薄荷（Mentha piperita）、百里香（Thymus vulgaris）和桉树（Eucalyptus globulus）精油纳米乳液对瓦螨（Varroa destructor）的群体级防治效果

《Experimental and Applied Acarology》：Colony-Level Efficacy of Mentha piperita, Thymus vulgaris and Eucalyptus globulus Essential Oil Nanoemulsions Against Varroa destructor

　　**摘要**
蜜蜂（Apis mellifera L.）对生态系统稳定和农业生产至关重要；然而，对蜂群最具破坏性的威胁之一是瓦螨（Varroa destructor）。尽管传统的化学杀螨剂可以提供短期控制，但抗性的产生和残留问题仍然是主要挑战。因此，植物提取的精油作为替代控制剂引起了人们的关注。本研究评估了由薄荷（Mentha piperita；P-NEms）、百里香（Thymus vulgaris；T-NEms）和桉树（Eucalyptus globulus；E-NEms）油制成的纳米乳液（NEms）在三种剂量（50、100和200 ppm）下对瓦螨的田间效果，并将其与阳性对照（阿米特拉唑，amitraz）和阴性对照（未处理）进行了比较。所有测试的纳米乳液配方均显著降低了瓦螨的密度，其中200 ppm剂量的效果最好（相对于初始螨虫数量的百分比降低最多）。T-NEms200处理表现出最强的杀螨活性（75.3%）。薄荷和桉树NEms也取得了高效率。阳性对照阿米特拉唑的有效率为53.5%，效果低于较高剂量的NEms，而未经处理的蜂群中的螨虫数量有所增加。这些配方中的纳米级液滴结构可能有助于增强活性化合物与螨虫之间的接触。总体而言，这些发现表明，基于精油的纳米乳液能够以浓度依赖的方式在蜂群水平上减少瓦螨的数量。然而，当前的研究仅关注了效果，在提出实际建议之前，还需要进一步研究其对蜜蜂健康、幼虫发育和蜂产品中残留物的潜在影响。

**图形摘要**
蜜蜂（Apis mellifera L.）对生态系统稳定和农业生产至关重要；然而，对蜂群最具破坏性的威胁之一是瓦螨（Varroa destructor）。尽管传统的化学杀螨剂可以提供短期控制，但抗性的产生和残留问题仍然是主要挑战。因此，植物提取的精油作为替代控制剂引起了人们的关注。本研究评估了由薄荷（Mentha piperita；P-NEms）、百里香（Thymus vulgaris；T-NEms）和桉树（Eucalyptus globulus；E-NEms）油制成的纳米乳液（NEms）在三种剂量（50、100和200 ppm）下对瓦螨的田间效果，并将其与阳性对照（阿米特拉唑，amitraz）和阴性对照（未处理）进行了比较。所有测试的纳米乳液配方均显著降低了瓦螨的密度，其中200 ppm剂量的效果最好（相对于初始螨虫数量的百分比降低最多）。T-NEms200处理表现出最强的杀螨活性（75.3%）。薄荷和桉树NEms也取得了高效率。阳性对照阿米特拉唑的有效率为53.5%，效果低于较高剂量的NEms，而未经处理的蜂群中的螨虫数量有所增加。这些配方中的纳米级液滴结构可能有助于增强活性化合物与螨虫之间的接触。总体而言，这些发现表明，基于精油的纳米乳液能够以浓度依赖的方式在蜂群水平上减少瓦螨的数量。然而，当前的研究仅关注了效果，在提出实际建议之前，还需要进一步研究其对蜜蜂健康、幼虫发展和蜂产品中残留物的潜在影响。

