人类心脏转甲状腺素蛋白淀粉样变性组织的三维可视化与蛋白质组学分析揭示了微血管病变和毛细血管阻塞现象

《Journal of the American Heart Association》：Three‐Dimensional Visualization and Proteomic Analysis of Human Cardiac Transthyretin Amyloidosis Tissue Reveals Microangiopathy and Capillary Occlusion

　　摘要
背景
转甲状腺素淀粉样变性（ATTR）是一种影响心脏和其他器官的退行性疾病。转甲状腺素（TTR）的聚集是ATTR病理的驱动力，但其机制尚不清楚。我们利用蛋白质组学和组织透明化技术研究了野生型（WT）人心脏（WT/WT）和V122I人心脏（V122I/WT）组织，以更好地理解TTR心肌病。

方法
使用来自患有晚期WT-TTR心肌病、晚期V122I TTR心肌病患者的快速冷冻心脏组织切片以及年龄匹配的对照样本。提取纤维和组织蛋白组，并通过自下而上的蛋白质组学方法进行分析。组织透明化采用基于月桂硫酸盐的脂质去除策略进行。利用间接免疫荧光染色技术，针对蛋白质组学鉴定出的目标进行染色。通过抗体和AmyTracker 480染色来观察TTR沉积物。利用冷冻电子显微镜（cryo-EM）表征ATTR纤维的结构。

结果
蛋白质组学分析显示TTR含量高，同时还检测到与淀粉样纤维相关的蛋白质，以及与血管生成、止血和补体级联反应相关的蛋白质。三维成像显示正常的微血管结构丧失，出现血管过度生成和血管生成不足的区域，以及由毛细血管血栓引起的微血管阻塞。ATTR纤维呈现矛头状折叠，并装饰有胶原蛋白VI（一种细胞外基质成分）。

结论
根据我们的成像和蛋白质组学数据，我们推测ATTR心肌病是一种由毛细血管床血栓炎症和异常血管生成再血管化驱动的微血管疾病。在这种模型中，毛细血管通透性的增加使得血管基底膜的成分暴露于错误折叠的TTR中，这些成分促进TTR的聚集并稳定淀粉样纤维。血管基底膜的充血阻止了适当的再血管化，随着时间的推移降低了心脏的负荷能力，最终导致心力衰竭。

非标准缩写和首字母缩略词
AD：阿尔茨海默病
AL：免疫球蛋白轻链淀粉样变性
ATTR：转甲状腺素淀粉样变性
COLVI：胶原蛋白VI
cryo-EM：冷冻电子显微镜
FCR：折叠变化比率
LTBP：胎盘转化生长因子-β结合蛋白
MS：质谱
PDB：蛋白质数据银行
SAP：血清淀粉样蛋白
PBS：三磷酸盐缓冲盐水溶液
TTR：转甲状腺素
WT：野生型

研究视角
新发现：
- 对转甲状腺素淀粉样变性心肌病患者心脏组织的蛋白质组学分析显示，与血管生成和止血相关的蛋白质水平较高，这表明这些过程中的缺陷可能在疾病进展中起作用。
- 与这一观点一致，对转甲状腺素淀粉样变性心肌病患者心脏组织的三维成像显示，正常的微血管结构丧失，出现血管过度生成和血管生成不足的区域，以及由毛细血管血栓引起的微血管阻塞。

下一步应解决的问题：
- 基于这些观察结果，我们假设转甲状腺素淀粉样变性心肌病是一种由毛细血管床血栓炎症和异常血管生成再血管化驱动的微血管疾病；验证这一假设可能会揭示转甲状腺素淀粉样变性心肌病的疾病进展机制以及转甲状腺素蛋白的非病理功能。

