Griffon 鹰（Gyps fulvus）凝血检测的标准化：PT、aPTT 和第五因子（Factor V）的参考值

《Frontiers in Veterinary Science》：Standardization of coagulometric tests in griffon vultures (Gyps fulvus): PT, aPTT and factor V reference values

　　**摘要**

鸟类的凝血系统具有结构和功能特性，这些特性阻碍了将为人开发的商业诊断产品直接应用于鸟类。由于铅中毒或灭鼠剂中毒， Griffon 秃鹫（Gyps fulvus）经常被送往野生动物康复中心，表现出凝血障碍。由于缺乏参考区间和经过验证的凝血测量协议，这些障碍的诊断具有挑战性。本研究的目的是使用来自人类医学的诊断试剂来标准化 Griffon 秃鹫的凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（aPTT）和凝血因子 V（FV）的测量，并分析其性别、入院原因和体重之间的差异。使用半自动凝血仪和用于人类的标准校准试剂对 17 只健康个体的血浆样本进行了分析。建立了一种特定的协议，使用适用于 Griffon 秃鹫分析的人类诊断试剂来检测这些参数。在这些条件下，成功评估了 PT、INR 和 FV，从而可以确定参考区间，而 aPTT 值明显延长且变化很大。这些结果为准确评估 Griffon 秃鹫的凝血情况建立了标准化协议，这可能为其他鸟类提供参考。该协议可以改进对铅中毒或灭鼠剂中毒病例的临床随访，并最终有助于野生动物保护。

**1 引言**

止血是身体对血管损伤作出的生理反应（1–4）。这一过程可以分为两个阶段：初级止血，涉及血小板激活；以及次级止血，包括外源性或组织因子途径、内源性或放大途径和共同途径（3）。这些途径由称为凝血因子的特殊蛋白质组成，存在于血浆中（3）。通过测量凝血时间来评估这些途径的功能。外源性途径通过凝血酶原时间（PT）进行评估，同时也估计了因子 VII、V、X、凝血酶原、纤维蛋白原和纤维蛋白的活性。内源性途径通过活化部分凝血活酶时间（aPTT）进行评估，同时也评估了因子 XII、XI、X、IX、VIII、凝血酶原、纤维蛋白原和纤维蛋白的活性（5, 6）。此外，可以使用国际标准化比率（INR）来标准化 PT 的测量结果，同时也可以使用 aPTT 的比率。所有这些分析测试和单个因子活性的评估都是在柠檬酸钠处理过的血浆样本上进行的（6）。然而，PT 和 aPTT 在鸟类中的诊断性能和解释高度依赖于物种和使用的方法。最近关于床旁 PT 和 aPTT 的研究以及粘弹性研究强调了在推广哺乳动物参考区间或分析鸟类中的测定行为之前需要进行物种特异性验证的必要性（7–9）。

凝血因子 V（FV）是在凝血研究中经常评估的一个蛋白质，它由几个结构域组成，包括通过一个大的中央 B 域连接的光链和重链。FV 在止血中起关键作用，因为它参与了共同凝血途径，尽管它必须首先通过 B 域的切割被激活（FVa）。一旦被激活，FV 会与活化的因子 X（FXa）、膜磷脂和钙离子（Ca2+）一起形成凝血酶原酶复合物，从而催化凝血酶原（FII）转化为凝血酶（FIIa）（10）。

鸟类的凝血系统与哺乳动物相似（11），尽管鸟类的凝血时间通常较长（12–14）。基因组研究揭示了鸟类凝血因子的结构差异，包括凝血酶原（FII）（13）和组织因子（TF）（15–17）与哺乳动物的不同。鸟类还缺乏编码因子 XII 的基因，并且只保留了一个预激肽酶-因子 XI（PK-FXI）基因的拷贝。相比之下，哺乳动物有两个独立的基因（18–21）。因此，这些结构差异使得使用为人类设计的商业试剂来分析鸟类的凝血变得困难，因为这些试剂并未针对鸟类的使用进行优化（16）。在鸟类中，通过凝血酶原时间（PT）评估的外源性凝血途径被认为是主要且最具临床相关性的机制，而通过活化部分凝血活酶时间（aPTT）评估的内源性途径似乎起的作用较小，其临床意义不确定（7）。在鸟类中，PT 通常被认为是最具临床信息量的常规凝血测定方法，因为鸟类特有的接触途径差异可能会使 aPTT 的解释变得复杂。然而，最近的研究显示不同物种和分析平台之间的结果存在显著差异。这支持采取谨慎、基于验证的方法，而不是假设哺乳动物的测定结果可以普遍适用（7–9）。

