TRIB3基因过表达和干扰对牦牛乳腺上皮细胞脂质代谢的影响

《Frontiers in Veterinary Science》：Effects of TRIB3 gene overexpression and interference on lipid metabolism in mammary epithelial cells of yaks

　　摘要：TRIB3通常在体内作为脂质代谢的负调节因子，然而，关于TRIB3对牦牛乳腺上皮细胞（YMECs）中脂质代谢的影响知之甚少。因此，我们通过将过表达载体和干扰载体转染到YMECs中，研究了TRIB3在体外脂质代谢中的功能作用。结果表明，过表达TRIB3后，与牦牛奶脂质代谢相关的10个基因的mRNA表达水平显著下降（p < 0.01），总甘油三酯含量显著降低（p < 0.001），脂滴积累减少，p-Akt的蛋白表达水平也显著下降（p < 0.01）。加入Akt磷酸化激活剂SC76后，上述蛋白水平的下调作用减弱。干扰TRIB3后，与牦牛奶脂质代谢相关的9个基因的表达水平显著升高（p < 0.01），总甘油三酯含量显著增加（p < 0.01），脂滴积累增加，p-Akt（p < 0.01）、PPARg（p < 0.05）和p-mTOR（p < 0.01）的蛋白表达水平也显著升高。加入Akt磷酸化抑制剂MK2206后，上述蛋白水平的升高作用被逆转。这些结果表明TRIB3基因在YMECs中负调控脂质合成。TRIB3通过抑制Akt磷酸化来影响脂质代谢，这为进一步研究YMECs中的脂质代谢以及提高牦牛奶品质提供了理论基础。