转甲状腺素淀粉样变性（ATTR）是一种进行性的退行性疾病，最初通常影响心脏和/或周围神经系统及自主神经系统，最终影响中枢神经系统。该疾病可以是遗传性的（常染色体显性遗传），也可以作为衰老的明显后果而偶发。当主要影响心脏时，如果不进行治疗，ATTR心肌病会在大约5到7年内发展成心力衰竭。药理学和遗传学证据表明，ATTR中的组织退化是由人类血浆蛋白TTR的聚集引起的。动力学稳定剂（如tafamidis）通过稳定TTR的四聚体状态，增加了TTR四聚体解离的能垒，从而抑制TTR的聚集，减缓了遗传性和散发性野生型（WT）ATTR心肌病的进展。尽管TTR主要作为全视黄醇结合蛋白的主要载体和甲状腺素的次要载体，但研究还表明TTR能够调节血管生成功能，包括通过Akt介导的肺肿瘤中的毛细血管生长和内皮细胞增殖。TTR四聚体已被证明可以增加低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）的表达，该受体在有序的血管生成中起关键作用，并部分通过Akt发挥作用。LRP1还参与淀粉样生成蛋白（如tau和α-突触核蛋白）的神经元内化，以及TTR-淀粉样β的转运，表明LRP1可能在ATTR的发展中起作用。有趣的是，V30M TTR已被证明可以在内皮细胞培养中下调许多促血管生成基因，这表明TTR四聚体的稳定性可能在TTR调节血管生成中起作用。事实上，用碘二氟沙林稳定的TTR四聚体治疗的小鼠阿尔茨海默病模型显示出比对照组减少的血管病理。进一步证据表明，原发性四聚体结构可能对TTR的功能性血管生成特性有作用，例如在接受TTR稳定剂tafamidis治疗的心脏ATTR患者中，循环内皮祖细胞逐渐增加。

ATTR心肌病的病理生理学仍不清楚。一种假设是，TTR淀粉样纤维在心肌中的积累导致限制性或浸润性心肌病，使心脏下腔（心室）的肌肉组织变硬，心室无法有效充血，从而导致心脏血流减少。历史上，ATTR淀粉样沉积被描述为斑块状（即没有明显的沉积模式），与其他类型的心脏淀粉样变性（如免疫球蛋白轻链淀粉样变性（AL）的血管周围沉积模式不同。2016年的一项组织病理学研究将ATTR和AL心脏淀粉样变性的最常见的沉积模式描述为离散的细胞周沉积，尽管也观察到了结节性和间质性沉积模式。尽管AL病理中的血管沉积更为常见，但该研究显示ATTR在心肌内血管中也有沉积，尤其是在心肌内动脉中。传统的组织病理学检查是通过二维可视化进行的。组织透明化方法可以在去除脂质的同时保持组织结构，使组织光学透明，从而能够成像更厚的组织样本，获得三维（3D）的病理学见解。据我们所知，这是首次使用组织透明化技术来分析体外0.5毫米人左心室（LV）自由壁组织切片中的ATTR心肌病病理。之前的组织学检查受到二维性的限制，无法清晰地观察小结构（如毛细血管）。与需要分离纤维技术的冷冻电子显微镜检查不同，冷冻电子断层扫描有潜力展示组织结构与其淀粉样纤维之间的关系；然而，这种方法技术要求较高。我们还使用了 bottom-up 未富集的蛋白质组学方法，即在强变性条件下过夜提取蛋白组，并使用6M硫氰酸盐。对两名患者的LV切片进行了蛋白质组学分析，一名患者患有WT ATTR心肌病，另一名患者患有杂合子V122I ATTR心肌病，两者均处于ATTR心脏淀粉样变的晚期。这些蛋白质组学结果与年龄匹配的对照人类LV切片进行了比较，发现血栓炎症的证据，其中外在凝血系统和经典补体级联反应中的蛋白质显著升高。还有蛋白质组学证据表明持续的血管生成，参与止血的蛋白质在ATTR心肌病中也上调。使用月桂硫酸钠对相应心脏的LV切片进行组织透明化处理后，发现ATTR心肌病中正常的微血管结构丧失，与淀粉样沉积相关的区域出现血管生成不足，表明淀粉样生成与血管化丧失有关。我们的结果提供了体外心脏ATTR组织中毛细血管阻塞的证据。这一结论基于对直径<10微米的血管中凝血酶的观察，以及血栓下游的血管结构丧失，表明毛细血管稀疏。在淀粉样沉积物周围观察到微血管阻塞，这些沉积物似乎始于血管基底膜，然后变得更为弥漫。尝试重新血管化阻塞的血管以恢复心肌细胞的全部功能，但似乎受到近端血管基底膜/细胞外空间中的淀粉样沉积物的阻碍。我们推测，血管扩张和毛细血管通透性的增加使血管基底膜的成分暴露于细胞外空间中的错误折叠TTR中，这些成分会促进TTR淀粉样纤维的形成，加剧病理。我们通过低分辨率冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构展示了这种成分（胶原蛋白VI）与ATTR纤维结合的证据。