**引言**
蜜蜂和其他传粉者在全球粮食生产和营养安全中发挥着关键作用（Rajagopalan等人，2024年）。然而，近年来，蜜蜂蜂群面临严重威胁（S?nmez Oskay等人，2025年）。其中最主要的威胁是外寄生虫瓦螨（Varroa destructor，原名V. jacobsoni Oudemans）（Anderson和Truemann，2000年）。这种寄生虫以蜜蜂的幼虫和成虫为食，同时消耗它们的脂肪体和血淋巴（Han等人，2024年）。瓦螨会将多种病毒传播给蜜蜂，包括畸形翅病毒（DWV）、急性蜜蜂麻痹病毒（ABPV）和克什米尔蜜蜂病毒（KBV）（Lester等人，2022年），导致蜜蜂适应性下降和免疫系统发育受损，从而削弱蜂群并导致死亡（Rosenkranz等人，2010年）。这已成为一个重大问题，威胁到单个蜂群和整个蜜蜂种群的健康。传统上，人们更喜欢使用化学杀螨剂来控制瓦螨（Jack和Ellis，2021年）。然而，长期使用这些化学品可能导致螨虫产生抗性，并可能对蜜蜂健康产生负面影响，并在蜂产品中积累残留物（Güne?do?du等人，2022年）。因此，近年来养蜂业越来越关注瓦螨的自然控制方法。精油因其良好的效果和环境生物降解性而成为有前景的候选者（Bava等人，2024年）。一些研究表明，精油可以表现出与合成化学药剂相当的杀螨活性（Khajehali等人，2023年；Narciso等人，2024年），而其他研究则仅报告了低于商业产品开发要求的较低效果（Bava等人，2024年）。此外，一些作者报告称，某些精油不仅对瓦螨具有潜在的杀螨效果（Alsaadi等人，2024年），即使在非致命剂量下也可能具有驱避效果（Alahyane等人，2022年）。尽管当前的研究表明精油具有潜力，但也应仔细评估它们对蜜蜂可能带来的风险（Da Silva等人，2020年）以及潜在的好处（Conti等人，2020年）。因此，仍需要更全面的研究来证明精油作为生物农药的直接杀螨效果（Gostin和Popescu，2023年）。精油是从植物（根、叶、花和种子）中提取的天然化合物，具有抗菌、抗真菌和杀虫特性（Reyes-Jurado等人，2015年）。由于其天然来源、易于获取以及源自植物防御系统的固有杀虫特性，精油被视为害虫管理中的吸引人的替代品。与合成杀虫剂相比，它们对人类和非目标生物的毒性较低，使其成为综合害虫管理（IPM）和有机生产方法的合适选择（Isman，2023年）。与传统的化学杀虫剂不同，精油更不易产生抗性，这归因于其多种生物活性成分的协同作用（Isman，2020年）。最常用的具有杀虫或杀螨活性的精油包括香茅油、柠檬草油、丁香油、薄荷油、肉桂油、迷迭香油、甜橙油、桉树油和百里香油（Isman和Machial，2006年）。百里香酚是一种挥发性单萜类化合物，是百里香（Thymus vulgaris）的天然成分，是控制瓦螨最常用的精油基化合物之一（Price和Lummis，2022年），并包含在几种国家注册的兽医药产品中，如Apiguard?、Thymovar?和ApiLife Var?。百里香酚和薄荷醇对昆虫和螨虫的生长发育具有抑制作用（Kraus等人，1994年）。尽管百里香酚在控制瓦螨方面广泛使用，但其应用可能导致蜂蜜（Sánchez等人，2021年）和蜂蜡（Kast等人，2022年）中残留物的存在。然而，在推荐的使用条件下，这些残留物尚未被报道对蜜蜂或人类构成卫生风险（Adamczyk等人，2005年）。薄荷油也因其高含量的薄荷醇（55%）而对螨虫具有致命效果（Da Silva等人，2020年）。从桉树叶子中提取的油含有超过800种植物（Polito等人，2023年），其中含有的1,8-桉叶醇成分可以针对螨虫，并具有支持蜜蜂免疫系统的特性（Atmani-Merabet等人，2020年）。然而，由于精油的快速蒸发和降解，其持久性较短，可能需要反复施用，从而增加成本。因此，开发新的配方和应用技术以提高精油的效果代表了害虫控制中的一个重要机会（Campolo等人，2017年）。

**纳米技术**
纳米技术已成为21世纪的关键技术领域。纳米粒子和水性纳米制剂可以由有机和无机物质制成（Bhushan等人，2014年）。农业用纳米农药的开发是一个活跃的研究领域（Deka等人，2021年）。由于纳米产品的微小尺寸和大表面积，它们可以表现出增强的生物活性（Yan等人，2022年）。精油的一个常被引用的优点是它们通常在环境中的降解较快，持久性较低，相比许多合成农药。纳米乳液（NEms）技术的发展旨在克服这些挑战。NEms是由纳米级液滴组成的胶体系统，结合了两种不相容的 phases，如油和水（Elzayat等人，2021年）。NEms的一个关键优势是它们能够通过控制释放机制提高精油的生物利用度并优化其对目标生物的效果（Kumar等人，2025年）。迄今为止，只有少数研究调查了基于精油的纳米乳液对瓦螨的有效性（El Roby等人，2023年；Gamal Eldin等人，2024年）。使用精油代表了一种更安全、更环保的替代方案，因为它们不会在蜜蜂产品中留下化学残留物。在这方面，精油和NEms越来越多地被视为支持蜜蜂健康和生态可持续性的生物技术工具。纳米制剂可能比传统控制方法具有优势；然而，专门针对瓦螨的研究仍然有限，这突显了在不同地区和蜂群条件下进行进一步应用研究的必要性（Farina等人，2024年）。最近，Gamal Eldin等人（2024年）评估了一种间接应用方法，该方法将单一活性化合物（百里香酚NEms）掺入糖果糖中，这限制了文献中报道的应用策略范围。相比之下，本研究开发了三种基于精油的NEms（百里香、薄荷和桉树），并通过喷洒直接应用于覆盖有蜜蜂的框架上。这种直接应用策略代表了配方多样性和传递方法的重要进展，使蜂群能够更快、更均匀、可能更有效地接触生物活性化合物。因此，本研究的目的是评估在田间条件下，使用薄荷（Mentha piperita）、百里香（Thymus vulgaris）和桉树（Eucalyptus globulus）精油制成的纳米乳液对瓦螨的有效性。具体而言，该研究评估了浓度依赖的螨虫侵染效果，并将这些配方的性能与传统的杀螨剂处理进行了比较。