1 引言：牦牛奶的脂肪含量在5.5%到7.2%之间，大约是普通牛奶的两倍（1）。此外，牦牛奶富含功能性脂肪酸（2）。二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）是牦牛奶中的独特营养成分（3）。脂质是牛奶的主要能量来源，占总能量含量的40-55%（4）。甘油三酯（TAGs）是牛奶脂肪的主要成分，占整个组成的95-98%，其次是二酰基甘油、磷脂、胆固醇和其他生物活性物质（5）。脂肪酸是甘油三酯合成的关键构建块；其组成受内部因素如个体遗传特征和生理条件以及外部因素如饲养管理和环境条件的影响（6）。牛奶中的脂肪酸主要来源于两个途径：直接从血液中吸收和在乳腺上皮细胞内从前体物质合成（7）。乳腺上皮细胞中的脂肪合成和分泌过程包括四个阶段：从头脂肪酸合成、甘油三酯形成、滴液组装以及随后包装进入分泌囊泡后释放（8）。这些过程涉及多个关键基因和转录调节因子，这些因子的表达变化可导致这一生物过程的变化。Tribbles（TRIBs）基因属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶样蛋白基因家族，最初在果蝇中发现，是一种能够诱导凋亡并抑制有丝分裂的核基因（10）。Tribbles家族成员属于假激酶蛋白，已在哺乳动物中鉴定出三个同源物，包括TRIB1、TRIB2和TRIB3，它们都含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶样结构域（11）。TRIB3在多个信号传导通路中起调节作用（12）。它可以通过促进其他蛋白质的降解和泛素化来调节蛋白质活性，因此作为一种调节蛋白发挥作用（13）。许多研究表明，TRIB3基因还参与肝脏（14）和骨骼肌（15）中的葡萄糖代谢调节。此外，它还参与脂质代谢（16）。TRIB3主要通过强烈抑制Akt磷酸化来影响脂质代谢，从而影响胰岛素信号通路，抑制脂质代谢、葡萄糖代谢和其他关键功能机制（17）。TRIB3通过与Akt的Thr308和Ser473位点的磷酸化位点结合来抑制Akt的磷酸化。Akt的磷酸化影响下游靶标的活性，包括由mTOR复合体2（mTORC2）和3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）调控的Thr308位点（18）。然而，并非所有细胞类型都如此。研究表明，在淋巴细胞中过表达TRIB3并不抑制Akt的Thr308位点的磷酸化（19）。TRIB3可能选择性抑制肾小管细胞中Akt的Ser473位点的磷酸化。TRIB3与Akt之间存在相互作用，通过抑制Akt的磷酸化水平来负调节Akt信号通路。此外，许多研究关注TRIB3对参与脂质代谢的基因的影响。例如，Qi等人发现乙酰辅酶A羧化酶（ACACA）是脂肪酸合成的限速酶，TRIB3可以促进ACACA的降解，从而减少细胞中游离脂肪酸的合成，降低细胞内脂质水平，并进一步促进脂肪分解（12）。其他研究表明，TRIB3在脂肪细胞中的表达可降低PPARg的mRNA水平和细胞内甘油三酯水平，而通过RNA干扰抑制TRIB3表达可增加PPARg的mRNA水平和细胞内甘油三酯水平（20）。总之，许多研究结果表明，关于TRIB3在脂质代谢中的研究主要集中在TRIB3与参与脂肪酸代谢的关键基因之间的相互作用。在细胞水平上，TRIB3通过下调参与脂质代谢的关键基因的mRNA和蛋白表达来负调控脂质代谢（8）。目前，关于反刍动物中TRIB3基因的研究相对较少，针对牦牛的研究更为少见。TRIB3在牦牛乳腺上皮细胞（YMECs）中调节脂质代谢的机制尚不清楚。因此，在本研究中，使用YMECs作为实验材料，通过构建TRIB3干扰和过表达载体并应用基因过表达和干扰技术，分析了TRIB3基因对牛奶脂肪代谢的影响。通过过表达和干扰YMECs中的TRIB3基因，分析了与牦牛奶脂肪代谢相关的基因，包括三个参与从头脂肪酸合成的基因：乙酰辅酶A羧化酶（ACACA）（21）、脂肪酸合成酶（FASN）（22）和硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）（23）。还分析了六个与脂肪酸摄取和转运相关的基因：酰基辅酶A合成酶短链家族成员2（ACSS2）（24）、脂肪酸结合蛋白3（FABP3）（25）、脂肪酸结合蛋白4（FABP4）（26）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员1（ACSL1）（27）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）（28）和脂蛋白脂肪酶（LPL）（29）。此外，还分析了三个与甘油三酯合成和脂滴积累相关的基因：甘油-3-磷酸酰基转移酶线粒体（GPAM）（27）、二酰基甘油酰基转移酶1（DGAT1）（30）和Perilipin 1（PLIN1）（27）。还分析了三个与脂肪酸相关的转录因子：过氧化物酶体增殖激活蛋白（PPARg）（31）、固醇调节元件结合蛋白切割活化蛋白（SCAP）（32）和胰岛素诱导基因1（INSIG1）（33），以及它们对YMECs中AKT、mTOR和其他蛋白质的表达水平、总甘油三酯含量和脂滴积累的影响。旨在为阐明TRIB3基因在牦牛乳腺上皮细胞中调节牛奶脂肪代谢的机制提供理论基础。