方法批准
本研究使用了来自提供知情同意的捐赠者的匿名体外人类组织样本，获得了Scripps Research（协议编号：IRB-24-8382、continuing IRB-16-6864和IRB-12-5994）和Columbia University Medical Center（IRB-AAAK6507）的机构审查委员会批准。

数据可用性
用于组织染色和Western印迹的抗体列在表S1中。本文报告的所有密度图和模型均存储在电子显微镜数据银行、蛋白质数据银行（PDB）和电子显微镜公共图像档案中。使用的样本包括WT ATTR顶端1（PDB-9PX6；EMD-71953；电子显微镜公共图像档案-12909）、WT ATTR顶端2（PDB-9PX7；EMD-71960；电子显微镜公共图像档案-12911）、V122I ATTR顶端（PDB-9PX9；EMD-71962；电子显微镜公共图像档案-12912）、人类胶原蛋白VI微纤维（电子显微镜数据银行-73313）和ATTR-胶原蛋白VI共纤维（电子显微镜数据银行-73312）。冷冻电子显微镜数据收集、优化和建模统计信息列在表S2中。原始蛋白质组学数据见表S3、S4和S5。其他支持本研究发现的数据可向通讯作者索取。

组织样本
从Columbia University Medical Center接受原位心脏移植治疗晚期心脏ATTR淀粉样变性的遗传检测患者中取出了两颗摘除的心脏样本，在液氮中快速冷冻，并在干冰上运送到Scripps Research Institute，在-80°C下保存数年直至用于本研究。野生型ATTR样本包含两大部分：完整宽度的心脏顶端和完整宽度的LV自由壁。V122I ATTR样本包含五个独立的解剖部分：LV心脏顶端、LV自由壁、室间隔、右心室心脏顶端和右心室自由壁。对照样本通过Accio Biobank Online的人类组织生物库（https://biobankonline.com/）获得。在联合器官共享组织网络拒绝了一颗捐赠心脏后，我们被添加到待调用名单中。纳入标准为年龄超过55岁、无已知心血管病史和非心脏死亡。我们接受的心脏温暖缺血时间为80分钟。心脏在收到后立即在冰上解冻并快速冷冻在液氮中。解冻的组织在-80°C下保存直至使用。

每个受试者（WT、V122I和对照）的0.5毫米LV样本切片用于通过组织透明化进行成像。

组织透明化
用于组织染色和Western印迹的抗体列在表S1中。初步的透明化研究和初步优化使用了Nudell等人描述的hydrogel-reinforced DISCO（HYBRiD）方法。后续研究，包括本文中的数据，使用了Tocris Tissue Clearing Pro试剂，并遵循Biotechne的Tissue Clearing Pro指南V1.1中的协议（链接：https://resources.tocris.com/pdfs/guidelines/tissue-clearing-pro-guidebook.pdf）。简而言之，全厚度LV自由壁的块状样本首先固定在4%的甲醛溶液中。固定后的样本使用振动切片机切成0.5毫米全厚度切片，并储存在含有0.02%叠氮化钠的PBS中，直至准备进行组织透明化。组织透明化过程从两次PBS清洗开始，然后在室温（约25°C）下使用Tissue Clearing Pro渗透缓冲液（6%月桂硫酸钠；Tocris Bioscience）进行过夜孵育。样本切片再次用PBS清洗两次，随后在4°C下进行逐步脱水，依次使用50%乙醇/PBS、80%乙醇/去离子水和100%乙醇。样本切片然后在20%二甲基亚砜/乙醇中孵育，之后按相反顺序重新水化。样本切片在室温（约25°C）下使用Tissue Clearing Pro渗透缓冲液孵育，然后在使用Tissue Clearing Pro阻断缓冲液（37°C，伴有摇动）孵育。然后将切片转移到初级抗体溶液（每个抗体的稀释比例为1:500 [表S1]，在PBS中加入0.1% Triton X100）中，并在37°C下摇动。初级抗体孵育后，样本用含有0.1% Triton X100的PBS清洗10次，然后转移到二级抗体溶液（每个抗体的稀释比例为1:500，AmyTracker480的稀释比例为1:1000 [表S1]）中。切片在室温（约25°C）下用PBS+0.1% Triton X100清洗10次，然后按照先前的描述，在4°C下进行逐步脱水处理。随后，切片用折射率匹配溶液Tissue Clearing Pro Reagent 1重新水化，再在4°C下与Tissue Clearing Pro Reagent 2一起孵育。切片使用500微米的iSpacer和Tissue Clearing Pro Reagent 2固定在显微镜载玻片上。

