Vericiguat 通过环鸟苷单磷酸（cGMP）-蛋白激酶 G 通路抑制基质金属蛋白酶 10（MMP-10），从而减轻血管钙化

《Journal of the American Heart Association》：Vericiguat Attenuates Vascular Calcification by Cyclic Guanosine Monophosphate‐Protein Kinase G Pathway Mediated Suppression of Matrix Metalloproteinase 10

　　**摘要**
**背景**
血管钙化（VC）是一种由血管平滑肌细胞（VSMCs）的成骨性转分化驱动的病理过程，显著增加了心血管死亡率。Vericiguat是一种可溶性鸟苷酸环化酶激活剂，已显示出对血管的保护作用，但其调节VC的作用仍需进一步研究。

**方法**
通过肾切除术或腺嘌呤饮食方法建立了VC模型。高磷酸盐浓度诱导了大鼠VSMCs和主动脉环的钙化。采用茜素红染色、钙量化、碱性磷酸酶活性检测和成像技术来评估VC。通过转录组分析及病毒载体技术研究了MMP-10（基质金属蛋白酶10）在Vericiguat调控VC中的作用。

**结果**
Vericiguat处理显著减少了肾切除诱导的大鼠和腺嘌呤诱导的小鼠的主动脉钙化以及VSMCs的成骨标志物。它还抑制了钙沉积以及VSMCs从收缩型向成骨型表型的转变。转录组分析表明MMP-10是关键介质；在VC模型中MMP-10表达上调，而Vericiguat可降低其表达。MMP-10的过表达会逆转Vericiguat的保护作用，慢病毒介导的MMP-10敲低实验也证实了其促钙化作用。机制上，Vericiguat通过增强cGMP-PKG（环鸟苷单磷酸-蛋白激酶G）信号通路（包括磷酸化的血管扩张剂刺激的磷酸蛋白和磷酸化的c-Jun（转录因子Jun））来下调MMP-10表达。

**结论**
Vericiguat通过调节cGMP-PKG-MMP-10轴抑制VSMCs的成骨分化并减轻VC。这些发现支持Vericiguat作为VC潜在治疗药物的潜力。

**非标准缩写和缩略词**
α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白
ALP：碱性磷酸酶
BMP2：骨形态发生蛋白2
CM：钙化培养基
ECM：细胞外基质
MMP-10：基质金属蛋白酶10
NO：一氧化氮
OPN：骨桥蛋白
PKG：蛋白激酶G
RUNX2：runt相关转录因子2
sGC：可溶性鸟苷酸环化酶
VASP：血管扩张剂刺激的磷酸蛋白
VC：血管钙化
VSMC：血管平滑肌细胞

**研究进展**
• Vericiguat作为可溶性鸟苷酸环化酶激活剂，在多种实验模型中减轻了血管钙化，并通过调节cGMP-PKG-MMP-10信号通路抑制血管平滑肌细胞的成骨分化。
• MMP-10被确定为血管钙化的一个先前未认识的介质，也是可溶性鸟苷酸环化酶激活的下游效应因子。

**下一步应解决的问题**
• 长期药理学抑制MMP-10是否能够减缓慢性肾病、糖尿病或心力衰竭患者的血管钙化进程，从而降低心血管事件的发生，这需要进一步研究。

**血管钙化（VC）的特点**
血管钙化的特点是在血管壁内异常沉积钙磷酸盐晶体。VC在慢性肾病、糖尿病和晚期动脉粥样硬化患者中十分普遍。VC与血管硬化和血流受阻相关，导致心血管发病率和死亡率升高。新兴证据表明，VC是一个受主动调控的病理过程，主要由血管平滑肌细胞（VSMCs）的成骨性表型转变驱动，这一过程类似于发育过程中的成骨过程。在高磷酸盐等促钙化刺激下，VSMCs发生表型转变并分泌多种成骨相关蛋白（如RUNX2、BMP2和ALP），最终导致VC。尽管VC具有临床重要性，但有效的药物治疗策略仍然缺乏。