2 材料与方法
2.1 实验动物和组织样本的收集：从中国青海省的一个屠宰场选择了三头处于第二哺乳期、产奶70天的健康牦牛。屠宰后立即收集乳腺组织，并迅速在液氮中冷冻以备后续分析。本研究中使用的原始牦牛乳腺上皮细胞（YMECs）之前已根据先前描述的方法在中 Laboratory 中分离和培养（34）。TRIB3基因的克隆、测序和序列分析已在之前的工作中完成，并已报告（35）。
2.2 构建过表达载体pcDNA3.1-TRIB3：根据牦牛TRIB3基因的克隆和测序结果，使用Oligo 7软件设计了包含Hind III和Xba I限制性位点的特异性引物对。上游和下游引物的序列如下：
F: CCCAAGCTTATGCGAGCAAGCCCCC;
R: GCTCTAGATCAGCCATAGAGACCCATATCTCTTTCT.
（基因ID：102288142）。PCR反应体系包括1 μL 10 μM的上游引物、2 μL pMD19-T-TRIB3质粒、10 μL 2× Primer Star MAX酶和11 μL灭菌的ddH2O，总体积为20 μL。反应条件如下：预变性98°C 3分钟；(98°C 10秒，61°C 5秒，72°C 10秒) × 30循环；72°C 3分钟；样品保存在4°C。PCR反应结束后，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。电泳结束后，切下目标大小的条带，并使用DNA纯化和回收试剂盒（EG101-01, full gold）回收两端具有限制性位点的目标条带。从实验室保存的pcDNA3.1（+）质粒（V79020, Invitrogen）的细菌溶液中提取空质粒。然后使用高纯度质粒培养基试剂盒（EM101-01, full Gold）进行扩增。随后用Hind III（1060S, TAKARA）和Xba I（1093S, TAKARA）限制性酶在37°C下消化2小时，将目标条带与pcDNA3.1空载体连接，构建pcDNA3.1-TRIB3过表达载体。将连接的pcDNA3.1-TRIB质粒转化到DH5α E. coli感受态细胞（9,057, TAKARA）中。由于培养基具有Amp抗性，可以在固体培养皿中挑选出单克隆细胞，然后用液体LB培养至细菌溶液变浑浊以便检测细菌。将阳性质粒送至武汉奥克鼎盛生物科技有限公司进行测序，获得pcDNA3.1-TRIB过表达载体。该测试中的测序工作由该公司完成。
2.3 shRNA干扰载体的制备：
shRNA序列设计：根据TRIB3基因序列设计了四个相应的干扰片段，然后将其发送至上海桑贡生物公司进行合成。针对TRIB3基因不同位点设计的干扰片段见表1。干扰载体pSliencer3.0-H1用EcoR I和BamH I进行双酶消化，通过电泳检测和观察产物，然后切割并回收目标条带。Oligo片段被合成后溶解并稀释在ddH2O中。然后在干净的离心管中加入4 μL上下游引物和2 μL退火缓冲液（5×），放入PCR仪器中执行以下步骤：95°C, 5分钟；80°C, 4分钟；75°C, 4分钟；70°C, 4分钟；65°C, 2分钟；60°C, 2分钟；55°C, 2分钟；50°C, 2分钟；45°C, 2分钟；40°C, 2分钟；37°C, 2分钟；20°C, 20分钟。
表1 序列号 TRIB3-82-FGATCCGAGTGTCCCAGCCAGAAACAACTCGAGTTGTTTCTGGCTGGGACACTCTTTTTGTRIB3-82-RAATTCAAAAAGAGTGTCCCAGCCAGAAACAACTCGAGTTGTTTCTGGCTGGGACACTCGTRIB3-196-FGATCCTCCAGGCTTGGACCCTATGTTCTCGAGAACATAGGGTCCAAGCCTGGATTTTTGTRIB3-196-RAATTCAAAAATCCAGGCTTGGACCCTATGTTCTCGAGAACATAGGGTCCAAGCCTGGAGTRIB3-223-FGATCCCTGGGAACACAGCAGTGAATACTCGAGTATTCACTGCTGTGTTCCCAGTTTTTGTRIB3-223-RAATTCAAAAACTGGGAACACAGCAGTGAATACTCGAGTATTCACTGCTGTGTTCCCAGGTRIB3-1038-FGATCCGGAGGAAGGAGAAAGAGATATCTCGAGATATCTCTTTCTCCTTCCTCTTTTTGTRIB3-1038-RAATTCAAAAAGGAGGAAGGAGAAAGATATCTCTTTCTCCTTCCTCTG
shRNA序列：TRIB3.1的F：正向引物；R：反向引物；NC：负对照。
退火后的混合物稀释10倍，然后向离心管中加入以下组分：10×缓冲液1 μL、T4 DNA连接酶0.1 μL、退火混合物1 μL、酶消化后的载体13 μL，再补充ddH2O至20 μL。混合并离心后，在PCR仪器上于22°C下进行30分钟的反应。
将连接产物转化到DH5α、在LB固体培养基中过夜培养、选择单克隆抗体和摇菌、提取质粒和测序的步骤可参考过表达载体构建的相关步骤。
2.4 活化与牦牛乳腺上皮细胞的转染：
从冰冻保存的原始牦牛乳腺上皮细胞中取出后，立即在37°C的水浴中快速解冻。适当消毒和洗涤后，将细胞转移到生物安全柜中。加入适量的培养基，然后离心。细胞沉淀重新悬浮并接种到细胞培养瓶中。在显微镜下观察细胞密度和生长状态，将细胞密度较高的培养瓶以适当比例进行传代。所有细胞随后在CO?恒温培养箱中孵育，并定期更换培养基。适当时进行细胞传代，根据实验要求将一定数量的细胞接种到6孔板中进一步培养。当6孔板中的细胞汇合度达到80–90%时，进行药物处理实验。实验过程中，向细胞培养系统中添加Akt磷酸化激活剂SC76（3 μg/mL）或Akt磷酸化抑制剂MK2206（5 μM），孵育24小时以进行后续实验。与此同时，根据制造商的说明书使用Lipofectamine 2000进行了质粒转染。转染后，细胞培养36小时，并进行了Oil Red O染色。培养48小时后，提取总RNA进行实时定量PCR（RT-qPCR）分析和甘油三酯测量。此外，在转染24小时后，向培养体系中加入SC76（3μg/mL）或MK2206（5μM），并继续培养24小时。处理后，收集细胞进行随后的Western blot分析和与脂质代谢相关的实验。