**显微成像与分析**
成像使用Zeiss Celldiscoverer CD7和LSM 900共聚焦显微镜进行。图像处理使用与Zeiss Celldiscoverer CD7配套的Arivis Pro软件完成。

**纤维提取**
淀粉样纤维的提取方法参照Annamalai等人的描述。简而言之，取125至250毫克的心脏组织（WT-ATTR：左心室游离壁×2，心尖；V122I-ATTR：左心室心尖、室间隔和右心室游离壁），切成小块，并在0.5毫升Tris钙缓冲液中清洗3次。每个样本在37°C下用1毫升5毫克/毫升的Clostridium histolyticum胶原酶孵育过夜。样品在4°C下以3100g的离心力离心30分钟，然后弃去上清液。样品在0.5毫升Tris EDTA缓冲液中均质化，再以3100g的离心力离心5分钟，同样弃去上清液。经过10次均质化过程后，用0.5毫升的冰冷水重复此步骤，收集的上清液作为纤维提取物。提取物按照后续描述的方法进行质谱（MS）分析，首先进行BCA蛋白测定（Thermo Scientific No. 23225）。

**MS蛋白质组学分析**
从3个不同位置（心脏心尖、左心室游离壁和室间隔）的3个心脏样本中各取出200毫克的心室组织（野生型ATTR样本使用左心室游离壁的两端和心尖）。样品在PBS中使用Ika-Werk Ultra-Turrax组织均质器进行均质化。每份样本分成两部分，其中一半在6M胍硫氰酸中孵育过夜，另一半则按照下面描述的标准蛋白质组学提取和消化方案进行处理。

样品的蛋白质浓度按照Pierce BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Scientific No. 23225）的制造商说明进行标准化。每份样本的100微克蛋白质被转移到200微升尿素缓冲液中，该缓冲液来自Abcam FASP蛋白质消化试剂盒（Abcam No. ab270519）或200微升6M胍硫氰酸（Sigma No. G9277），然后通过提供的收集管注入3-kDa Microcon滤膜上。胍处理的样品在4°C下放置过夜。接着按照试剂盒的Proteome Extract Digestion方案（Abcam No. ab270519）进行操作，从步骤6.3开始。在步骤6.4之前省略了50微升200 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine的膜孵育步骤。步骤6.4修改为加入40微升尿素样品溶液（而不是90微升）。步骤6.9使用Trypsin Platinum（Promega）进行，并在膜上加入1微克的Abcam FASP试剂盒中的消化溶液，在37°C下孵育过夜。步骤6.14后，用10微升甲酸酸化消化后的肽段，并用速冻干燥机干燥。肽段随后重新悬浮在100微升pH值为8.5的100 mM HEPES溶液中。

**Pierce定量比色肽测定（Thermo Scientific No. 23275）**
按照制造商的说明进行操作。定量后，从每个样本中取出25微克肽段，用250微克的TMTpro 16plex（Thermo Scientific No. A44521）在超过40%的乙腈中标记60分钟。标记完成后，用5%的羟胺淬灭串联质谱标签15分钟。然后将样本合并并通过速冻干燥机干燥。干燥后的样本重新悬浮在300微升0.1%三氟乙酸溶液中，并按照Pierce高pH反相肽分级试剂盒（Thermo Scientific No. 84868）的说明进行分级。分级后的样品通过速冻干燥机干燥。干燥后的样本重新悬浮在25微升95% MS级水、5% MS级乙腈和0.1%甲酸的溶液中，然后取1微克样品注入QExactive液相色谱-质谱（MS/MS）仪器中。野生型和V122I心脏组织的原始蛋白质组学数据分别列在表S3和表S4中。

**WT TTR胰蛋白酶片段的MS鉴定**
从WT型ATTR患者心脏中提取的纤维悬浮在8 M尿素中，并用10 mM dithiothreitol还原，然后用25 mM iodoacetamide烷基化。样品随后用50 mM EPPS缓冲液稀释至最终尿素浓度为1 M，加入胰蛋白酶（Thermo Scientific Pierce，No. 90057），在37°C下孵育过夜进行消化。消化后，用三氟乙酸酸化肽段，并使用C-18 PipetteTip（Thermo Scientific Pierce，No. 87784）根据制造商的协议进行脱盐。洗脱出的肽段用速冻干燥机干燥并重新悬浮在0.1%甲酸中。对于液相色谱-质谱（LC-MS/MS）分析，每次运行注入50纳克的肽段。