**Vericiguat的作用机制**
Vericiguat最初因其独特的双重激活机制（独立于NO和依赖NO）而被批准用于治疗慢性心力衰竭。它通过这两种机制激活sGC：直接结合血红素和通过与NO协同作用稳定sGC。NO通过催化cGMP合成并激活PKG来发挥调节作用。在VICTORIA（Vericiguat全球心力衰竭研究）三期研究中，Vericiguat显著降低了高风险心力衰竭患者的心血管死亡率和住院率。此外，Vericiguat还能抑制血管炎症、氧化应激和细胞凋亡，这些因素都与VC的发展相关。最近的研究显示，激活的NO-cGMP-PKG信号通路有助于维持VSMCs的收缩表型和血管张力，因此Vericiguat可能通过该途径发挥保护作用。

**ECM重塑与VC的关系**
ECM重塑是VC和VSMCs表型转变的标志。在从收缩型向成骨型表型转变的过程中，VSMCs上调骨相关标记物的表达并分泌促进矿物质沉积的ECM成分（如I型胶原蛋白、纤维连接蛋白和OPN）。MMPs（特别是MMP-2、MMP-9和MMP-10）的失调进一步加剧了ECM的降解和重塑，导致血管硬化和钙化。cGMP-PKG通路在调节ECM重塑中起重要作用，但直接证明Vericiguat与之相关的证据尚少，需要进一步研究。

**本研究的目的**
我们在体外、体外和体内模型中探讨了Vericiguat对VC的作用，并揭示了其潜在的分子机制，重点关注cGMP-PKG信号通路及其对基质重塑酶的调控。通过鉴定关键介质（如MMP-10和c-Jun），本研究强调了Vericiguat作为缓解VC的潜在治疗策略。

**数据获取**
相关数据可向通讯作者索取。

**动物实验**
所有动物实验均获得南方医科大学珠江医院动物护理委员会的批准（批准号：LAEC-2025-031），并符合美国国立卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》（第8版，2011年）的规定。为减少雌激素对VC的影响，仅使用雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（160–200克）和雄性C57BL/6J小鼠（8周龄），这些动物在标准实验室条件下饲养（12小时光照/黑暗周期），并免费提供食物和水。

**模型建立**
1. **Renal models**：SD大鼠（n=6）接受两步肾 massa 减少手术（5/6肾切除），随后进行促钙化刺激。具体操作为：首先在腹腔注射戊巴比妥钠（50毫克/千克）后切除三分之二左侧肾脏，一周后切除右侧肾脏。手术后两周测量血清肌酐以评估肾功能。随后喂食高钙高磷饮食（1.0%钙，3.0%磷酸盐），并每天口服钙三醇（1微克/千克）8周。
2. **Arterial calcification models**：8周龄的C57BL/6J小鼠（n=6）随机分为对照组（标准饲料）和高腺嘌呤饮食组（0.25%腺嘌呤和1.2%磷酸盐）各12周。Vericiguat组小鼠每天口服Vericiguat（10毫克/千克）。为研究MMP-10的作用，将编码MMP-10的重组腺相关病毒（adeno-associated virus-MMP-10，OBiO Technology，中国）通过尾静脉注射。病毒注射后8周采集主动脉组织进行Western blot分析。MMP-10 cDNA构建的序列详见表S1。

**细胞培养**
1. **Primary VSMCs**：从2个月大的SD大鼠胸主动脉中分离VSMCs。先通过腹腔注射戊巴比妥钠（150毫克/千克）处死大鼠，然后在无菌条件下切除胸主动脉，去除外膜和内皮，将剩余组织切成约1平方毫米的片段。将这些片段置于含有DMEM培养基（添加20%胎牛血清、100微克/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素）的培养皿中，37°C下培养。后续实验使用第4至11代的VSMCs。钙化实验中，VSMCs在含2% FBS和2.6毫摩尔Na2HPO4的CM中培养3至7天（每2天更换培养基）。
2. **Recombinant vectors**：在VSMCs中转导携带MMP-10过表达构建的慢病毒载体或对照载体。为研究MMP-10的机制作用，使用针对MMP-10的短发夹RNA或非目标对照载体。慢病毒载体包含由巨细胞病毒立即早期启动子调控的MMP-10 cDNA序列，以确保稳定高效表达。转导过程中加入polybrene（6微克/毫升）以提高感染效率。24小时后更换含有10% FBS的新鲜DMEM培养基以减少细胞毒性。选择实验中，细胞用1微克/毫升嘌呤霉素处理。