**材料与方法**
百里香、薄荷和桉树精油从当地的草药市场（Bitki Evim，Izmir，土耳其）购买。这些精油在+4°C的冰箱中储存，直到进一步分析和乳化。精油的化学组成按照Ligor等人（2014年）的方法确定，并进行了少量修改。使用气相色谱-质谱（GC-MS）（PerkinElmer Inc.，Waltham，马萨诸塞州，美国）进行了分析。分离采用非极性熔融硅毛细管柱（SGE BPX5，60 m × 0.25 mm ID，0.25 μm膜厚度，美国）。初始 oven 温度设置为60°C并保持10分钟，然后以4°C/分钟的速度升高到250°C并保持另外10分钟。注射器温度保持在220°C。使用氦气作为载气，流速为1.5 mL/分钟。每种精油1 μL的样品（预先用己烷（1:100，v/v）稀释）以不分馏模式注入。质谱检测采用电子电离（EI）在70 eV下进行。离子源和接口温度分别设置为200°C和250°C。质量谱记录在m/z 35–425范围内。通过将获得的光谱与NISTMS和WILEYMS 9光谱库（美国国家标准与技术研究院）中的光谱进行比较来识别挥发性成分。

**纳米乳液的制备**
基于精油的纳米乳液使用Joe等人（2012年）描述的改进方法制备。纳米乳液配方由精油（百里香、薄荷或桉树）作为油相，Tween 80作为主要表面活性剂，乙醇作为辅助表面活性剂，以及双蒸馏水作为水相组成。不同NEms（O/W型）剂量的成分及其 respective 数量见表1。根据程序，首先将所有成分混合并在86°C下加热1小时以促进乙醇蒸发。在纳米乳液制备协议中也描述了类似的方法，其中假设乙醇在超过其沸点（78.4°C）的温度下蒸发（?zo?ul等人，2017年）。然而，本研究中未对残留乙醇水平进行分析量化。剩余的混合物根据表1中所示的比例用双蒸水稀释。在超声均质化之前，使用机械均质器（IKA T25 digital ULTRA TURRAX）以500 rpm的速度预混合15分钟。最终的乳液使用超声均质器（Optic Ivymen System CY-500，巴塞罗那，西班牙）以72%的振幅处理15分钟。该设备的工作功率为500 W，频率为20 kHz。所使用的超声探头直径为5.6毫米，长度为60毫米。在超声处理过程中，通过冰浴将乳液温度保持在15°C。每种纳米乳液的最终体积为500毫升。选择Tween 80作为非离子表面活性剂，因为它在纳米乳液系统中广泛应用，并且据报道与蜜蜂相关的应用兼容，在实验室条件下没有观察到显著的不良影响（Wang等人，2025年）。乙醇被用作纳米乳液系统中的共表面活性剂。共表面活性剂如Transcutol P、甘油、乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、PEG 400、卡比特醇和丙二醇广泛用于纳米乳液配方中，以在低表面活性剂浓度下促进乳化（Kreilgaard等人，2000年）。酒精衍生物有助于降低界面张力，改善界面流动性，并增加烃链的移动性，从而促进油相更好地渗透到界面区域（Tenjarla 1999年）。此外，酒精在两个相之间分布，增加它们的互溶性（Chime等人，2014年）。

表1 不同精油浓度下纳米乳液配方的组成

乳液的物理性质
使用Zetasizer Ver. 7.13（Malvern Instruments Pvt Ltd，英国）测量了NEms的平均液滴大小。乳液稳定性在两周内进行了监测。为了评估稳定性，样品每隔一天在4°C和45°C下以2000 × g的离心力离心30分钟。离心后，样品在室温（23–24°C）下储存。两周结束后，没有观察到相分离或可见的油层（?zo?ul等人，2017年）。