肽段样本在Orbitrap Exploris 480质谱仪上进行分析，该质谱仪连接到一个Vanquish Neo超高性能液相色谱系统（Thermo Fisher Scientific）。肽段首先加载到PepMap Neo Trap Cartridge（300 μm×5 mm，C18，5 μm，100 ?）上，然后在EASY-Spray PepMap Neo分析柱（75 μm×500 mm，C18，2 μm，100 ?）上进行分离。色谱分离的流速为350 nL/min，柱温保持在45°C。初始流动相由98%的缓冲液A（0.1%甲酸水溶液）和2%的缓冲液B（0.1%甲酸80%乙腈溶液）组成。肽段在29分钟内从2%梯度增加到29%的缓冲液B，接着在18分钟内从29%增加到42%的缓冲液B，最后在5分钟内增加到50%的缓冲液B。随后用99%的缓冲液B洗脱柱子8分钟。

MS数据以数据依赖模式收集。完整的MS1扫描在m/z范围320至1600内进行，分辨率为120,000，自动增益控制目标为3×10^6。前体离子使用3.6 m/z的隔离窗口进行分离。MS2扫描的分辨率为15,000，碎片化通过高能碰撞解离实现，标准化碰撞能量为28%。每个MS1扫描最多收集20个MS2扫描。启用单同位素前体选择和动态排除，选择电荷状态从1到6的前体离子进行碎片化。MS1光谱以轮廓模式获取，而MS2光谱以质心模式获取。

原始的液相色谱-质谱（LC-MS/MS）数据文件使用FragPipe（v22.0）进行处理。肽段鉴定使用MSFragger（v4.1）和全长人类transthyrretin（TTR；UniProt: P02766）的FASTA文件进行。应用默认搜索参数，除了酶特异性：蛋白质消化设置为非特异性切割，酶1定义为严格的胰蛋白酶规则，酶2设置为无效。前体质量容差设置为20 ppm，片段质量容差设置为20 ppm。指定了半胱氨酸的氨基甲酰甲基化作为固定修饰，甲硫氨酸的氧化作为可变修饰。使用IonQuant（v1.10.27）进行无标签肽段的定量，使用默认参数。禁用了运行间的匹配，并未应用运行间的强度标准化，因为只分析了一次LC-MS/MS运行。本实验检测到的所有胰蛋白酶、半胰蛋白酶和其他TTR肽段的完整数据列在表S5中。

**统计分析**
对每个样本的3个不同区域的平均（几何平均）归一化强度质量/电荷比进行了统计分析，使用LIMMA R软件确定患病组织（WT或V122I变体）与对照组之间的显著差异。报告的倍数变化比率是患病心脏和对照组每个区域测量的强度的几何平均值的比率。使用多重检验调整的P值（Padj）临界值<0.05来判定显著性。

**负染色透射电子显微镜**
样本质量通过已建立的协议使用负染色电子显微镜进行评估。简要来说，将ATTR溶液施加到 glow-discharged 的400目铜/铑 Maxaform网格（Electron Microscopy Sciences）上，孵育1分钟以吸附纤维，然后用2%的uranyl formate染色。网格从侧面用Whatman #1滤纸吸干1秒钟。使用Legionon22和Thermo Fisher Talos F200C透射电子显微镜在200 keV下自动收集显微照片，该显微镜配备Gatan K2直接电子探测器，标称放大倍数为73,000，相当于像素大小为1.981 ?（图S1）。为了研究抗体的淀粉样蛋白结合，将含有ATTR纤维的提取物悬浮液（100 μL，约0.5 μg/μL蛋白含量）与anti-TTR抗体5D3（Protego Biopharma）和PA-35315（Invitrogen）以及对照抗-α-微管蛋白抗体DM1A（Cell Signaling Technology）以1:1的质量比孵育1小时。在透射电子显微镜成像之前，通过沉淀淀粉样蛋白并重新悬浮在无抗体的缓冲液中去除游离抗体。

**样品的冷冻电镜（Cryo-EM）制备**
UltraAuFoil 200目R 2/2网格在Pelco easiGlow 91000 glow discharge清洁系统（Ted Pella）中在15 mA下真空 glow discharge 30秒。在网格的前面加入3.5 μL样品，在后面加入0.5 μL，孵育1分钟，然后在液体斑点停止扩散后用Whatman 1滤纸从侧面吸干4到6秒。网格手动快速冷冻在4°C的低温室中，湿度大于95%。AutoGrids组件组装后立即进行筛选。