**动脉环组织培养**
1. **Thoracic aortas**：如前所述，从通过腹腔注射戊巴比妥钠处死的大鼠胸主动脉中获取。
2. **Human arterial rings**：来自38岁男性捐赠者肢体截肢手术后丢弃的血管组织。使用这些组织进行研究需获得珠江医院伦理委员会批准（批准号2022SL0270），并根据法规和伦理指南免除个人知情同意要求。组织在无菌条件下切成3至5毫米的环状样本，置于含有10% FBS的DMEM培养基中培养。为诱导钙化，主动脉环在含3.2毫摩尔Na2HPO4的CM中培养8至10天。某些实验中，在整个培养期间加入10微克/毫升的Vericiguat。

**染色技术**
1. **Alizarin Red staining**：按标准协议对VSMCs和动脉组织进行茜素红染色。
2. **ALP activity assay**：使用商业ALP测定试剂盒测定ALP活性。提取的蛋白质样品随后与对硝基苯基磷酸盐底物和4-氨基反吡啶混合，并在37°C下孵育15分钟。反应通过添加铁氰化钾终止，然后使用微孔板读数器在520纳米处测量吸光度。ALP活性通过将结果标准化到总蛋白质浓度来计算，单位为每毫克蛋白质。

定量实时聚合酶链反应

总RNA使用Trijol试剂（TaKaRa，日本）按照制造商的方案从血管平滑肌细胞（VSMCs）中提取。RNA使用PrimeScript RT试剂盒（TaKaRa，日本）逆转为cDNA。定量实时聚合酶链反应在7500 FAST实时PCR系统（Applied Biosystems，美国）上进行，使用SYBR Green Premix（TaKaRa，日本）。相对mRNA表达水平使用2^-ΔΔCt方法计算，以GAPDH作为内部参考基因进行标准化。使用的引物序列列在表S4中。

使用微计算机断层扫描测量主动脉钙化程度

主动脉钙化的程度使用微计算机断层扫描按照既定方案进行评估。动物通过腹腔注射戊巴比妥（大鼠150 mg/kg，小鼠200 mg/kg）安乐死，然后迅速采集其主动脉并固定在4%的甲醛中。固定后的组织使用Siemens Inveon Micro-CT扫描仪以0.079毫米的分辨率进行扫描。获取的图像使用Siemens Inveon Research Workplace软件进行分析，以量化钙化程度。

血清生化分析

在5/6肾切除手术后两周，从大鼠和小鼠的眼静脉中收集血液样本，并离心以获得用于生化分析的血清。血清肌酐水平使用BioAssay Systems肌酐测定试剂盒（BioAssay Systems，美国）通过比色测定法确定。

cGMP的定量

使用商业cGMP ELISA试剂盒（Fankewei，中国）对VSMCs和主动脉组织中的cGMP浓度进行定量。样品准备时，VSMCs在含有蛋白酶抑制剂的冰冻PBS中裂解，通过3次冻融循环（-80°C至室温）实现细胞破坏。主动脉组织精确称重，切成约1平方毫米的碎片，并使用预冷的匀浆器在含有蛋白酶抑制剂的冰冻PBS（1:9 w/v）中匀浆。离心（10,000×g，10分钟，4°C）后，收集上清液进行分析。根据制造商的方案进行测定。简要来说，样品和标准品在抗体包被的孔中孵育，然后依次添加检测抗体和底物溶液。使用微孔板读数器在450纳米处测量吸光度，并根据标准曲线计算cGMP浓度。所有测量都重复进行两次，应用适当的稀释因子以确保准确量化。