2.5 反转录定量聚合酶链反应
转染48小时后，消化细胞并收集RNA（Life Technologies，编号15,596,018），通过反转录试剂盒（KR118，Tiangen）将其反转录成cDNA，然后通过RT-qPCR检测与脂质代谢相关基因的mRNA表达变化。共选择了15个与脂质代谢相关的基因，包括3个新脂肪酸合成基因（ACACA、FASN和SCD1）、6个脂肪酸摄取和运输基因（ACSS2、FABP3、FABP4、ACSL1、ACSL4和LPL）、3个与甘油三酯合成和脂滴积累相关的基因（GPAM、DGAT1和LPIN1）以及3个与脂肪酸相关的转录因子（PPARγ、SCAP和INSIG1）。β-actin被选为内参基因，每个基因的引物都被设计并发送到上海 Sangon Biological公司进行合成。具体的引物序列见表2。

表2 基因 NCBI访问ID 引物序列（5’-3’） Tm（°C） 产物长度（bp）
ACACA XM_005888 164.2 F: CCAGCAAAACAAAGCTACCCTG R: CAAACTTATCCCTTGCTCGGAA 60
FASN XM_005905 364.2 F: CTGAAGAACATCCTGGCCGATR: CACCAGGACGCACCGAATCCG 60
FABP3 XM_005906 169.2 F: CTGTCCCTTCAGCTAAGCCTAR: CCAGAGCCACAGTATTACGAG 60
SCD XM_00589 205.2 F: TTATCCGACCTAAGAGCCGAGAR: CACAGATACCACGGCACGAG 60
LPL XM_005902 304.2 F: GAACTGGATGGCGGATGAATR: AAGCCGGTTATCCTGTTGAC 60
ACSL1 XM_005906 554.2 F: GGCACCTTGAAGATCATCGACR: CCTGAGCGATAGGTTCACTCC 60
FABP4 XM_005897 260.2 F: AACCCACTTTGATCATCAGTR: GCACCTTCATCTAAGTTTACGAT 60
ACSL4 XM_005905 770.2 F: AGAAAAAGAGAAAATCTAAAAACGCR: TCTGCTCCAGGGATGTCTAT 60
ACSS2 XM_005900 428.2 F: GGCTCTGCACTCCATTGTGTR: GCCAGCTCCTTCAGGTTGACA 60
GPAM XM_005906 833.2 F: CACCAATACGATCCCGGACAR: GATAACGCCTCTTGCTATGCT 60
DGAT1 XM_01447 883.1 F: CCCTACTCCAAGCCCATCACCR: CTTCACCAGGGCTTGCACGTA 60
LPIN1 XM_005903 204.2 F: CTTCAGATGCGTTTAGTGACCR: CCTCGACATCGTCTTCGTTC 60
PPARγ XM_00590284.6.1 F: AGAGTACGCCAAGAATATCCCR: AGCATCGTGTAAATGATCTCG 60
INSIG1 XM_01448 135.1 F: TGGGCATCACCATCGCCTTR: TCCTATGTTCCCCACCGTCAC 60
SCAP XM_01448 331.1 F: ACGGGCATCAAGCTCTACTCCR: TCCCCGTAGTTCAGGTCCCAA 60
β-actin XM_005897 464.1 F: TGTTAGCTGCGTTACACCCTR: CTGTCACCTTCACGGTTCC 60