蜂场和蜜蜂
本研究于2024年在土耳其Mu?省Suvaran村的通讯作者的蜂场进行（北纬38.7714°，东经41.4306°）。该蜂场有55个Langstroth型蜂箱，每个蜂箱都装有塑料底部和花粉捕捉器，并包含一个具有九个框架的育虫室。用于实验的蜂群的蜂王是自然配对的Caucasian F1杂交蜂王，于2024年6月引入（Güne?do?du等人，2022年），并且每个蜂箱通常有足够的封闭育虫空间，占据两个框架。这些蜂箱得到了精心管理，以确保蜂群强度、种群规模、育虫数量和营养资源的均匀性，最小化实验单位之间的差异（Bava等人，2025年）。在实验前的五个月（从4月到9月）没有施用杀螨剂，以确保可以测量Varroa虫的基线侵染水平。这样就可以清楚地评估与处理相关的螨虫负荷减少情况。有意允许高基线侵染水平，以便在严重的Varroa压力条件下评估处理效果。9月份的年均温度为20.1°C（高于0°C，并且在推荐的10–25°C范围内；Akyol & ?zk?k，2005年），相对湿度约为50%（低于影响V. destructor侵染蜜蜂生存的<60%水平；Annoscia等人，2012年）（表S1；土耳其国家气象服务局，2024年）。

实验设计
在这个实验中，根据Gamal Eldin等人（2024年）报告的值，对精油（EO）的浓度进行了少量修改。使用因子块设计，评估了三种精油（百里香、薄荷和桉树）在五个处理组（50、100和200 ppm，阳性对照和阴性对照）中的效果。每种剂量通过喷洒方式施用于蜂群。

应用是使用手持喷雾器进行的，每覆盖一只蜜蜂的框架喷5毫升，遵循Damiani等人（2011年）描述的方案，并进行了轻微修改。每个蜂群由九个覆盖蜜蜂的框架组成。由于每个框架施用了5毫升的配方，因此每个蜂群每次处理的总喷液量分别为约45毫升。相应地，每次处理每个蜂群递送的精油总量分别为约2.25毫克、4.5毫克和9毫克，对应于50、100和200 ppm的处理。实验涉及55个自然感染Varroa destructor的蜜蜂蜂群。在实验开始前大约五个月内，这些蜂群没有接受过任何Varroa控制措施。实验蜂群包括三种精油，在三个浓度水平（50、100和200 ppm）下进行了评估，每种油-浓度组合分配了五个蜂群（总共45个蜂群）。此外，还包括一个用阿米特拉唑（amitraz）处理的阳性对照组（5个蜂群）和一个阴性对照组（5个蜂群）。阿米特拉唑（N-甲基-双（2,4-二甲苯亚胺甲基）胺）是土耳其合法批准的控制Varroa螨虫的活性物质。阳性对照组的蜂群接受了含有20毫克阿米特拉唑的条带（Vamitrat-VA?），按照?züi?li和Baykal?r（2024年）描述的方法施用。

所有处理在0天、7天、14天、21天和28天以7天的间隔进行了五次。包括未经处理的对照组，以便区分处理引起的螨虫死亡和由于蜂群的防御机制（如梳理和卫生行为）导致的自然螨虫减少。在整个试验期间，每周记录对照组蜂群中自然掉落的螨虫数量。在研究结束时，对所有蜂群采用了相同的最终处理方案，以确保蜂群管理的均匀性（Bava等人，2025年）。

成年工蜂中的Varroa destructor侵染水平是通过含有大约100只工蜂的样本中每10克蜜蜂的螨虫数量来确定的（Karapetkovska-Hristova等人，2024年）。使用Seven-?akmak（2017年）描述的糖滚动方法评估了侵染水平。简而言之，大约10克成年工蜂被放入一个带细网盖的玻璃罐中，加入20克糖粉，然后轻轻摇晃罐子两分钟以使螨虫脱落。然后将罐子倒置在一张白纸上，并计数脱落的螨虫。计数后，蜜蜂被放回原来的蜂群中。

在每次处理之前以及第0天、7天、14天和28天，立即测量了Varroa侵染水平。侵染水平表示为每10克蜜蜂的螨虫数量，并根据Güne?do?du和Abac?（2025年）的方法计算如下：
$$\:Infestation\:Level\:\left(varroa\:per\:10\:g\:of\:bees\right)=\frac{Total\:EquationNumber\:of\:dislodged\:Varroa\times\:10}{Net\:weight\:of\:bees}$$ （1）