Western Blot分析

使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液从VSMCs和动脉组织中提取蛋白质。根据制造商的说明，使用BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）确定蛋白质浓度。等量的蛋白质通过SDS-PAGE分离，并转移到PVDF膜上（Millipore，美国）。膜在室温下用5%脱脂牛奶或5%牛血清白蛋白封闭2小时，然后在4°C下与针对BMP2、RUNX2、OPN、α-SMA（α平滑肌肌动蛋白）、MMP-10、PKG、VASP（血管舒张剂刺激的磷酸蛋白）、p-VASP（磷酸化的VASP）、c-Jun（转录因子Jun）和p-c-Jun（磷酸化的c-Jun）的一抗孵育过夜。用TBST洗涤后，膜在室温下与HRP结合的二抗孵育2小时。使用增强化学发光试剂盒（Millipore，美国）检测蛋白质信号，并用Amersham Imager 600成像。使用Image J软件量化条带强度，以GAPDH作为加载控制。

RNA测序分析

根据制造商的说明，使用Trijol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，美国）从VSMCs中提取总RNA。使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美国）评估RNA的质量和完整性。使用寡核苷酸磁珠从总RNA中富集多聚腺苷化的mRNA，以特异性捕获成熟的mRNA转录本。然后将富集的mRNA逆转录为cDNA，随后在BGISEQ-500平台上进行文库制备和测序（BGI，深圳，中国）。基因表达水平使用每百万映射读数中的片段数方法进行量化。根据假发现率调整的Q值<0.05和绝对log2倍数变化>1.0的标准，鉴定差异表达基因。使用基因本体论和京都基因与基因组百科全书通路分析对差异表达基因进行功能富集分析。每个术语的富集比率计算为我们在研究中鉴定的候选基因数量除以相应数据库中与该术语相关的基因总数。

统计分析

所有连续变量均表示为均值±标准差。使用Shapiro-Wilk检验确定数据的正态性。对于两组之间的比较，对于方差相等的数据使用非配对双尾Student's t检验。方差不相等的情况下，应用Welch校正。对于不符合正态分布的数据，使用Mann-Whitney U检验。对于涉及>2组的比较，对于方差均匀的数据使用单因素ANOVA，然后进行Tukey的事后检验；否则，使用Kruskal-Wallis h检验，然后进行Dunn的事后检验。所有统计分析均使用SPSS软件（版本26.0）进行，P值<0.05被视为统计学上显著。

结果

**Vericiguat在体外和体外实验中抑制血管钙化**

为了评估vericiguat的抗钙化作用，将大鼠VSMCs和动脉环（大鼠和人类）在含或不含vericiguat的培养基（CM）中培养（图1A）。在VSMCs中，vericiguat处理（0.01–10 μM）以剂量依赖的方式显著减少了CM诱导的钙沉积，如Alizarin Red染色（图1B和1C）和定量钙测定（图1D）所示。Vericiguat还降低了CM诱导的ALP活性（图1E）。此外，vericiguat抑制了成骨标志物RUNX2和BMP2的mRNA和蛋白质表达，同时恢复了α-SMA的表达，表明保持了收缩表型（图1F和1G）。在体外模型中，无论是在CM中培养8到10天的大鼠还是人类动脉环都出现了明显的矿物质沉积，如Alizarin Red染色所示，而vericiguat处理显著缓解了这种情况（图S1A、S1B、S1F和S1G）。Vericiguat还降低了这些动脉环中的钙含量（图S1C和S1H）和ALP活性（图S1D和S1I）。此外，vericiguat下调了大鼠动脉环中的BMP2和OPN的蛋白质表达（图S1E）以及人类动脉环中的RUNX2和BMP2表达（图S1J）。这些发现表明，vericiguat在体外和体内实验中有效抑制了血管钙化和VSMC的成骨分化。