根据荧光定量试剂盒（FP205，Tianguan）的说明书，选择了20μL的反应体系来检测上述基因的mRNA表达。反应程序为95°C 15分钟；（95°C 10秒，60°C 20秒，72°C 20秒）共40个循环。

2.6 蛋白质提取和Western blot检测
将YMECs接种在6孔板上，培养至细胞融合度达到70-80%时进行质粒转染。根据实验设计，6孔板中的三个孔转染过表达质粒pcDNA3.1-TRIB3，其余三个孔转染空对照质粒pcDNA3.1-NC。同时，使用脂质体介导的转染方法分别引入shRNA-NC和shRNA-196质粒，以进行基因干扰实验。在转染过程中使用无血清培养基。加入转染复合物后，细胞进一步孵育5-6小时。然后弃去转染培养基，更换为正常的完整培养基继续孵育。转染72小时后，用胰蛋白酶消化细胞，收集并离心，弃去上清液。根据总蛋白提取试剂盒的说明提取总细胞蛋白，并测定蛋白浓度。蛋白浓度标准化后，样品变性，随后用于Western blot分析。使用的primers为抗-TRIB3（Proteintech，编号66,702）。第二抗体是HRP标记的山羊抗兔IgG（Bioss，中国）。

2.7 甘油三酯的测量
在6孔板中进行过表达和干扰质粒的转染。三个孔为实验组，转染过表达质粒；其余三个孔为对照组，转染空质粒pcDNA3.1-NC或shRNA-NC。转染后，细胞再培养48小时，用PBS洗涤3次。然后按照甘油三酯检测试剂盒（E1013，Prielei）的说明进行实验操作，测定细胞中的TAG浓度。

2.8 Oil red O染色
在12孔板上设置实验组（n=3）和对照组（n=3），然后用Oil red O进行染色。具体操作如下：
(1) 制作12孔板的细胞切片。用PBS配制浓度为2mg/mL的胶原溶液，并提前用胶原溶液处理切片，以促进细胞粘附并增强其粘附性。
每个孔加入1mL胶原溶液，在37°C下孵育30分钟。吸除胶原溶液，并用PBS洗涤几次。
(2) 将细胞接种在带有细胞切片的12孔板上并进行相应转染。培养36小时后，向每个孔加入适量的PBS缓冲液清洗细胞。
加入4%的甲醛，在室温下固定30分钟，然后用PBS洗涤超过10分钟，期间需要多次更换液体。
(3) 向12孔板中加入适量的60%异丙醇，浸泡1-2分钟。
(4) 向每个孔加入1mL工作液，染色10分钟。（Oil red O工作液的制备：向100mL异丙醇中加入0.5g的Oil red干粉，完全溶解。液体与ddH2O按体积比3:2混合，静置10分钟，用滤纸过滤，工作液需要现场混合。）
(5) 加入60%异丙醇冲洗2-3分钟，然后用纯水冲洗。
(6) 加入lapis lazuli蓝染色液染色3分钟，再用纯水冲洗。
(7) 用hematoxylin染色细胞核3-10分钟，然后用纯水冲洗，加入1%盐酸分化，再用纯水冲洗，加入1%氨水显蓝，最后用纯水冲洗。
(8) 取出细胞切片并用甘油明胶密封。在显微镜下观察，拍照并记录，收集Oil-red O染色的图片。

2.9 统计分析
数据使用SPSS软件（Ver.17.0，SPSS Inc.，芝加哥，美国）进行分析。单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）用于检测是否存在显著差异。图中的数值以平均值±SEM（标准误差）表示。多个组之间的差异通过单因素方差分析（ANOVA）及Duncan的多范围检验进行分析。p<0.05的差异被认为具有统计学显著性。图中不同的字母表示组间存在显著差异。