鸟类凝血障碍的主要原因是肝脏疾病（22）、禽流感病毒感染（19, 23）、弥散性血管内凝血（24）以及灭鼠剂或铅中毒（25, 26）。据报道的 PT 改变取决于潜在的状况。在暴露于黄曲霉毒素的野生火鸡雏鸟中，PT 仅略有增加，从对照组的 10.24 ± 0.97 秒增加到 10.30 ± 0.80 秒、10.55 ± 0.50 秒和 10.76 ± 0.64 秒（22）。相比之下，感染高致病性 H5N1 病毒的鸡在感染后 12 小时和 24 小时的 PT 延长分别为 5.9 秒和 7.8 秒（23），而由红斑丹毒丝菌引起的弥散性血管内凝血则导致 PT 和 APTT 显著延长（PT 65.7 ± 14.4 秒；APTT 194.6 ± 101.8 秒 vs 对照组的 50.7 ± 13.8 秒和 82.4 ± 25.0 秒）（24）。猛禽维生素 K 缺乏的主要原因是接触了农业中使用的抗凝血灭鼠剂。这会抑制维生素 K 依赖性凝血因子的合成和激活（25, 27–30）。摄入这些灭鼠剂可能导致血肿、内出血、低血容量休克和死亡（27, 31, 32）。在猛禽中，抗凝血灭鼠剂的暴露是维生素 K 缺乏的主要原因，并可能严重延长凝血时间，中毒鹰的平均 PT 值为 125.63 ± 110.44 秒，而健康个体的平均 PT 值为 15.4 ± 2.9 秒（30）。最近的实地研究增加了对鸟类食腐动物（包括秃鹫等欧洲食腐物种）广泛接触第二代抗凝血灭鼠剂的担忧。这些研究还强调了潜在的亚致死生理效应。同时，当前的毒理学评论强调，由于阈值因物种、化合物、暴露情景和分析组织而异，解释残留物和确定凝血障碍或死亡的原因很困难（33–37）。

相反，由于摄入含有铅弹片的猎物残骸，食腐猛禽更容易发生铅中毒（38, 39）。多项在哺乳动物中的研究表明，铅会影响红细胞，导致贫血并增加血栓形成和心血管问题的风险（40–42）。因此，类似的效应也可能发生在与铅中毒相关的鸟类物种中。最近的合成研究证实，铅中毒仍然对全球的猛禽构成重大威胁，对保护和“同一健康”方法有重要影响。值得注意的是，来自西班牙的关于秃鹫的最新证据表明，减少与狩猎相关的铅暴露可以降低血液中的铅水平，即使残留暴露仍然存在。这强调了在康复和保护环境中改进临床监测工具的必要性（43, 44）。这些中毒事件导致许多食腐猛禽（包括各种秃鹫）被送往野生动物康复中心。然而，准确诊断鸟类的凝血障碍很困难，限制了治疗干预措施，导致死亡率升高和种群数量显著下降（25, 26, 38, 45, 46）。目前，缺乏特定于鸟类的试剂阻碍了最佳凝血测量方法的标准化，因为市场上只有为人医学设计的试剂。此外，缺乏确定的鸟类凝血参数参考值，无法明确区分健康个体和有潜在疾病的个体。因此，只能通过尸检来准确识别这些物种的出血障碍。因此，尽管在暴露监测和新鸟类凝血检测方法的发展方面取得了进展，但对于大型食腐猛禽（如 Griffon 秃鹫）的标准化的基于血浆的凝血测量协议和参考区间仍然不可用（7–9, 33, 47）。

本研究旨在通过评估 PT、aPTT 和 FV（共同途径的组成部分）来建立和标准化 Griffon 秃鹫（Gyps fulvus）的凝血参数，并确定参考范围。此外，还评估了这些参数根据性别、体重和入院原因可能存在的差异。

