷贝数的F57基因合成分子标准品，并通过系列稀释（10^7 ? 10^1）绘制标准曲线以计算MAP拷贝数。

相对基因表达的数据（包括细胞因子、毒力基因和细胞存活率）被输入MS Excel进行分析。进一步使用R统计软件[29]进行单因素方差分析（ANOVA），以确定四个MAP分离株在不同时间点的细胞因子和基因表达谱之间是否存在显著差异（p值<0.05）。相对基因表达（ΔΔCt）的计算方法如Taylor等人[28]所述：

$$\begin{array}{c}\triangle\triangle C_t={\left(C_{t\;gene\;of\;interest\;}-C_{t\;reference\;gene}\right)}_{treated\;sample}\\-{\left(C_{t\;gene\;of\;interest}-C_{t\;reference\;gene}\right)}_{untreated\;sample}\end{array}$$

上调或下调两次的基因被认为是显著的[30]。

感染期间毒力基因和细胞因子的表达：四个MAP分离株在3小时、24小时和48小时时显示出各种毒力基因相对表达的显著变化（图2）。然而，对毒力基因表达谱的统计分析显示，在不同时间点各分离株之间没有显著差异（ANOVA，p值>0.05），尽管MAP4在所有处理组的毒力基因表达平均值最高。总体而言，MAP1在初期上调了大多数毒力基因，随后下调了papA2和umaA1基因，最后上调了kdpC基因。MAP2在感染后24小时所有基因均下调。另一方面，MAP3在感染后的所有时间点都显著下调了katG和umaA1基因。其余基因在不同时间点的相对表达水平各不相同。同样，MAP4在感染后24小时内也显著下调了katG和umaA1基因。其他基因在不同时间点的相对表达程度也有所不同；但在感染后24小时所有基因均上调。

对于细胞因子的表达，感染不同MAP分离株的巨噬细胞中细胞因子的上调和下调情况非常不均匀（图3）。在3小时感染期间，MAP3诱导的细胞因子表达平均值最高，所有分离株之间存在统计学上的显著差异（p<0.01）。在24小时时间点，感染MAP2的巨噬细胞显示细胞因子表达平均值最高，而感染MAP4的巨噬细胞表达值最低。事后检验（Turkey’s hsd）显示感染MAP2和MAP4的巨噬细胞之间细胞因子表达存在显著差异（p=0.025），但在感染后48小时没有显著差异（p=0.231）。

感染后3小时、24小时和48小时，感染MAP1的巨噬细胞中所有细胞因子均下调，但IL-6在感染后48小时显著上调。感染MAP2的巨噬细胞在感染后24小时表现出促炎细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-12p40）的上调，以及抗炎细胞因子（IL-10、TGF-β）的下调。已知具有促炎性质的IL-6也在此时点下调。感染MAP3的巨噬细胞在相对细胞因子表达上显示出一定程度的变异性，3小时和24小时之间没有明显差异；但在感染后24小时，IL-12p40、IFN-γ和TGF-β上调。感染MAP4的巨噬细胞在感染后3小时所有细胞因子均显著下调。TGF-β在感染后24小时进一步下调，但在感染后48小时再次上调。抗凋亡基因（BCL-2）在感染MAP1、MAP3和MAP4的巨噬细胞中下调；仅在感染MAP2的巨噬细胞中在感染后24小时上调。

所有MAP分离株在48小时内都表现出细胞内DNA的复制，尽管增幅较低（小于0.5 log10）。只有MAP2在感染后48小时的细胞内DNA量略有减少（小于0.5 log10）。总体而言，在所有时间点和所有分离株中，细胞内MAP DNA的变化都不明显（图4）。

生存率研究显示，AlamarBlue的减少百分比以及细胞活性随MAP DNA量的减少而减少，这在MAP1、MAP2和MAP3的48小时感染期间均成立。然而，MAP4在感染后24小时的MAP存活率降低，而MAP量略有增加。此外，与其他分离株相比，MAP4的细胞内MAP量较低（表3）。然而，统计分析显示在不同时间点各分离株的存活率之间没有显著差异（p值>0.05）。