3 结果
3.1 TRIB3基因在乳腺上皮细胞中的过表达和干扰效率
将过表达质粒及其对照组以及不同的干扰质粒及其对照组分别转染到YMECs中。正常培养48小时后，通过RT-qPCR检测TRIB3基因的mRNA表达，结果如图1所示。结果显示，转染pcDNA3.1-TRIB3过表达质粒的YMECs中TRIB3 mRNA的表达水平远高于转染pcDNA3.1空质粒的YMECs（p<0.001；图1A）。过表达后，TRIB3 mRNA的表达增加了60倍以上，符合后续实验的要求，可供后续实验使用。与阴性对照组相比，TRIB3-196质粒对TRIB3的干扰效果最好，显著降低了TRIB3 mRNA的表达（p<0.001；图1B）。因此，我们选择了干扰载体shRNA-196作为后续干扰实验的材料。

图1 TRIB3在YMECs中的过表达和干扰效率。(A) YMECs中的TRIB3过表达效率。(B) YMECs中的TRIB3干扰效率。pcDNA(3.1)-NC：阴性对照组；pcDNA(3.1)-TRIB3：TRIB3过表达组。shTRIB3-NC：阴性对照组；TRIB3-82/196/223/1038：TRIB3干扰组。***表示非常显著的差异（p<0.001）；**表示非常显著的差异（p<0.01）；*表示显著差异（p<0.05）。

3.2 TRIB3过表达和干扰对YMECs中总甘油三酯含量的影响
将过表达质粒及其对照组、干扰质粒及其对照组分别通过脂质体转染技术转染到YMECs中。培养48小时后，提取并检测YMECs中的总甘油三酯。结果表明，TRIB3基因的过表达显著降低了总甘油三酯含量（p<0.001；图2A），表明YMECs中的脂质合成受到抑制。然而，TRIB3的抑制显著增加了总甘油三酯的含量（p<0.01；图2B），表明YMECs中的脂质合成增加。

3.3 TRIB3过表达和干扰对YMECs中脂滴积累的影响
将过表达质粒及其对照组、干扰质粒及其对照组分别通过脂质体转染技术转染到YMECs中，并在培养36小时后进行Oil red O染色。结果表明，TRIB3基因过表达后，YMECs中的脂滴形成减少，脂滴积累显著减少（图3A,B）。换句话说，TRIB3的过表达抑制了YMECs中的脂滴形成，脂滴积累显著减少。然而，干扰TRIB3基因后，YMECs中的脂滴形成增加，脂滴变大且积累显著增多（图3C,D），表明干扰TRIB3可以显著增加YMECs中的脂滴积累。

3.4 TRIB3基因过表达和干扰对YMECs中脂质代谢相关基因mRNA表达的影响
将过表达质粒及其对照组、干扰质粒及其对照组分别转染到YMECs中。正常培养48小时后，消化细胞并收集RNA。提取RNA并反转录成cDNA。使用RT-qPCR检测15个与脂质代谢相关基因的mRNA表达水平。结果显示，TRIB3基因过表达后，ACACA（图4A）、GPAM（图4C）和PPARγ（图4D）的mRNA表达水平显著下调（p<0.001），FASN（图4A）、ACSS2（图4B）、ACSL1（图4B）、LPL（图4B）、DGAT1（图4C）、LPIN1（图4C）和SCAP（图4D）的mRNA表达水平也显著下调（p<0.01），而FABP3（图4B）和INSIG1（图4D）的表达水平无显著变化。