**Cryo-EM数据收集**
Cryo-EM数据集在Thermo Fisher公司的Talos Arctica TEM上收集，操作电压为200 keV。视频使用Falcon 4i直接电子探测器（Thermo Fisher）记录，标称放大倍数为150,000，相当于像素大小为0.94 ?。所有数据集使用EPU（v.3.9，Thermo Fisher）自动收集，失焦范围为?0.8到?2.0 μm。所有数据集都使用cryoSPARC（v.4.6）处理。处理工作流程见图S2，并在最近的出版物中有更详细的描述。视频收集并分为40帧，使用基于补丁的运动校正进行运动校正，然后在cryoSPARC live中基于补丁进行对比度转移函数估计。丢弃对比度转移函数大于6 ?和像差大于600 ?的显微照片。其余被接受的显微照片用于进一步处理。每个数据集的显微照片统计信息汇总在表S2中。

**螺旋重构**
使用直径60 ?的纤维追踪器挑选纤维，并用10 mM dithiothreitol还原，然后用25 mM iodoacetamide烷基化。样品随后用50 mM EPPS缓冲液稀释至最终尿素浓度为1 M，并加入胰蛋白酶（Thermo Scientific Pierce，No. 90057），在37°C下孵育过夜进行消化。消化后，用三氟乙酸酸化肽段，并使用C-18 PipetteTip（Thermo Scientific Pierce，No. 87784）根据制造商的协议进行脱盐。洗脱出的肽段用速冻干燥机干燥并重新悬浮在0.1%甲酸中。对于液相色谱-质谱（LC-MS/MS）分析，每次运行注入50纳克的肽段。

肽段样本在Orbitrap Exploris 480质谱仪上进行分析，该质谱仪连接到一个Vanquish Neo超高性能液相色谱系统（Thermo Fisher Scientific）。肽段首先加载到PepMap Neo Trap Cartridge（300 μm×5 mm，C18，5 μm，100 ?）上，然后在EASY-Spray PepMap Neo分析柱（75 μm×500 mm，C18，2 μm，100 ?）上进行分离。色谱分离的流速为350 nL/min，柱温保持在45°C。初始流动相由98%的缓冲液A（0.1%甲酸水溶液）和2%的缓冲液B（0.1%甲酸80%乙腈溶液）组成。肽段在29分钟内从2%线性梯度增加到29%的缓冲液B，接着在18分钟内从29%增加到42%的缓冲液B，然后在5分钟内增加到50%的缓冲液B。随后用99%的缓冲液B洗脱柱子8分钟。

MS数据以数据依赖模式收集。完整的MS1扫描在m/z范围320到1600内进行，分辨率为120,000，自动增益控制目标为3×10^6。前体离子使用3.6 m/z的隔离窗口进行分离。MS2扫描的分辨率为15,000，碎片化通过高能碰撞解离实现，标准化碰撞能量为28%。每个MS1扫描最多收集20个MS2扫描。启用单同位素前体选择和动态排除，选择电荷状态从1到6的前体离子进行碎片化。MS1光谱以轮廓模式获取，而MS2光谱以质心模式获取。

原始的液相色谱-质谱（LC-MS/MS）数据文件使用FragPipe（v22.0）进行处理。肽段鉴定使用MSFragger（v4.1）和全长人类transthyrretin（TTR；UniProt: P02766）的FASTA文件进行。应用默认搜索参数，除了酶特异性：蛋白质消化设置为非特异性切割，酶1定义为严格的胰蛋白酶规则，酶2设置为无效。前体质量容忍度设置为20 ppm，片段质量容忍度设置为20 ppm。指定了半胱氨酸的氨基甲酰甲基化作为固定修饰，甲硫氨酸的氧化作为可变修饰。使用IonQuant（v1.10.27）进行无标签肽段的定量，使用默认参数。禁用了运行间的匹配，并且没有应用运行间的强度标准化，因为只分析了一次LC-MS/MS运行。本实验检测到的所有胰蛋白酶、半胰蛋白酶和其他TTR肽段的完整数据列在表S5中。