每次评估日（7天、14天、21天和28天）的处理效果根据Güne?do?du和Abac?（2025年）计算如下：
$$\:{\text{\%}Efficacy}_{t}=\frac{{I}_{0}-{I}_{t}}{{I}_{0}}\times\:100$$ （2）

其中；\({I}_{0}\)代表第一次处理之前的侵染水平，\({I}_{t}\)代表在时间t测量到的侵染水平。

使用涂有凡士林的白纸放置在花粉抽屉中，这种方法广泛用于有效监测螨虫（Calderone和Lin 2003年）， additionally监测了掉落的Varroa螨虫。在每次处理后的第1天、第3天和第5天记录了掉落的螨虫数量，这些数据展示在图5中。这些测量结果与第0天、第7天、第14天和第28天进行的侵染评估无关（图4）。

所有统计分析都是针对糖滚动、螨虫掉落和Varroa侵染数据集进行的。在进行推断分析之前，使用Shapiro–Wilk检验评估数据的正态性。由于获得的p值大于0.05，因此认为满足正态分布的假设。使用单因素重复测量分析方差（repeated measures ANOVA）分析测量参数的时间变化。使用Mauchly的球形性检验评估球形性假设。当假设得到满足时（p?>?0.05），解释标准结果。当假设被违反时（p?
结果
GC-MS分析显示，百里香、桉树和薄荷精油（EOs）表现出主要的单萜化合物的独特谱型。百里香油中的主要成分是carvacrol（33.94%），其次是α-pinene、linalool、d-limonene和p-cymene。桉树油主要由eucalyptol（69.33%）组成，还含有少量的d-limonene、α-pinene、p-cymene和其他次要单萜。在薄荷油中，menthol是主要成分（39.70%），还有menthone异构体、neo-menthol、menthyl acetate和其他单萜衍生物（表2）。表2仅包括在精油中鉴定出的主要化合物，而更全面的化学谱型提供在表S2中。

表2 GC-MS测得的精油的主要化学成分及其数量（%）

纳米乳液的表征
在配方制备后，评估了制备的纳米乳液的物理性质，发现三种基于精油的配方之间的液滴大小存在显著差异（表3）。百里香纳米乳液（T-NEms）的液滴较大，平均直径约为123纳米。相比之下，薄荷纳米乳液（P-NEms；57.7纳米）和桉树纳米乳液（E-Nems；48.0纳米）产生的液滴明显较小。多分散性指数（PDI）值反映了粒径分布的均匀性，支持这些发现。P-NEms的PDI值为0.142，表明分布狭窄且均匀，而E-NEms和T-NEms的PDI值分别为0.359和0.544，表明粒径分布较宽，特别是T-NEms。所有NEms的粘度值相似（0.8872 cP），表明纳米乳液之间的流动行为没有显著差异。Zeta电位分析进一步支持了观察到的配方物理特性。

表3 精油纳米乳液的物理化学性质（Z-average、PDI、粘度）和基于DLS的粒径分布

纳米乳液的效果和螨虫动态
使用糖滚动方法测得的Varroa侵染水平，表示为每10克蜜蜂的螨虫数量，在表S3中总结（平均值±SEM，n=5）并在图1中说明。基线侵染水平（第0天）在处理组之间从29.8±6.37到38.8±2.48只螨虫/10克蜜蜂不等，实验开始时处理组之间没有显著差异（p?>?0.05）。重复测量ANOVA显示时间、处理及其交互作用的显著效应（p??0.05）。然而，在第21天和第28天出现了显著的处理效应（p?
图1
这个图像的替代文本可能是使用AI生成的。

平均值±SEM和不同处理及采样天数（T-NEms：百里香纳米乳液；E-NEms：桉树纳米乳液；P-NEms：薄荷纳米乳液；50、100、200：施加的剂量（ppm）；PC-Amitraz：阳性对照（阿米特拉唑）；C-No Dose：未经处理的对照）的Varroa侵染水平（每10克蜜蜂的螨虫）的统计比较

纳米乳液处理的疗效（%）是通过计算从第0天到第28天Varroa侵染水平（每10克蜜蜂的螨虫）的百分比减少来表示的，与阳性对照阿米特拉唑（53.5%）进行比较。所有纳米乳液剂量的疗效范围从62.7%到75.3%。T-NEms200组的疗效最高（75.3%）。相比之下，未经处理的对照组的Varroa侵染水平在同一时期增加了34.1%，表明对照组中没有抑制螨虫的效果（图2）。

图2
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处理疗效（%）是通过计算从第0天到第28天平均Varroa侵染水平（每10克蜜蜂的螨虫）的百分比减少来表示的。星号表示与基线侵染水平的显著差异（配对t检验；*p?
图3：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