3.5 TRIB3过表达和干扰对YMECs中p-Akt、T-Akt、PPARγ等蛋白表达水平的影响
为了研究TRIB3是否通过Akt信号通路调节脂质代谢，通过Western blot分析检测TRIB3、Akt、p-Akt和PPARγ的蛋白表达水平。如图5A,B所示，TRIB3在YMECs中过表达后，p-Akt的蛋白表达水平显著降低，而总Akt（T-Akt）的蛋白表达水平没有显著变化。与此同时，PPARγ的蛋白表达水平也降低了。图5(A,B)展示了TRIB3过表达对相关蛋白（TRIB3、T-Akt、p-Akt、PPARγ）表达的影响。(C,D)展示了TRIB3干扰对相关蛋白（TRIB3、T-Akt、p-Akt）表达的影响。***表示非常极显著差异（p<0.001）；**表示非常显著差异（p<0.01）；*表示显著差异（p<0.05）。TRIB3被干扰后，与对照组相比，p-Akt的蛋白表达水平增加，而T-Akt的表达水平保持不变（见图5C,D）。此外，TRIB3干扰后，PPARγ和p-mTOR的蛋白表达水平也增加，这表明TRIB3负调节Akt的磷酸化并影响下游信号分子。为了进一步验证TRIB3与Akt磷酸化之间的关系，使用了Akt磷酸化激动剂（SC76）和抑制剂（MK2206）。如图6A,B所示，SC76处理增加了YMECs中p-Akt和PPARγ的蛋白表达水平。然而，当TRIB3与SC76共同处理时，p-Akt和PPARγ蛋白表达的增加被减弱，这表明TRIB3可以抑制Akt的磷酸化。图6(A,B)展示了TRIB3与SC76共同处理对相关蛋白（T-Akt、p-Akt、PPARγ）表达的影响。(C,D)展示了TRIB3与MK2206共同处理对相关蛋白（T-Akt、p-Akt、PPARγ、p-mTOR）表达的影响。不同字母表示组间存在显著差异（p<0.05）。如图6C,D所示，MK2206处理降低了p-Akt的蛋白表达水平。TRIB3干扰与MK2206处理结合后，TRIB3干扰引起的p-Akt增加减弱，PPARγ和p-mTOR的表达水平也呈现下降趋势。这些结果表明，TRIB3通过抑制Akt的磷酸化来调节Akt信号通路，从而影响下游蛋白如PPARγ和mTOR的表达。

近年来，牦牛奶成为高原地区居民的一种无污染的绿色食品，受到越来越多人的喜爱。作为一种具有巨大开发和利用价值的原料奶，研究人员对牦牛奶进行了大量研究。甘油三酯是牛奶脂肪的主要形式，其组成和含量对乳制品的营养价值和风味具有重要意义。脂肪酸在乳腺上皮细胞中被吸收或合成，并通过酯化与甘油骨架结合形成甘油三酯，随后以脂滴的形式分泌到细胞外空间。因此，乳腺上皮细胞中的甘油三酯水平在一定程度上反映了牛奶中的脂质含量。在本研究中，牦牛乳腺上皮细胞中过表达并干扰了TRIB3基因。TRIB3基因过表达后，甘油三酯含量降低；而干扰后，甘油三酯含量增加，表明TRIB3基因在牦牛奶脂肪合成中起负调节作用。研究表明，在PPAR-1α的调控下，TRIB3通过影响Akt的功能来下调胰岛素信号通路。此外，Salazar等人的实验进一步证明TRIB3通过与蛋白激酶的Thr308和Ser473位点结合来抑制Akt的磷酸化。本实验中，TRIB3过表达后p-Akt的表达水平降低；TRIB3被干扰后，p-Akt的表达水平升高。通过添加Akt磷酸化激动剂SC76和抑制剂MK2206，进一步验证了TRIB3与Akt磷酸化之间的关系。该研究还证实TRIB3对Akt的抑制作用可以上调下游基因mTOR的蛋白表达。总之，TRIB3可能通过结合磷酸化的Akt来调节乳腺上皮细胞中的Akt信号通路，从而影响PPARγ和mTOR等下游蛋白的表达。