从四个研究基因组和其他参考基因组（包括牛的MAP_K10完整基因组）构建的系统发育树显示了明显的分组（图5）。本研究的三个分离株（MAP1、MAP2和MAP4）以及另一个来自埃及的分离株（CP010113.1）聚集在一个分支中。而MAP3与这三个研究基因组不同，分别与参考基因组MAP_K10（AE016958.1）和另一个来自印度的牛分离株（NZ_CP015495.1）聚集在一起。

为了提高对副结核病（PTB）的重视，需要开展密集和有针对性的研究，以增强对其危险性的认识，并开发和制定有效的诊断和控制策略。了解MAP在宿主细胞内的行为及其如何引发后续感染，将有助于有效诊断和控制结核分枝杆菌（PTB）。在这项研究中，我们观察了MAP某些潜在毒力基因的调控模式、抗凋亡基因（BCL-2）、MAP在巨噬细胞内的存活情况，以及 RAW 264.7 巨噬细胞感染不同MAP分离株后参与炎症过程的某些细胞因子的行为。本研究使用了四种牛源MAP分离株：MAP1、MAP2、MAP3和MAP4。不同MAP菌株在单核细胞衍生的巨噬细胞（MDM）中的存活能力有所不同。在早期的一项研究中，观察到不同基因型的MAP菌株在MDM中的存活能力存在差异[26]。这些MAP菌株来自不同的宿主，研究结论认为MAP菌株表达的毒力因宿主相关性而异。在另一项研究中，使用牛源和人源MAP菌株感染MDM，观察到抗炎反应，表现为IL-10上调和TNF-α下调[31]。在另一个体外感染模型中，也观察到包括IL-6和IL-10在内的细胞因子上调，这有利于MAP在细胞内的存活[32]。在涉及MAP感染RAW 264.7小鼠巨噬细胞的研究中，还发现MAP能抑制感染期间的促炎反应[33]。已知感染MAP的巨噬细胞会产生不同的细胞因子，细胞因子在应对感染时发挥多种作用，功能可能存在重叠。

在当前的实验中，感染MAP1分离株的巨噬细胞在感染后48小时表现出IL-6的显著上调。虽然IL-6具有促炎特性，但在MAP感染中其抗炎作用更为显著[34]。MAP1对IL-6的行为表明了其在巨噬细胞内的存活策略，这在早期研究中也有观察到[31]。其他细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-12p40属于促炎细胞因子；IL-10和转化生长因子-β（TGF-β）属于抗炎细胞因子[35, 36]，它们的调控情况存在显著差异（ANOVA，p值<0.05）。相反，感染MAP2的巨噬细胞表现出促炎细胞因子上调和抗炎细胞因子下调的特征性反应模式。对于感染MAP3和MAP4的巨噬细胞，它们的细胞因子表达谱没有明显趋势；两者都显示出初始阶段所有细胞因子的下调，随后在感染过程中上调。抗凋亡基因（BCL-2）对所有分离株通常呈现下调，但感染MAP2的巨噬细胞在感染后24小时时却上调。已知MAP通过抑制凋亡干扰巨噬细胞的正常功能，从而促进其存活[37]。在这方面，MAP2分离株在巨噬细胞内的存活能力优于其他分离株。除了MAP2外，其他MAP分离株表现出促凋亡的特征，这与MAP的预期行为相反。在早期涉及小鼠巨噬细胞模型的MAP感染研究中也观察到了类似的趋势[38]；这可能表明了毒力的差异。然而，需要更多的研究来探讨其他影响感染结果的宿主/病原体因素。