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相关性矩阵显示了瓦罗阿螨侵害程度与纳米乳液处理、阳性对照（胺菊酯）以及未处理群体之间的关系。正相关性表明侵害程度具有相似的时间趋势，而负相关性反映了未处理群体中观察到的相反趋势。相关性分析说明了模式的相似性，并不意味着处理效果或剂量依赖性效应。

**T-NEms：百里香纳米乳液；E-NEms：桉树纳米乳液；P-NEms：薄荷纳米乳液；50、100、200：应用剂量（ppm）；PC-Amitraz：阳性对照（胺菊酯）；C-No Dose：未处理对照**

图4和表S4展示了28天实验期间记录的坠落螨虫数量。每周处理后的第1天、第3天和第5天收集坠落螨虫，并将计数相加，得到第0天、第7天、第14天、第21天和第28天的每周累积螨虫坠落值。重复测量ANOVA显示处理的效应非常显著（P<0.001），以及处理与日期的交互作用也显著（P=0.007），表明不同处理下的螨虫坠落动态随时间而异。整体的日期效应在统计上并不显著（P=0.075）。在所有采样日中，200 ppm的纳米乳液处理（T-NEms200、E-NEms200和P-NEms200）产生的累积螨虫坠落量显著高于低剂量和阳性对照。胺菊酯导致中等程度的螨虫坠落，但仍然显著低于最高纳米乳液剂量。相比之下，未处理对照组在整个研究期间表现出最小且稳定的自然螨虫坠落，证实处理群体中观察到的螨虫减少是处理引起的，而非自发的。

图4：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

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表5展示了处理后第0天、第7天、第14天和第28天所有实验组每日坠落螨虫计数（平均值±SEM）。

图5展示了处理后瓦罗阿螨数量在短期内的变化，通常称为“急性螨虫坠落”。如图所示，T-NEms200、E-NEms200和P-NEms200组在处理后的第1天和第3天表现出更高的螨虫坠落量，反映了处理后早期的螨虫动态差异。在所有处理中，螨虫坠落量在第5天显著下降，达到相似的低水平。这种模式表明，大多数与处理相关的螨虫坠落发生在应用后的前72小时内，而随后的计数反映了短期活动的减少而非持续的处理效应。基于坠落螨虫计数的统计分析证实了处理的效应（P<0.001）、时间的效应（P<0.001）以及处理与时间的交互作用（P<0.001），详见表S5。

表5：处理后第1天、第3天和第5天记录的瓦罗阿螨平均坠落数量，涵盖了所有采样期（0–28天）。

讨论

瓦罗阿螨是全球养蜂业面临的主要问题，已有大量研究致力于开发有效的控制策略。尽管培育基因抗性的蜜蜂品系（Guichard等人，2020年）似乎是有效的解决方案，但养蜂人更倾向于使用即时控制方法，因为基因选择是一个长期过程。化学处理虽然见效快，但对蜜蜂和人类健康都有风险。相比之下，精油提供了一种更可持续的处理方法。它们的复杂结构使得螨虫难以产生抗性（Bava等人，2025年）。百里香油通常从Thymus vulgaris L.中提取，但也可以从Thymus属的其他物种中提取（Radev，2022年）。最近的研究表明，精油的化学组成受植被周期、遗传背景、化学类型和环境条件的影响很大，同时不同物种、亚种以及提取相关因素也存在差异（Benomari等人，2023年）。百里香精油是一种复杂的混合物，含有超过70种成分，其中百里酚通常被认为是主要成分（56–60%），还有β-蒎烯、γ-萜品烯、α-蒎烯、石竹烯和其他成分，其相对比例因植物来源和环境条件而异（Hossain等人，2022年）。百里香油成分的变异性也在不同物种和地理来源之间得到记录；例如，Bisrat等人（2022年）报道Thymus schimperi油的主要成分是香芹酚和百里酚，并证实了百里酚和香芹酚的杀螨活性。同样，Hybl等人（2021年）确定了百里香油的主要成分是百里酚和β-蒎烯，而薄荷油的主要成分是柠檬烯、薄荷醇和其他单萜类化合物。在本研究中，GC–MS分析（表2）显示，百里香油、桉树油和薄荷油的主要成分分别是香芹酚、桉叶醇和薄荷醇，这与这些油类的成分变异性一致。先前的研究表明，基于纳米乳液的配方可能会改变精油成分的相对比例，通常会增加主要生物活性成分如薄荷醇或香芹酚的浓度（?zo?ul等人，2017年；Youssef和Abdelmegeed，2021年）。在此背景下，本研究中观察到的生物效应最好通过这些生物活性成分的主导地位及其通过纳米乳液系统的有效传递来解释。