**2 材料和方法**

**2.1 研究设计**

本研究使用了来自 17 只成年 Griffon 秃鹫（Gyps fulvus）的血浆样本，所有这些动物在采血时都被认为临床健康（雄性，n = 10；雌性，n = 7）。这些 Griffon 秃鹫来自西班牙的不同地区，因其他野生动物康复中心的转诊或临床状况而被送往 Grupo de Rehabilitación de la Fauna Autóctona y su Hábitat (GREFA) （补充表 1）。血液是在常规兽医检查期间采集的，这些检查确认所选动物临床健康且适合放归。每只秃鹫的人口统计详细信息可以在补充材料中找到。

**2.2 伦理批准**

所有程序均按照相关指南和法规进行。由于所有样本都是在常规兽医诊断过程中获得的，因此根据西班牙法律法规（2013 年 2 月 1 日的皇家法令 53/2013 和欧盟指令 EU/2010/63），不需要当地动物实验伦理委员会的批准。

**2.3 采样**

血液被收集到含有 3.2% 柠檬酸钠（1:9 比例的柠檬酸钠和血液）的试管中，然后立即在 2,500 x g 的条件下离心 15 分钟以获得血浆。血浆被分装到标记好的 Eppendorf 试管中，每个分装管使用 10 μL 的血浆来创建混合血浆样本。所有样本都储存在 -80 °C 下。在凝血测试之前，血浆样本在室温下解冻 30 分钟。

**2.4 凝血测试**

使用基于粘度的机械凝血仪（Start Max II R，Diagnostica Stago S.A.S.，巴塞罗那，西班牙）按照制造商的说明分析了 Griffon 秃鹫的血浆中的 PT、aPTT 和 FV。将四个比色皿（Start 4 Cuve，Diagnostica Stago S.A.S.，巴塞罗那，西班牙）插入凝血仪，并向每个比色皿中添加金属球（Diagnostica Stago S.A.S.，巴塞罗那，西班牙）。所有试剂都按照制造商的说明进行复溶。一旦所有试剂都加入到比色皿中的样本中，反应自动开始并在 clot 形成时完成。结果以秒为单位表示，表示 clot 形成的所需时间。使用了 System Control N/P 试剂（Diagnostica Stago S.A.S.，巴塞罗那，西班牙）作为试剂的阳性 and 阴性对照。这种方法基于 De Pablo-Moreno 等人的描述（14）。

**2.5 凝血酶原时间分析**

使用 Neoplastin Cl+5（Diagnostica Stago，巴塞罗那，西班牙）进行 PT 的分析，其国际灵敏度指数（ISI）为 1.15。在使用前，试剂被复溶并在 37 °C 下预热。将金属球放入每个孔中并在 37 °C 下预热 3 分钟。然后向每个孔中加入 50 μL 的血浆样本。孵育 60 秒后，向每个孔中加入 100 μL 的 Neoplastin Cl+5。Owren Koller 缓冲液在使用前静置 30 分钟以进行稀释。单个样本的 PT 值以秒为单位表示，并以百分比表示，同时也表示为国际标准化比率（INR）值。INR 是通过将样本 PT 与参考 PT 血浆值（通过混合之前储存在 -80 °C 的所有单个分装样本生成）的比值并乘以 ISI 的幂来计算的。

