SARS-CoV-2广谱持久保护的多表位mRNA疫苗平台的临床前评估

《Frontiers in Immunology》：Preclinical evaluation of a multi-epitope mRNA vaccine platform for broad and durable SARS-CoV-2 protection

　　

摘要 引言： 免疫逃逸型SARS-CoV-2变异株的出现暴露了当前基于刺突（Spike）蛋白疫苗的局限性，特别是在保护广度和持久性方面，这凸显了对靶向保守病毒区域的下一代策略的需求。在此，研究人员描述了一种优化的多表位疫苗CoV2-BMEPu的设计和临床前评估。 方法： CoV2-BMEPu是利用SARS-CoV-2康复队列的免疫学数据合理设计的，整合了刺突（S）、膜（M）和核衣壳（N）蛋白的保守和免疫显性区域，以及与广谱中和抗体相关的选定受体结合域（RBD）片段。该构建体被设计为一种分泌型三聚体抗原，并作为一种mRNA疫苗以脂质纳米颗粒（LNP）配方递送。在细胞系统和小鼠模型中评估了体外表达、先天免疫激活、免疫原性和保护效力。 结果： mRNA-BMEPu在体外作为可溶性寡聚体高效表达，并在人巨噬细胞中触发先天免疫激活。在C57BL/6小鼠中，LNP-BMEPu诱导了针对祖先病毒和抗原性遥远的Omicron亚变体的强效结合抗体和中和抗体。疫苗接种还诱导了强效且多功能的CD8+T细胞和滤泡辅助T细胞（Tfh）反应，且这些反应随时间推移持续存在。在K18-hACE2转基因小鼠中，免疫接种提供了针对致死性SARS-CoV-2攻击的完全保护，有效控制了病毒复制并减少了肺部炎症。 讨论： 这些结果支持CoV2-BMEPu作为一种下一代多表位mRNA疫苗候选物，能够诱导针对当前和新兴SARS-CoV-2变异株的广泛、持久和保护性免疫。

论文解读：一种针对SARS-CoV-2广谱持久保护的多表位mRNA疫苗平台的临床前评估

研究背景与意义

截至2026年2月，COVID-19已导致全球超过7.79亿例确诊病例和700多万例死亡。尽管第一代基于mRNA技术的疫苗（如BNT162b2和mRNA-1273）显著降低了重症和死亡率，但其未能诱导 sterilizing immunity（消除性免疫），且由于有效性减弱和免疫逃逸变异株的不断出现，需要反复加强接种。绝大多数授权疫苗仅依赖高度易变的刺突（S）糖蛋白，特别是其受体结合域（RBD）的突变会损害疫苗诱导的中和抗体，限制了保护的广度和持久性。相比之下，对SARS-CoV-2康复个体的血清谱分析和表位定位研究确定了其他结构蛋白（如膜蛋白M和核衣壳蛋白N）中的保守和免疫显性抗原区域。先前的研究设计了合成多表位免疫原CoV2-BMEP，虽显示出潜力但因排除了RBD区域而受限。本研究在此基础上，报告了更新的免疫原CoV2-BMEPu，旨在通过整合来自S、M、N蛋白的免疫普遍存在的B细胞和T细胞表位以及选定的保守RBD区域，开发一种具有通用潜力的广谱保护性下一代疫苗策略。该研究成果已发表在《Frontiers in Immunology》。

关键技术方法

研究人员采用了多种关键技术方法。首先，基于康复者免疫数据进行了免疫信息学设计，利用IEDB资源预测HLA结合能力。其次，构建了包含T4噬菌体纤维状蛋白折叠结构域以促进三聚化的mRNA疫苗，并通过微流控溶剂置换法制备了脂质纳米颗粒（LNP）制剂。在体外，利用Western-blot、共聚焦显微镜和尺寸排阻色谱（SEC）验证了蛋白的表达与寡聚化。体内实验则使用了C57BL/6小鼠评估免疫原性，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和微量中和试验（MNT）检测体液免疫，利用多参数细胞内细胞因子染色（ICS）分析T细胞反应。最后，利用K18-hACE2转基因小鼠模型进行致死性攻毒实验，通过空斑试验和RT-qPCR评估肺组织病毒载量与炎症反应。