桉树油对抗瓦罗阿螨的杀螨活性主要由桉叶醇（1,8-桉叶油）引起（Atmani-Merabet等人，2025年）。先前的研究报告了桉树纳米乳液的滴径处于纳米尺度范围，大约70–120纳米（Sharma等人，2021年；Cai等人，2023年；Barros等人，2025年）。同样，从富含百里酚、香芹酚和芳樟醇的百里香属物种制备的纳米乳液，其滴径通常在70至130纳米之间（?zo?ul等人，2017年；Wan等人，2019年；Elshamy等人，2020年；Mansouri等人，2021年；Moazeni等人，2021年；Abdelhamed等人，2022年；Doghish等人，2023年；Nasra等人，2024年）。对于薄荷油，其主要活性成分是薄荷醇和香芹酮，其滴径根据物种和配方不同，范围从大约50至200纳米不等（Zamaniahari等人，2022年；El-Naggar等人，2023年）。

总体而言，这些研究表明，精油纳米乳液的滴径通常在50–200纳米范围内，这被认为是稳定性和生物应用的最佳范围（Tadros等人，2004年；Solans和Solé，2012年；Jaiswal等人，2015年；Liang等人，2022年）。较小的滴径增加了表面积，可能有助于活性成分与目标生物体之间更有效的接触。然而，滴径大小本身并不决定稳定性或生物活性；它是几个影响因素之一（Liang等人，2022年）。

在本研究中，所有配方的滴径都在推荐的纳米范围内。这种尺寸分布可能有助于纳米乳液的动态稳定性，并可能增强了酚类成分（如百里酚和香芹酚）与瓦罗阿螨的相互作用。尽管如此，根据我们的数据，观察到的生物活性不能仅归因于酚类含量，而是纳米乳液的化学成分和物理化学性质的共同作用。

本研究中观察到的 Mentha piperita 和 Thymus vulgaris 油的有效性与已知唇形科植物的化学特性一致，这些植物富含含有杀螨活性的单萜类精油（Ramzi等人，2017年）。尽管桉树（Eucalyptus globulus）属于桃金娘科，但其精油也显示出对瓦罗阿螨的显著控制潜力，因为它们含有类似的生物活性成分（Kouache等人，2017年；Aglagane等人，2021年；Bisrat等人，2022年）。实验室和田间研究同样报告了薄荷和百里香应用后强烈的螨虫死亡率，尤其是在纳米配方中（Hybl等人，2021年；El Roby等人，2023年；Gamal Eldin等人，2024年）。

与强调富含香芹酚的精油有效性的报告一致（Ramzi等人，2017年；Khajehali等人，2023年），我们的结果显示T-NEms200在测试配方中表现出最高的杀螨活性。这种更高的有效性可能归因于其富含香芹酚的成分和纳米乳液配方的共同作用，这可能增强了分散性和与螨虫的接触。较小的滴径增加了表面积，促进了活性成分与目标生物体之间更有效的相互作用，从而提高了生物活性（Leong等人，2009年）。在其他剂量下观察到的中等效果也与文献一致，表明基于精油的产品在商业上的表现存在差异（Bava等人，2024年；Reyna-Fuentes等人，2025年）。尽管多项研究表明增加剂量会伴随更多的螨虫坠落（Conti等人，2020年），但应用时间和配方的差异可能解释了实验间效果模式的变化（Bakar等人，2017年；tüko?lu等人，2012年）。

多项研究报告称，未处理对照组中的螨虫数量显著增加（Narciso等人，2024年；Raza等人，2024年），这一趋势也在早期研究中观察到（Akyol和Yeninar，2008年）。这支持了我们处理组记录的生物减少的相关性。此外，与先前的发现一致，即最显著的螨虫减少发生在精油应用后不久（Ramzi等人，2017年；Güne?do?du和Abac?，2025年），我们研究中最高的减少出现在处理后的第一天。处理后第一天观察到的最大螨虫减少，随后第3天和第5天的螨虫数量降低，表明处理主要具有快速击倒效应，但随着时间的推移效果有限。关于胺菊酯效果波动的报道，可能与抗性的发展有关（Ayd?n和Giri?gin，2010年；Adjlane和Haddad，2017年；Ko?等人，2021年；Hernández-Rodríguez等人，2021年），进一步阐明了我们研究中阳性对照53.5%的有效性。