**Vericiguat在体内减少血管钙化**

为了评估vericiguat对血管钙化的体内效果，在大鼠（基于肾切除）和小鼠（基于腺嘌呤）中建立了慢性肾脏疾病相关的血管钙化模型。通过口服给药VERICIGUAT或生理盐水8周（图2A，图S3A）。升高的血清肌酐水平证实了两种模型中肾功能下降，提供了促进钙化的背景（图S2A和S2B）。微计算机断层扫描分析显示，与生理盐水对照相比，vericiguat处理的大鼠和小鼠的主动脉钙化显著减少（图2B，图S3B）。全载Alizarin Red染色进一步显示，vericiguat处理动物的主动脉中矿物质沉积减少（图2C，图S3C）。值得注意的是，主动脉的钙化程度沿主动脉呈階段性异质性。vericiguat处理显著减少了胸主动脉的钙化，而在升主动脉和肾下段仍存在轻微的矿物质沉积。此外，主动脉切面的Alizarin Red染色显示，vericiguat组的钙化明显减少（图2D和2E；图S3D和S3E）。同样，vericiguat处理的大鼠和小鼠的主动脉组织中的钙含量和ALP活性显著降低（图2F和2G；图S3F和S3G）。Western blot分析表明，vericiguat增加了收缩标志物α-SMA的表达，并降低了大鼠和小鼠主动脉中的成骨标志物OPN和BMP2的表达（图2H，图S3H）。总的来说，这些发现表明vericiguat有效减少了主动脉钙化并抑制了体内的血管钙化和成骨分化。

**MMP-10被vericiguat下调并被鉴定为潜在靶点**

为了进一步阐明vericiguat调节血管钙化的机制并识别其下游效应物，我们进行了RNA测序以表征vericiguat处理后VSMCs的转录谱变化。在GM、CM和vericiguat组中鉴定出23个差异表达基因，如Venn图（图3A）所示。这23个差异表达基因的Heatmap显示，与GM组相比，CM组中的MMP-10表达上调，而添加vericiguat组后显著降低（图3B）。基因本体论富集分析显示，与ECM和脂质代谢相关的多个细胞成分，如细胞外区域、细胞外空间和PCSK9-LDLR（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9-low-density lipoprotein receptor）复合体，在vericiguat处理的钙化VSMCs中显著富集，表明vericiguat可能在ECM重塑和胆固醇代谢中起作用（图3C；表S5和S6）。鉴于以胶原蛋白沉积和弹性蛋白降解为特征的ECM重塑是血管钙化的关键驱动因素，这些发现表明vericiguat可能通过调节ECM组成来影响VSMC的表型转换。此外，钙稳态和细胞骨架相关的细胞成分，包括肌球蛋白复合体、dystroglycan复合体和sarcoglycan复合体，在vericiguat处理的钙化VSMCs中也富集，进一步支持了vericiguat通过改变ECM来抑制VSMC成骨分化的假设。此外，京都基因与基因组百科全书通路富集分析显示，cGMP-PKG信号通路在vericiguat处理组中显著富集（图3D），这与vericiguat激活sGC和增强cGMP产生的已知作用一致。为了验证RNA测序结果，Western blot分析确认，与CM组相比，vericiguat处理组中的MMP-10蛋白水平在VSMCs和大鼠主动脉中显著下调（图3E和3F）。在小鼠中也观察到了类似的结果（图S4）。总之，这些发现表明，vericiguat在体外和体内都抑制了MMP-10的表达，可能是通过调节ECM重塑和VSMC的成骨表型转换来发挥其调节作用。

**MMP-10被vericiguat下调并被鉴定为潜在靶点**

为了进一步阐明vericiguat调节血管钙化的机制并确定其下游效应物，我们进行了RNA测序，以表征vericiguat处理后VSMCs的转录谱变化。在GM、CM和vericiguat组中鉴定出了23个差异表达基因，如Venn图（图3A）所示。这23个差异表达基因的Heapmap显示，与GM组相比，CM组中的MMP-10表达上调，而添加vericiguat组后显著降低（图3B）。基因本体论富集分析显示，多个与ECM和脂质代谢相关的细胞成分，如细胞外区域、细胞外空间和PCSK9-LDLR（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9-low-density lipoprotein receptor）复合体，在vericiguat处理的钙化VSMCs中显著富集，表明vericiguat可能在ECM重塑和胆固醇代谢中起作用（图3C；表S5和S6）。鉴于以胶原蛋白沉积和弹性蛋白降解为特征的ECM重塑是血管钙化的关键驱动因素，这些发现表明vericiguat可能通过调节ECM组成来影响VSMC的表型转换。此外，钙稳态和细胞骨架相关的细胞成分，包括肌球蛋白复合体、dystroglycan复合体和sarcoglycan复合体，在vericiguat处理的钙化VSMCs中也富集，进一步支持了vericiguat通过改变ECM来抑制VSMC成骨分化的假设。此外，京都基因与基因组百科全书通路富集分析显示，cGMP-PKG信号通路在vericiguat处理组中显著富集（图3D），这与vericiguat激活sGC和增强cGMP产生的已知作用一致。为了验证RNA测序结果，Western blot分析确认，与CM组相比，vericiguat处理组中的MMP-10蛋白水平在VSMCs和大鼠主动脉中显著下调（图3E和3F）。在小鼠中也观察到了一致的结果（图S4）。总之，这些发现表明，vericiguat在体外和体内都抑制了MMP-10的表达，可能是通过调节ECM重塑和VSMC的成骨表型转换来发挥其调节作用。数据以平均值±标准差（mean±SD）呈现，每组n=4-6个样本。cGMP表示环鸟苷一磷酸；CM表示钙化培养基；DEG表示差异表达基因；GM表示生长培养基；GO表示基因本体论；KEGG表示京都基因与基因组百科全书；IL-17表示白细胞介素-17；JAK/STAT表示Janus激酶/转录信号激活因子；MMP-10表示基质金属蛋白酶10；NADPH表示烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；PKG表示蛋白激酶G；PPAR表示过氧化物酶体增殖激活受体；TNF表示肿瘤坏死因子；VSMC表示血管平滑肌细胞。