**统计分析**
对每个样本的3个不同区域的平均（几何平均）归一化强度质量/电荷比进行了统计分析，使用LIMMA R软件确定患病组织（WT或V122I变体）与对照组之间的显著差异。报告的倍数变化比率是患病心脏和对照心脏每个区域测量强度的几何平均值的比率。使用多重检验调整的P值（Padj）临界值<0.05来判定显著性。

**负染色透射电子显微镜**
样本质量通过已建立的协议使用负染色电子显微镜进行评估。简而言之，将ATTR溶液施加到glow-discharged的400目铜/铑 Maxaform网格（Electron Microscopy Sciences）上，孵育1分钟以吸附纤维，然后用2%的uranyl formate染色。网格从侧面用Whatman #1滤纸吸干1秒。使用Leginon22和Thermo Fisher Talos F200C透射电子显微镜在200 keV下自动收集显微照片，显微镜配备Gatan K2直接电子探测器，标称放大倍数为73,000，相当于像素大小为1.981 ?（图S1）。为了研究抗体的淀粉样蛋白结合，将含有ATTR纤维的提取物悬浮液（100 μL，约0.5 μg/μL蛋白含量）与anti-TTR抗体5D3（Protego Biopharma）和PA-35315（Invitrogen）以及对照抗-α-微管蛋白抗体DM1A（Cell Signaling Technology）以1:1的质量比孵育1小时。在透射电子显微镜成像之前，通过沉淀淀粉样蛋白并重新悬浮在无抗体的缓冲液中去除游离抗体。

**样品的冷冻电镜（Cryo-EM）制备**
UltraAuFoil 200目R 2/2网格在Pelco easiGlow 91000 glow discharge清洁系统（Ted Pella）中在15 mA下真空 glow discharge 30秒。在网格的前面加入3.5 μL样品，在后面加入0.5 μL，孵育1分钟，然后在液体斑点在滤纸上停止扩散后用Whatman 1滤纸从背面吸干4到6秒。网格手动快速冷冻在4°C的低温室中，湿度大于95%。AutoGrids组件组装后立即进行筛选。

**Cryo-EM数据收集**
Cryo-EM数据集在Thermo Fisher公司的Talos Arctica TEM上收集，操作电压为200 keV。视频使用Falcon 4i直接电子探测器（Thermo Fisher）记录，标称放大倍数为150,000，相当于像素大小为0.94 ?。视频以电子事件表示格式保存，总电子曝光量为每 ?2 50 e?。所有数据集使用EPU（v.3.9，Thermo Fisher）自动收集，失焦范围为?使用335,693个片段进行ATTR V122I的重建，得到了3.0 ?的分辨率（FSC 0.143，B因子为?36 ?2），优化的扭转角度为?1.24°，升高量为4.85 ?。报告的B因子是通过RELION 5.23中的无监督自动锐化得到的。重建的完整性在图S2中进行了验证。

**胶原VI微纤维的重建**
胶原VI（COLVI）三螺旋纤维在cryoSPARC（v4.7）中进行了处理。从ATTR淀粉样蛋白（wt-1）的处理中选取了非淀粉样纤维的2D分类，并用于先前去噪显微图的模板选择（预训练模型）。总共提取了180万个颗粒，这些颗粒被划分到512像素的区域内，然后进行了两轮2D分类（非默认参数：40次迭代，批量大小400，250 ?圆形掩模）。最终使用147,000个颗粒创建了3个类别的初始重建结果。所有3个类别都被用作输入进行异质性精炼（非默认参数：启用硬分类，批量大小4000，球形掩模280 ?）。最后，从异质性精炼中选取了48,463个颗粒作为非均匀精炼的输入（非默认参数：额外 passes 5次，初始低通过滤15 ?，启用逐个颗粒的优化），得到了9.7 ?的最终重建结果（金标准FSC分辨率为0.143）。验证和处理工作流程如图S3所示，统计数据在表S2中。

**COLVI-ATTR共纤维的重建**
COLVI纤维在cryoSPARC（v4.7）中进行了处理。从ATTR淀粉样蛋白（wt-1）的处理中选取了非淀粉样纤维的2D分类，并用于先前去噪显微图的模板选择（预训练模型）。总共提取了180万个颗粒，这些颗粒被划分到512像素的区域内，然后进行了两轮2D分类（非默认参数：40次迭代，批量大小400，250 ?圆形掩模）。最终使用147,000个颗粒创建了3个类别的初始重建结果。所有3个类别都被用作输入进行异质性精炼（非默认参数：启用硬分类，批量大小4000，球形掩模280 ?）。最后，从异质性精炼中选取了48,463个颗粒作为非均匀精炼的输入（非默认参数：额外 passes 5次，初始低通过滤15 ?，启用逐个颗粒的优化），得到了9.7 ?的最终重建结果（金标准FSC分辨率为0.143）。验证和处理工作流程如图S3所示，统计数据在表S2中。