ACACA和FASN是奶脂肪合成过程中脂肪酸从头合成的关键酶。ACACA催化乙酰辅酶A（acetyl CoA）转化为马来酰辅酶A（malonyl-CoA），后者可作为脂肪酸链延长的碳供体，促进甘油三酯和磷脂的合成。随后，acetyl-CoA和malonyl-CoA分别与酰基载体蛋白的活性基团上的巯基共价结合，形成酰基载体蛋白和马来酰-马来酸单酰基载体蛋白，这一过程需要FASN的参与。此外，还会产生大量的中链和短链脂肪酸，这些脂肪酸可作为脂肪酸延长的原料。在关于奶牛乳腺脂肪合成基因的研究中，发现哺乳期间ACACA mRNA的上调程度高于FASN。本研究表明TRIB3可以调节与奶脂肪代谢相关的ACACA和FASN的表达，进而影响甘油三酯的积累。SCD主要参与单不饱和脂肪酸的合成。然而，本研究结果表明TRIB3无法调节牦牛乳腺上皮细胞中SCD的表达。LPL是TAG代谢途径中的主要限速酶，内源性脂肪酸的合成主要依赖于LPL从血液中摄取脂肪酸。FABP可以在体内运输长链脂肪酸（LCFA），并与酰基-CoA结合。在奶牛乳腺脂肪合成过程中，FABP3的主要功能是将脂肪酸运输到SDC作为相应反应过程的原料。本研究表明TRIB3可以调节LPL和FABP3的表达，从而影响甘油三酯的积累。ACSL的主要功能是激活脂肪酸。研究表明，在哺乳开始时，奶牛乳腺组织中ACSL1的mRNA表达显著增加。抑制ACSL4基因的表达后，脂肪细胞的增殖和分化效率提高，脂滴的积累也增加。ACSS2的主要功能是引导乙酸参与脂肪酸的合成，且仅存在于细胞质中。本研究表明TRIB3可以调节参与奶脂肪代谢的ACSL1和ACSS2基因的表达。GPAM和LPIN1参与甘油三酯合成的中间体的修饰和加工。DGAT可以在二甘油酯上添加酰基，最终合成甘油三酯，并可以直接催化SCFAs和中链脂肪酸合成甘油三酯。甘油三酯合成后聚集形成奶脂肪滴并分泌出来。哺乳期间DGAT1的mRNA表达显著增加，尤其是在哺乳早期。小鼠的研究发现，DGAT1的过表达或干扰对哺乳期间的甘油三酯合成影响较小；但在反刍动物中，DGAT1是构成TAG合成途径的多种蛋白之一，在增加牛奶中TAG含量方面起重要作用。本研究表明TRIB3可以调节参与甘油三酯合成的GPAM、LPIN1和DGAT1三个基因的表达，从而影响甘油三酯的积累。许多研究表明，甾醇调节元件结合蛋白（SREBP）在乳腺中起关键作用，可以调节奶脂肪的合成。SREBP1和2都以非活性前体形式存在于内质网膜中，进入细胞核并激活含有甾醇响应元件（如ACACA、FASN）的基因前，必须先被运输到高尔基体进行活化。SCAP是SREBP的锚定蛋白，可以阻止SREBP向高尔基体的运输。INSIG1和2通过与SCAP的氧化甾醇依赖性和非依赖性相互作用来调节SREBP1和2的活性，从而改变脂质生成的速率。实验表明，当INSIG1在肝脏中过表达时，SREBP的活性降低。PPARγ基因在奶脂肪合成中起重要作用，是转录调节因子和核受体网络的中心。目前研究发现PPARγ有许多靶基因，包括ACACA、FASN、LPIN1、DGAT1、SREBP和INSIG1。这些基因共同调节驱动脂质合成机制的基因激活，进而影响LCFA的代谢过程。本研究表明TRIB3可以调节两种与脂肪酸相关的转录因子PPARγ和SCAP的表达，从而影响牦牛乳腺上皮细胞中的甘油三酯积累。TRIB3还可以调节参与奶脂肪代谢的LPL、FABP3、ACSL1和ACSS2四个基因的表达，进而影响甘油三酯的积累。GPAM和LPIN1参与甘油三酯合成的中间体的修饰和加工。DGAT可以在二甘油酯上添加酰基，最终合成甘油三酯。DGAT1的mRNA在哺乳期间表达显著增加，尤其是在哺乳早期。当前的小鼠研究表明，DGAT1的过表达或干扰对哺乳期间的甘油三酯合成影响较小；但在反刍动物中，DGAT1是构成TAG合成途径的众多蛋白之一，在增加牛奶中TAG含量方面起重要作用。本研究表明TRIB3可以调节参与甘油三酯合成和脂滴积累的三个基因的表达。

综上所述，TRIB3通过抑制Akt信号通路，可以对牦牛乳腺上皮细胞中的脂质代谢进行调节。TRIB3在牦牛乳腺上皮细胞中的脂质代谢特性得到了初步阐明，为进一步研究YMECs的脂质代谢、优化奶脂肪代谢调控机制及提高牦牛奶品质提供了理论基础。