MMP-10的过表达在体外和体内均促进血管钙化（VC）。为了研究MMP-10在VC中的作用，我们通过慢病毒转导在大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）中过表达MMP-10，转导效率超过80%（图S5A）。MMP-10蛋白的过量表达通过Western blotting得到确认（图S5B和S5C）。功能上，MMP-10的过量表达显著增加了VSMCs中的矿物质沉积，这通过茜素红染色（图4A）及其定量分析（图4B）以及钙含量的升高（图4C）得到证实。此外，MMP-10过表达的VSMCs中的ALP活性也显著高于对照组（图4D）。而且，成骨标志物OPN和BMP2的蛋白质表达水平明显上升（图4E）。

为了进一步评估MMP-10在体内的VC作用，我们建立了一个小鼠模型，在SM22α启动子的控制下通过腺相关病毒介导MMP-10的过量表达，导致主动脉组织中 transcriptional activity 增强（图S6A）。Western blot分析确认了MMP-10蛋白的过量表达（图S6B和S6C）。茜素红染色显示，MMP-10过表达小鼠的整个主动脉和主动脉横截面的矿物质沉积显著增加（图5A和5B），定量分析表明茜素红阳性区域比对照组更大（图5C）。值得注意的是，检查的主动脉区域普遍观察到钙化增加，这与MMP-10过量表达的整体促钙化效应一致。一致地，MMP-10过量表达导致主动脉组织中的钙含量和ALP活性升高（图5D和5E）。此外，MMP-10过表达小鼠的主动脉组织中关键成骨标志物OPN和BMP2的蛋白质表达水平显著上升（图5F）。综合这些发现表明，MMP-10过量表达加剧了VSMC的成骨分化和VC。

外源MMP-10在体外逆转了vericiguat的抗钙化效应。为了研究MMP-10是否在体外介导vericiguat的抗钙化效果，我们在钙化条件下用vericiguat处理大鼠VSMCs，并在存在或不存在r-MMP-10的情况下进行了实验。茜素红染色显示，vericiguat显著减少了VSMCs中的钙沉积，而外源MMP-10的添加部分逆转了这一效应（图6A）。这一趋势通过茜素红染色强度的定量分析和钙含量的测量得到证实（图6B和6C）。此外，被vericiguat降低的ALP活性在r-MMP-10处理后显著恢复（图6D）。同样，外源MMP-10逆转了vericiguat在蛋白质水平上对成骨标志物OPN和BMP2的下调作用（图6E）。这些发现表明，vericiguat至少部分通过下调MMP-10来减轻VSMC的钙化。