首先，使用 1/1（无稀释）、1/2、1/3、1/4、1/6、1/9 和 1/12 的稀释度分析了 Griffon 秃鹫的混合血浆池。这些结果与 1/1、1/2、1/3 和 1/4 稀释度的商业校准品测量结果进行了比较。对于校准曲线，首先使用商业校准品（Unicalibrator）生成一条校准曲线，然后将其与从 Griffon 秃鹫血浆池的系列稀释结果生成的校准曲线进行比较。这些后续的曲线是通过两种方法生成的：一种是复制商业校准器的标准程序（1/1、1/2、1/3和1/4稀释），另一种是调整稀释比例以获得相似的斜率和稀释倍数之间的范围（1/3、1/6、1/9和1/12稀释）。最后，使用1/1和1/3稀释来分析兀鹫样本的个体时间。2.6 因子V分析为了评估FV水平，使用了缺乏FV的血浆（Sta-Deficient V，Diagnostica Stago，巴塞罗那，西班牙）和Neoplastin Cl+5（Diagnostica Stago，巴塞罗那，西班牙），其ISI为1.15。将金属球放入比色皿中，并在37°C下预热3分钟。复溶后，将Neoplastin Cl+5溶液均匀化，并在37°C下预热3分钟以备使用。Owren Koller缓冲液（Diagnostica Stago S.A.S.，巴塞罗那，西班牙）在稀释前放置至室温（30分钟）。然后，在比色皿中加入50 μL缺乏FV的血浆和50 μL待分析的样本，该样本事先已在Owren Koller缓冲液中稀释了1/10。经过60秒的孵育后，加入100 μL Neoplastin Cl+5以启动反应。结果以秒和百分比表示。首先使用1/10、1/20、1/40和1/80的稀释度分析狮鹫的血浆池，并将其结果与相同稀释度的商业校准器进行比较。2.6 因子V分析为了评估FV水平，使用了缺乏FV的血浆（Sta-Deficient V，Diagnostica Stago，巴塞罗那，西班牙）和Neoplastin Cl+5（Diagnostica Stago，巴塞罗那，西班牙），其ISI为1.15。将金属球放入比色皿中，并在37°C下预热3分钟。复溶后，将Neoplastin Cl+5溶液均匀化，并在37°C下预热3分钟以备使用。Owren Koller缓冲液（Diagnostica Stago S.A.S.，巴塞罗那，西班牙）在稀释前放置至室温（30分钟）。然后，在比色皿中加入50 μL缺乏FV的血浆和50 μL待分析的样本，该样本事先已在Owren Koller缓冲液中稀释了1/10。经过60秒的孵育后，加入100 μL Neoplastin Cl+5以启动反应。结果以秒和百分比表示。狮鹫的血浆池首先使用1/10、1/20、1/40和1/80的稀释度进行分析，并将其结果与相同稀释度的商业校准器进行比较。对于校准，使用商业校准器（Unicalibrator）生成校准曲线，并将其与之前使用相同方法从狮鹫血浆池制备的系列稀释度结果进行比较（1/10、1/20、1/40和1/80稀释度）。对于确定个体FV时间，使用了1/10的稀释度。2.7 活化部分凝血活酶时间分析通过将金属球放入所有比色皿中并在37°C下预热3分钟来评估aPTT。然后，在每个比色皿中加入50 μL未稀释的血浆样本和50 μL PPT Automate试剂（Diagnostica Stago S.A.S.，巴塞罗那，西班牙）。孵育混合物180秒后，加入50 μL 0.025 M CaCl2（Diagnostica Stago S.A.S.，巴塞罗那，西班牙）。结果以秒和样本值与血浆池值的比率表示。狮鹫的血浆池在1/1稀释度下进行分析，并将其结果与相同稀释度的阳性对照结果进行比较。由于存在国际标准，因此不需要校准曲线。2.8 参考区间使用SPSS版本27统计软件包（版本9.4；SAS Institute，Cary，NC，美国）进行统计分析，并使用Excel（Microsoft Office 365）创建校准曲线。应用Shapiro-Wilk检验来评估数据分布的正态性。进行协方差分析（ANCOVA）以评估体重（作为协变量）以及性别和入院原因对凝血时间和FV水平的影响。对FV、PT和aPTT变量进行了常见的描述性统计分析，包括最小值和最大值、平均值±2标准差（SD）、变异系数（%）和中位数。