研究结果

1. CoV2-BMEPu的生物物理表征与体外表达

通过计算生物学分析，CoV2-BMEPu构建体（429个氨基酸，约45kDa）表现出良好的理化性质和广泛的HLA等位基因覆盖。AlphaFold 3结构模型显示其具有丰富的β-折叠N端结构域和α-螺旋C端结构域。Western-blot和共聚焦显微镜证实，mRNA-BMEPu转染HeLa细胞后能有效表达并分泌目标蛋白，且C端的T4纤维状蛋白折叠结构域促进了其三聚体和更高阶寡聚体的形成。尺寸排阻色谱进一步验证了单体、三聚体和六聚体形式的存在。此外，LNP-BMEPu转染THP-1分化的巨噬细胞后，显著上调了TNF-α、IL-6、IL-12及干扰素刺激基因（ISGs）的转录水平，表明其能有效激活先天免疫反应。

2. LNP-BMEPu在C57BL/6小鼠中诱导的SARS-CoV-2特异性体液和细胞免疫反应

在同源初免-加强免疫方案后，LNP-BMEPu组小鼠产生了显著高于对照组的抗S和抗RBD IgG结合抗体滴度。微量中和试验显示，该疫苗诱导了对祖先MAD6毒株的高效价中和抗体，且在加强免疫后52天（第80天）仍能维持。重要的是，在第80天检测到对Omicron亚变体（XBB.1.5, XBB.1.16, KP.3, JN.1）的交叉中和活性，NT₅₀滴度高达10³。细胞免疫方面，脾细胞在体外经肽库刺激后，显示出强烈的抗原特异性T细胞反应，主要由CD8⁺T细胞介导，针对S1和N肽库的反应尤为显著。这些CD8⁺T细胞表现出高度的多功能性，超过90%的细胞共表达2到4种效应分子（CD107a, IFN-γ, IL-2, TNF-α）。此外，还检测到了S和RBD特异性的滤泡辅助T细胞（Tfh）反应，支持了长效体液免疫的产生。

3. LNP-BMEPu疫苗接种在K18-hACE2转基因小鼠中的保护效力

在攻毒实验中，所有PBS对照组动物在感染后第7天达到人道终点，表现为快速体重下降和高病毒载量。相比之下，LNP-BMEPu免疫组小鼠存活率达到100%，维持了稳定的体重，未出现临床症状。病毒学分析显示，免疫组小鼠肺组织中未检测到感染性病毒，且SARS-CoV-2基因组（RdRp）和亚基因组（E）RNA水平极低。此外，与对照组相比，免疫组小鼠肺组织中代表“细胞因子风暴”的关键炎症介质（IFNγ, IL-6, CCL2, CCL12, CXCL10/IP-10）的转录水平显著降低，表明疫苗有效减轻了肺部炎症损伤。

结论与讨论

本研究表明，基于mRNA平台递送的多表位疫苗CoV2-BMEPu是一种极具前景的下一代候选疫苗。通过合理设计，将S、M、N蛋白的保守免疫显性区域与选定的保守RBD片段整合到一个分泌型三聚体抗原中，克服了单一依赖Spike蛋白的局限性。该疫苗在小鼠模型中诱导了强健且平衡的适应性免疫反应，其特征包括高效价的交叉中和抗体、多功能的CD8⁺T细胞以及持久的免疫记忆。在K18-hACE2转基因小鼠的致死性攻毒实验中，该疫苗实现了完全保护，有效抑制了病毒复制并缓解了肺部免疫病理损伤。这些发现支持CoV2-BMEPu作为一种能够诱导针对当前和未来SARS-CoV-2变异株的广谱、持久和保护性免疫的策略，为应对快速进化的病毒病原体提供了新的设计思路。