Vericiguat激活了cGMP-PKG通路并抑制了c-Jun介导的MMP-10表达。为了阐明vericiguat抑制VC的分子机制，我们研究了其对cGMP-PKG信号通路和c-Jun介导的MMP-10表达的影响。ELISA结果显示，vericiguat处理显著增加了在钙化条件下培养的VSMCs中的细胞内cGMP水平（图7A）。相应地，vericiguat上调了PKG蛋白的表达，并促进了其下游靶标VASP的磷酸化，这一点通过Western blot和密度分析得到确认（图7B）。鉴于c-Jun是AP-1（激活蛋白-1）转录因子复合体的一个组成部分，调节MMP-10的表达，27, 28, 29, 31，接下来我们探讨了vericiguat对c-Jun激活的作用。生物信息学分析（JASPAR数据库）在MMP-10启动子区域识别出3个高亲和力的c-Jun结合位点（图S8），表明可能存在转录调控。一致地，vericiguat处理减少了VSMCs中的p-c-Jun（图7B），支持了PKG介导的c-Jun活性抑制作用。

为了在体内验证这些发现，我们分析了大鼠主动脉组织中的cGMP-PKG-p-c-Jun轴。Vericiguat给药增加了cGMP水平（图7C），并增强了PKG和p-VASP蛋白的表达，同时降低了两种动物主动脉组织中的p-c-Jun蛋白水平，这一点通过Western blot得到证实（图7D）。小鼠实验中也观察到了类似的结果（图S9）。综合这些发现表明，vericiguat激活了cGMP-PKG信号级联，并抑制了c-Jun的磷酸化，从而下调了MMP-10的表达。

本研究揭示了关于vericiguat对血管的几个关键益处：（1）vericiguat减轻VC并抑制VSMCs的成骨分化；（2）这些效应是通过激活cGMP-PKG信号级联来实现的，该级联抑制c-Jun的磷酸化并下调MMP-10；（3）MMP-10被确定为一种新的VC诱导因子。据我们所知，这是首次证明vericiguat直接减轻VC并阐明其潜在分子机制的研究。值得注意的是，这些发现扩展了vericiguat的治疗意义，表明其在VC中的更广泛应用。

近期临床试验已经证明vericiguat是一种有效的sGC刺激剂，可以降低高风险患者的心血管死亡率和心力衰竭相关住院率。然而，心力衰竭及其常见并发症（如慢性肾病、糖尿病和衰老）经常伴有VC，这进一步加剧了心血管风险。到目前为止，大多数关于sGC刺激剂的研究主要集中在它们在心力衰竭或肺动脉高压背景下的血流动力学和抗纤维化益处上。Vericiguat已被证明通过减轻氧化应激、内皮功能障碍和炎症来提供血管保护。值得注意的是，NO-sGC-cGMP-PKG信号通路的激活被证实有助于保持VSMCs的收缩表型。这些观察结果表明，vericiguat可能通过增强cGMP-PKG信号来抑制VSMC的成骨分化。我们的研究首次揭示了cGMP-PKG-c-Jun-MMP-10轴参与了vericiguat的抗钙化效应，从而扩展了其治疗范围，并提供了关于MMP-10在这一过程中的新机制见解。

VC是一个复杂的多因素过程，其特征是血管壁中异常的钙和磷酸盐沉积，通常伴随着ECM的重塑。在生理条件下，VSMCs保持ECM的完整性和血管张力。然而，在促钙化条件下，如尿毒症、高磷酸血症、氧化应激或衰老，VSMCs会发生成骨分化并分泌矿化的ECM成分。钙化在动脉树中表现出明显的区域性异质性，反映了血流动力学力量和血管壁组成的区域差异。升主动脉和肾下主动脉由于承受更高的机械应力、湍流和弹性-肌肉转变，即使在治疗干预下也更容易发生残余钙化。我们的转录组分析显示，vericiguat显著调节了参与ECM重塑和钙处理的基因，尤其是MMP-10。作为驱动ECM周转的关键酶，MMP-10降解了维持血管顺应性的结构蛋白，如弹性蛋白和胶原。其上调已知会通过促进矿物质沉积和结构弱化来促进钙化。在本研究中，主要在血管壁内检测到MMP-10的表达。相比之下，vericiguat在啮齿动物模型中始终下调了血管组织和VSMCs中的MMP-10表达，表明其对病理性ECM破坏和VC具有保护作用。这些发现与先前强调MMP介导的ECM重塑在血管钙化中的重要性的研究一致。此外，功能获得和丧失实验均证实了MMP-10的因果作用：过量表达加剧了钙沉积、ALP活性和RUNX2表达，而敲低则减弱了这些现象，从而验证了MMP-10作为vericiguat抗钙化作用的关键介质。