结果在P < 0.05时被认为具有统计学意义。3 结果3.1 校准研究为了确定PT和FV校准曲线的最佳稀释度，使用来自17个个体的柠檬酸化血浆样本池在不同稀释度下进行了多次测量，并与商业校准器进行了比较。同样，将aPTT与阳性对照进行了比较（表1）。表1 PT、FV和aPTT在不同建议稀释度下的测量结果。在狮鹫血浆池和商业校准器之间观察到PT测量的显著差异。兀鹫样本在等效稀释度下显示较长的凝血时间。此外，初始稀释度下的时间范围较短，随着稀释度的增加逐渐变宽。相比之下，兀鹫血浆池的FV测量结果与商业校准器的非常相似，特别是在较低稀释度（1/10和1/20）下。关于aPTT，差异更为明显，动物血浆池的凝血时间明显长于阳性对照。使用市售校准器和狮鹫血浆池生成了PT和FV参数的校准曲线，从最合适的初始稀释度开始。根据每次测试的凝血时间计算PT和FV的百分比。分析了稀释点之间的距离和所得曲线的斜率。在PT校准曲线（图1）中，观察到商业人类校准器和兀鹫血浆池之间的差异。兀鹫血浆池的1/1稀释度曲线（图1B）斜率较高（0.0022）；然而，稀释时间间隔较短（大约2秒），R2值为0.96，表明稳定性较低。这表明即使微小的技术变化也可能导致显著偏差。相比之下，使用1/3稀释度生成的曲线斜率较低（0.0005），但稀释时间间隔较长，表明稳定性更高，与商业校准器生成的曲线更为相似。较高的R2值进一步支持了更高的精度，减少了可能的技术变化对测量的影响。图1 PT校准曲线：(A) 使用市售商业校准器生成的PT曲线。(B) 使用兀鹫血浆池（通过混合所有个体的血浆获得）在1/1（左）和1/3（右）稀释度作为校准曲线的第一个测量点生成的PT曲线。缩写：PT：凝血时间。在FV校准曲线（图2）中，商业校准器和兀鹫血浆池在斜率和测量范围方面表现出非常相似的行为。此外，两条曲线的R2值接近1，表明稀释范围的初始点具有高度可比性，且响应稳定无变化。两种情况下获得的曲线几乎相同，这加强了测量的可靠性和再现性。图2 FV校准曲线：(A) 使用市售校准器生成的FV曲线。(B) 使用兀鹫血浆池（通过混合所有个体的血浆获得）在1/10稀释度作为校准曲线的第一个测量点生成的FV曲线。缩写：FV：因子V。最后，由于aPTT的结果仅以秒为单位表达，符合国际标准，因此不需要校准曲线。与商业对照相比，aPTT的测量时间长达五倍。3.2 统计研究进行了描述性分析，以评估性别和入院原因（补充表1）对动物体重的可能影响，使用ANCOVA，涉及PT、FV和aPTT变量。按性别划分，共有10个个体为雄性（58.8%）和7个个体为雌性（41.2%）。平均体重为8,194 ± 704.9克。关于入院原因，有6只兀鹫因铅中毒康复后被收治（35.3%），2只因创伤康复后被收治（11.8%），9只从其他康复中心转来（52.9%）。Shapiro-Wilk检验（P > 0.050）表明所有凝血变量呈正态分布。观察到aPTT值与入院原因存在统计学上的显著差异（P = 0.033），体重没有影响。因病理原因收治的兀鹫的平均aPTT值为268.06秒，而从其他中心转来的兀鹫的平均aPTT值为183.27秒。对于PT（图3），在1/1稀释度下的平均值±2SD为139.14% ± 543，中位数为56.56秒（53.75 ± 13.88秒；中位数50.9秒）。对于1/3稀释度，平均值±2SD为73.15% ± 29.90，中位数为68.26秒（58.94秒 ± 8.56秒；中位数60.1秒）。两种稀释度的PT数据还以INR表示，使用混合血浆样本作为参考：1/1稀释度为48.0秒，1/3稀释度为55.2秒。所得的平均值±2SD INR值分别为1.14 ± 0.34和1.08 ± 0.18，对应的中位数分别为1.10和1.07。图3 PT值的表示，显示最大和最小值。(A) 以秒表示的PT 1/1和PT 1/3。(B) 以百分比表示的PT 1/1和PT 1/3。(C) 对应于PT 1/1和PT 1/3的INR值。缩写：INR：国际标准化比率；PT：凝血时间。在1/10稀释度下的FV平均值±2SD为106.72% ± 89.60，中位数为99.36秒（26.59秒 ± 4.22秒；中位数26.5秒）。