尽管越来越多地从潜在风险（Da Silva等人，2020年）和对蜜蜂的好处（Conti等人，2020年）两个方面评估精油，一些研究报道精油对蜂群健康没有不良影响（Narciso等人，2024年），但安全考虑应超越活性成分，包括配方成分。某些表面活性剂已被报告对蜜蜂具有毒性，并可能根据浓度和暴露途径影响蜂群健康（Shannon等人，2023年）。因此，在开发基于纳米乳液的杀螨剂时，仔细选择配方辅料至关重要。需要进一步的有针对性的研究来澄清活性成分和载体系统的长期生物农药性能和安全特性（Gostin和Popescu，2023年）。总体而言，我们的发现与越来越多的证据一致，支持植物来源化合物作为瓦罗阿管理的有希望的替代品（Ruffinengo等人，2014年）。从实际角度来看，精油纳米乳液具有几个优点，包括相对较低的生产成本和农业工业副产品的潜在价值。例如，从葡萄柚皮等植物材料衍生的纳米乳液配方已被报道为具有成本效益和可持续性的替代品，具有大规模生产的潜力（?i?ek等人，2024年）。然而，也应考虑某些限制。这种配方的应用可能耗时，特别是在强群中实现均匀分布可能具有挑战性。此外，尽管精油通常被认为是环境友好的，但由于其短暂的击倒效果，可能需要反复应用，这可能会引发关于潜在残留物积累和劳动力成本的担忧。因此，需要进一步的研究来优化应用策略，并在实际养蜂条件下评估长期可行性。杀螨治疗的田间效果受到季节性虫群动态和气候条件的显著影响。瓦螨（Varroa destructor）的繁殖依赖于可供利用的封盖虫幼虫，而虫幼虫数量的季节性变化已被证明会显著影响秋季的感染程度（Smoliński等人，2021年；Nürnberger等人，2019年）。春季和秋季气温升高可能通过影响蜜蜂数量和虫幼虫生产来促进螨虫种群的增长（Smoliński等人，2021年），而更广泛的季节性种群模式进一步突显了瓦螨动态的生态敏感性（Jack等人，2023年）。此外，邻近蜂群之间的迁移和盗蜜行为可能促进螨虫的水平传播和重新感染，尤其是在密集的养蜂场中（Peck和Seeley，2019年）。由于本研究是在一个特定的季节和单个养蜂地点进行的，所报告的功效值应在这一生态和空间背景下进行解释。此外，蜂群间的螨虫传播也可能影响了观察到的螨虫减少程度。迁移和盗蜜行为是促进螨虫在蜂群间移动的常见机制，在养蜂场环境中尤为明显，这可能影响田间实验中的螨虫种群波动（Peck和Seeley，2019年；Goodwin等人，2006年）。值得注意的是，邻近蜂群中螨虫数量的迅速增加与从受严重感染或濒临崩溃的蜂群中盗蜜有关，这可能抵消空间隔离的效果，使得治疗效果的解释变得复杂。此外，基于糖摇方法的螨虫定量可能因螨虫回收不完全而低估实际感染程度，因为在某些条件下，这种方法检测到的螨虫数量少于乙醇冲洗法（Owen等人，2022年）。因此，本研究报道的功效值应谨慎解读，因为生物因素（螨虫迁移和重新感染）和方法学限制都可能影响测得的螨虫减少量。本研究的另一个局限性是没有设置仅含载体的对照组（吐温80、乙醇和水）。尽管这些成分在纳米制剂中使用的浓度下通常被认为是惰性或毒性较低的（Islam等人，2020年），但它们对螨虫死亡的潜在物理作用不能完全排除。因此，观察到的效果应被视为基于精油的纳米乳液的整体性能，而不仅仅是精油的单独生化作用。未来的研究应包括载体对照组，以更清晰地区分制剂的效果。本研究的另一个局限性是未评估纳米乳液处理对成年蜜蜂、虫幼虫发育、蜂王表现或蜂产品中残留物的潜在急性或慢性影响。因此，这些发现应严格从杀螨效果的角度进行解释。进行全面的安全性评估是验证基于精油的纳米乳液在实际应用中的可行性的关键步骤。

结论

本研究表明，在测试条件下，含有百里香、薄荷和桉树精油的纳米乳液对瓦螨具有杀螨活性。制剂中的纳米级液滴大小可能有助于其物理化学稳定性，并可能增强活性化合物与螨虫的相互作用。在测试的制剂中，根据油的类型和浓度，观察到了效果上的差异。虽然这些发现表明基于精油的纳米乳液作为瓦螨管理的替代工具具有潜力，但结果仅限于本研究的实验条件。在推荐实际应用之前，还需要进一步的大规模和长期田间试验来评估其对虫幼虫阶段的安 全性、蜂产品中的潜在残留物形成以及整个蜂群层面的影响。