本研究调查的一些可能的MAP毒力基因包括：kdpC、katG、papA2、impA和umaA1。这些基因参与了使MAP能够逃避宿主防御机制并在易感宿主体内引发感染的细胞途径[12]。在当前的RAW 264.7巨噬细胞实验中，尽管所有分离株之间没有显示出统计学上的显著差异（P>0.05），但在感染后四种分离株的个别毒力基因表达方面存在显著差异。特别是MAP2在感染后24小时显示出所有毒力基因的显著下调，与其表现出存活能力的细胞因子表达谱相反。这表明可能存在其他毒力因子介导了该分离株早期的毒力行为。另一方面，MAP4在最初的24小时内显示出所有毒力基因的显著下调，但随后katG和umaA1基因上调。MAP3也表现出类似的趋势，尽管程度较轻。不同毒力基因的表达是MAP细胞试图在巨噬细胞环境中存活的表现。据报道，umaA1基因在器官定植和细胞生物合成中起作用[39]。katG基因（一种可能的过氧化氢酶）表达的增加被认为是MAP在巨噬细胞环境中应对氧化应激的反应，以保护细菌细胞免受过氧化氢的侵害[14]。相比之下，MAP1在基因表达上调和下调之间没有显著差异，尽管kdpC基因在整个实验期间均上调。kdpC基因是一种可能的钾转运ATP酶C链，已被证明与MAP的器官定植和肉芽肿形成有关[12]。这些观察结果提示这些菌株的毒力机制可能存在差异。

不同MAP分离株在巨噬细胞内的活力和数量存在显著差异，但在感染后24小时总体上有所增加，表明其在巨噬细胞内成功复制。特别是MAP1在感染后24小时显示出MAP细胞数量的显著增加。相比之下，MAP4在所有时间点内的存活水平较低，且其活力在感染后24小时下降，而其他分离株在感染后48小时仍有大量MAP存活。除MAP4外，所有MAP分离株在感染后24小时的MAP拷贝数（超过2×10^4个基因组当量）均显著增加，这表明不同分离株的存活能力存在差异。总体而言，所有菌株在所有时间点的MAP细胞数量变化不大，表明其复制速率较低。这是由于MAP的世代时间长于20小时[40]。因此，无法进行超过2天的培养观察。由于RAW 264.7巨噬细胞在24小时后过度生长，不再形成均匀的单层细胞，我们无法继续观察超过48小时的感染过程。对于未来的研究，我们建议使用复制速率较慢的巨噬细胞以避免这一问题，并根据需要延长实验时间。还建议使用模拟体内宿主环境的模型，以更好地理解MAP生物体在自然细胞内环境中的相互作用。

从系统发育分析来看，MAP3与印度牛源分离株（CP015495.1）和参考MAP_K10菌株聚类在一起；前者（CP015495.1）之前曾被用于生成MAP诊断用的重组抗原[41]。这突显了这些分离株在产生抗原性和免疫反应方面的潜在用途，可用于MAP的诊断和疫苗开发。另一方面，研究中的分离株（MAP1、MAP2和MAP4）与来自埃及的分离株（CP010113.1）归为一组。尽管这些分离株来自不同的地理地点，但它们之间存在进化关联。乌干达的分离株也与来自印度和埃及的两种分离株以及参考MAP_K10菌株有进化关系。需要进一步研究这些分离株，以确定它们在结核分枝杆菌诊断和管理工具开发中的潜在应用。

结论：四种MAP分离株在细胞因子、凋亡和毒力基因反应方面表现出不同程度的毒力。然而，MAP1、MAP2和MAP3在巨噬细胞内的存活和复制能力高于MAP4分离株。这些实验提供了一种评估MAP在巨噬细胞内行为的方法。利用细胞因子和毒力基因表达来研究MAP在宿主巨噬细胞内的行为是解码MAP致病机制的适当方法。由于MAP是一种苛养菌，且结核分枝杆菌发展为临床疾病需要很长时间，这些体外模型将有助于理解MAP的致病机制。