1/1稀释度的aPTT为208.42 ± 148.22秒，中位数为181.8秒。相应的比为1.12 ± 0.79，中位数为0.97（图5）。描述性统计数据显示了最小值、最大值、平均值±标准差（SD）、变异系数（%）和中位数。表2显示了各变量的描述性统计信息。个别测量数据在补充材料中提供。图4 FV值的表示，显示最大和最小值。(A) 以秒表示的FV 1/10。(B) 以百分比表示的FV 1/10。缩写：FV：因子V。图5 aPTT值的表示，显示最大和最小值。(A) 以秒表示的aPTT 1/1。(B) 以比率表示的aPTT。缩写：aPTT：活化部分凝血活酶时间。表2 变量最小值最大值平均值±2标准差（SD）变异系数（%）中位数% FV [1/10]*59.54208.09106.72 ± 89.6083.9699.36FV [1/10] (秒)22.7029.5026.59 ± 4.2215.8726.50% PT [1/1]17.46980.39139.14 ± 543390.2556.56PT [1/1] (秒)42.4068.9053.75 ± 13.8825.8250.90% PT [1/3]59.17120.6373.15 ± 29.9040.8662.86PT [1/3] (秒)47.4064.6058.94 ± 8.5614.5260.10INR [1/1]0.871.521.14 ± 0.3429.811.07INR [1/3]0.842.201.07 ± 0.1835.181.01aPTT [1/1]78.80323.50208.42 ± 148.2271.11181.80比率0.421.731.12 ± 0.7935.550.97变量FV、PT和aPTT的常见描述性统计信息。*括号中的数字表示样品的稀释度。4 讨论凝血系统是一个复杂的酶促反应级联，涉及大量成分，这些成分可能因不同原因（如铅或杀鼠剂中毒）而受到干扰（2, 3），这在食肉鸟类中很常见（25, 26, 32, 40, 45, 48, 49）。然而，由于缺乏经过验证的协议以及与哺乳动物止血系统的结构和功能差异，使用凝血测定法评估鸟类的凝血系统具有挑战性。这些差异可能会影响为人类设计的试剂的反应性，但不一定表明被测试物种的功能障碍。这一限制可能导致结果解释错误，从而影响受影响物种的诊断和适当治疗的实施（50）。在这项研究中，我们使用临床实践中常规使用的凝血仪分析和标准化了狮鹫（Gyps fulvus）的PT和aPTT凝血值以及FV水平。在不同稀释度下获得的PT值比哺乳动物更长。先前的研究在鸡（稀释度1/2）和美洲火烈鸟（稀释度未指定）中也报告了类似的结果，尽管数据分散度较高（16, 17）。与我们的钙凝血活酶PT测定法不同，一些研究使用了Quick的方法和粗制的鸡胚胎凝血活酶（CHT），得到的PT较短，以秒为单位报告为凝血时间，而不是以%的活性表示，并且没有标准校准曲线（51）。使用1/1、1/2、1/3和1/4稀释度生成的校准曲线显示，第一个和第二个稀释度之间只有2秒的差异（从48秒到50秒）。这表明轻微的时间变化可能导致PT百分比值的显著差异。因此，2秒的差异可能导致50%的差异，可能导致将凝血时间略有变化的健康个体误分类为不健康（14）。通过根据De Pablo-Moreno等人的方法（14）调整校准曲线来克服这一限制，使用1/3稀释度作为100%的参考点，1/6作为50%，1/9作为33%，1/12作为25%。这导致1/3和1/6稀释度之间的差异为17.3秒，确保了轻微的时间差异不会导致PT百分比值的显著变化。个别PT时间的平均值分别为53.75秒和58.94秒。这些值明显长于人类参考时间（10–14秒），但比其他野生鸟类（如美洲火烈鸟）的参考值（72.7秒）低18.93%。此前尚未在鸟类凝血分析中使用INR，但它可能在未来作为鸟类PT测量的参考参数。在人类中，国际标准化比率（INR）的参考值在0.8到1.2之间（14, 52, 53）。在这项研究中，最准确的数值是通过1/3稀释度下的凝血酶原时间（PT）测量获得的，这些测量的参数分散度较低，平均值更接近1。相比之下，因子V（FV）的平均值为106.72%，位于人类参考范围（50–200%）之内（54）。