进一步地，vericiguat激活了经典的cGMP-PKG信号级联，这是血管稳态的中心调节器。cGMP-PKG轴在血管扩张、抗炎反应和内皮功能中已有充分的建立。我们的数据现在将其功能范围扩展到包括抑制VC。升高的cGMP水平触发了PKG激活和下游VASP的磷酸化——这些事件可能稳定了VSMC的收缩表型并抑制了它们的成骨分化。同时，vericiguat降低了c-Jun的磷酸化，c-Jun是参与成骨基因表达和MMP-10转录的关键AP-1亚单位。这些结果表明，vericiguat在多个层面中断了促钙化信号：通过PKG的上游作用，通过MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）/AP-1激活的中游作用，以及通过抑制MMP-10和成骨标志物的下游作用。尽管cGMP-PKG轴的作用日益受到重视，但其对MMP-10的直接影响仍不完全清楚。先前的研究已经证明cGMP信号可以通过ERK1/2和AP-1相互作用来调节各种MMPs。鉴于MMP-10启动子含有多个c-Jun结合位点，我们的发现支持了vericiguat通过PKG介导的c-Jun抑制来抑制MMP-10转录的合理模型。然而，细胞外MMP-10信号如何转化为细胞内成骨激活仍需进一步阐明。我们推测MMP-10介导的ECM降解可能释放了如TGF-β（转化生长因子β）和BMPs等基质结合生长因子，或改变了细胞-基质相互作用，从而激活了下游的MAPK/AP-1信号，促进了成骨基因表达和ALP的激活。这一假设为解释细胞外基质重塑与细胞内钙化信号之间的联系提供了潜在的解释。综合来看，我们的研究结果提供了有力证据，表明vericiguat通过抑制血管平滑肌细胞（VSMC）的成骨重编程和病理性细胞外基质（ECM）重塑来缓解血管钙化（VC），这一过程涉及激活的cGMP-PKG-c-Jun-MMP-10信号轴。然而，也应当认识到一些局限性。首先，尽管我们的发现提示MMP-10和ECM相关通路在vericiguat介导的VC缓解中起着关键作用，但仍需要进一步的机制研究（例如对这些目标的遗传或药理学干预）来确认因果关系，并阐明其与cGMP-PKG信号通路的相互作用。其次，我们的结论主要基于啮齿动物模型和体外实验，尽管这些模型具有价值，但可能无法完全反映人类VC的复杂性和异质性。第三，本研究无法明确MMP-10在VC中的细胞类型特异性贡献。鉴于血管壁内可能存在非VSMC细胞群（包括基质细胞或间质细胞），未来的研究需要使用细胞类型特异性的遗传模型（例如条件性敲除小鼠），以明确MMP-10在VC中的精确细胞来源和功能。第四，受试动物数量相对较少，且缺乏对vericiguat水平的直接药代动力学测量，这限制了确认其系统吸收和暴露-反应关系的能力。尽管所有接受治疗的动物都表现出一致的药效学反应，但未来仍需要进行基于液相色谱-串联质谱法的血清定量分析，以验证其系统暴露程度并增强研究的转化相关性。最后，动物中vericiguat的给药剂量和持续时间可能与临床方案不完全对应，这些结果的临床应用性需在未来的临床前或临床研究中得到验证。

**结论**
总之，我们发现vericiguat通过激活cGMP-PKG信号通路来下调MMP-10的表达，从而减轻VSMC的成骨分化并抑制VC的发展。这些发现揭示了vericiguat在延缓VC发展方面的新作用，超出了其已知的对心力衰竭的益处。尽管临床前结果令人鼓舞，但仍需进一步的临床研究来验证其在高风险VC患者中的疗效和安全性，以减少心血管事件的发生。

**资金来源**
本研究得到了中国国家自然科学基金[82200442]、广东省基础与应用基础研究基金（2025A1515010683）、广州市科技计划（2025A04J3768）以及广东省医疗器械协会研究基金（YZXH2025KT07）的支持。