这些结果可能是由于使用了商用的FV缺乏试剂，尽管其他所有因子都过量存在。由于这种试剂包含了人类外源性途径的激活剂，并且是为人类血浆设计的，因此在鸟类中观察到的显著PT延长现象在FV分析中没有出现。这表明鸟类中PT延长的凝血时间是由FV之前的因子引起的。先前的研究表明，问题不在于V、VII或X等因子的浓度较低，而在于结构上的差异。哺乳动物组织因子（TF）试剂与鸟类血浆中的FVII反应可能不佳，导致难以形成完全活性的酶复合物并启动外源性途径（15–17）。鉴于本研究中的FV值在人类预期范围内，并且与PT的延长情况不同，这表明使用商用试剂测得鸟类FV的功能活性与人类相当。虽然没有关于 Griffon 秃鹫中FV 的具体表征数据，但在金雕（Aquila chrysaetos）中的研究表明，A1、A2、A3、C1和C2结构域的序列具有高度保守性，而B结构域的变性最大（55）。这表明Griffon 秃鹫中的FV可能与人类试剂有效相互作用，从而解释了所得数值的一致性。最后，aPTT凝血时间的分散度最大，平均值为208.43秒，高于人类的参考范围（25–45秒），比其他鸟类（如火烈鸟，97.5秒）的高出213.76%（17）。这些延长的aPTT时间与先前描述的鸟类内源性凝血途径的凝血时间一致。鸟类缺乏编码XII因子的基因，其凝血途径主要由FIX启动，而FIX由FXa-FVIIa复合物激活。在某些情况下，接触负电荷表面（如高岭土和硅胶）后，FXI也能启动凝血过程，这在常规凝血分析中有所应用（18, 21）。使用aPTT比例可以减少分散度并提高实验室和物种之间的可比性，类似于PT使用的INR。这种策略已应用于抗凝患者，以最小化因协议、操作员、技术和试剂差异引起的变异性（56）。此外，数据分析显示性别之间没有显著差异。然而，先前的研究（包括人类）观察到血小板聚集和凝血因子水平在性别之间存在差异，这主要是由于性激素（雌激素和睾酮）的影响（20, 57–59）。因此，这些差异在临床上并不明显。样本量较小（n）可能是导致没有显著差异的原因，而人类临床研究通常分析更多患者。可以推测，具有显著进化保守性的鸟类凝血级联反应可能表现出有限的性别相关激素调节；不过，目前还缺乏直接证据，而且凝血检测（特别是aPTT）的验证程度仅限于部分水平（7, 21）。关于入院原因和aPTT之间的关系，研究发现存在显著关联。值得注意的是，因铅中毒入院的患者（铅具有促凝作用，这一点在人类医学中也有描述）应表现出更短的凝血时间（40），但这在临床上并不被认为重要。因此，结果仅进行了描述性分析。关于体重，虽然一些研究报告了体重与凝血之间的相关性，但这种关联仅在肥胖病例中观察到。在这些病例中，慢性炎症通过炎症细胞因子激活促凝信号通路，从而增加凝血酶合成和血小板聚集（60）。在我们的研究中，所有分析个体的体重都在其年龄的正常范围内（6–10公斤），这可能解释了临床上没有显著差异的原因（61）。该研究的主要局限之一是样本量较小。与家养动物或实验动物不同，野生动物研究的难点在于难以获得大量样本，因为纳入样本通常是基于无法控制的原因（如医疗需要）。尽管如此，研究结果支持鸟类和哺乳动物凝血系统之间存在结构差异。然而，关于鸟类止血系统仍有许多未知之处。未来的研究可以通过寻找与商用试剂兼容的激活剂，并评估凝血变化来进一步探索这一领域。这有助于开发针对鸟类疾病的治疗方法，特别是那些受人类活动影响最大的疾病，并通过凝血监测为它们的保护和管理提供有意义的贡献。本研究建立了使用商用试剂测量Griffon 秃鹫（Gyps fulvus）凝血参数的最佳方案。1/3稀释度最适合评估凝血酶原时间（PT），而1/10稀释度被认为是测量因子V（FV）的最佳选择。由于无论性别或体重如何，凝血值均无统计学上的显著差异，因此为该物种提出了PT的参考值（以秒、百分比和国际标准化比率INR表示），以及FV的参考值（以秒和百分比表示）。对于活化部分凝血活酶时间（aPTT），参考值以秒和比率形式给出。这些结果使得使用适用于人类的商用试剂进行Griffon 秃鹫凝血检测的标准方案成为可能。这一方案可作为未来研究的参考，并可应用于其他鸟类的研究。此外，将这一方案应用于监测和诊断凝血障碍（包括由重金属或杀鼠剂引起的中毒）可能对野生鸟类的保护和管理具有价值。