**模型构建、精炼和验证**
为了辅助模型构建，利用EMReady工具对锐化的图像进行了修改，这提高了模型构建过程中的可解释性。PDB 8G9R被用作初始原子模型，并作为刚体模型嵌入ChimeraX中，随后使用Coot（v.0.9.8.95）和ISOLDE（v.0.9.8.95）进行手动校正，并使用Phenix（v.1.19）中的phenix.real_space_refine功能进行迭代精炼，同时启用了6条链的非晶体对称性约束。使用Phenix中的MolProbity（v.2.0.1）自动生成了验证报告。Q分数是在ChimeraX（https://github.com/tristanic/chimerax-qscore）中计算的。使用atoms2svg.py生成了淀粉样蛋白z堆栈的示意图。完整的验证报告在表S2中提供。

**SDS-PAGE**
TRT样本根据通过初步免疫印迹实验确定的信号强度，在Dulbecco's PBS中稀释至所需浓度。然后将样本分装到8管聚合酶链反应条中，并加入Laemmli SDS样品缓冲液（6倍浓度）。试管短暂旋涡离心以混合样品。样本在100°C下煮沸10分钟，然后在聚合酶链反应仪（BioRad C1000 Touch No. 1851148）中冷却至4°C。试管再次短暂离心以重新融入任何蒸发的溶液，然后向每个样本中加入11 μL的4%至20% Mini-PROTEAN TGX预制蛋白凝胶（BioRad No. 4561096）。为了近似标记蛋白的大小，每个凝胶中加入了7 μL的Precision Plus Protein All Blue Standards（BioRad No. 1610373EDU）。在装入参考梯度和样本后，将电泳槽（Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels，型号No. 1658004）连接到电源（BioRad PowerPac Basic Power Supply No. 1645050），并在50 V下运行5分钟以固定蛋白质在凝胶中，随后电压增加至110 V，并在染料前沿开始从凝胶底部移动后立即停止电泳。

**Western Blotting**
SDS-PAGE凝胶使用BioRad TransBlot Turbo半干转移系统（BioRad No. 1704150）以25 V在预设的混合分子量程序下转移到聚偏二氟乙烯膜（Sigma No. IPFL00010）上7分钟。然后用1× tris缓冲盐水溶液（TBST）加0.05% Tween20（Sigma P7949，500 mL）短暂清洗膜，随后在室温下的轨道振荡器上用TBST+5% w/v牛血清白蛋白（热休克处理，Fisher BP1600-100）和0.2%叠氮化钠（Fisher BP922I-500）封闭超过30分钟。封闭缓冲液去除后，用TBST清洗膜，并将多克隆兔转甲状腺素抗体（Invitrogen Antibody，Thermo PA5-35315）以1:2000的比例稀释后加入。然后将盒子用Parafilm包裹以保存一抗溶液，并在4°C的轨道振荡器上放置过夜。第二天，将一抗溶液重新转移到锥形管中并储存在4°C下，膜再用TBST快速清洗两次，然后在室温下的轨道振荡器上用TBST清洗两次，每次5分钟。第四次清洗后，加入二抗溶液，该溶液由TBST+3% w/v牛血清白蛋白和1:1000稀释的辣根过氧化物酶偶联兔抗体（Cell Signaling Technology No. 7074）制成。再将膜放回室温下的轨道振荡器中1小时，然后按照上述方法清洗四次。根据信号强度，使用SuperSignal West Pico PLUS（Thermo No. 34580）或Femto（Thermo No. 34096）化学发光底物短暂处理膜。对于显示Precision Plus Protein All Blue Standards（BioRad No. 1610373EDU）的复合图像，使用多通道协议进行显影，第二个通道设置为Cy5以检测强信号带。

**临床结果**
本研究使用了两个具有经活检证实的ATTR心肌病病理的心脏和1个年龄匹配的对照心脏。这两颗患病的心脏都是在原位心脏移植手术中摘出的，代表了晚期ATTR心肌病。基因检测显示，从一个57岁的黑人女性身上摘出的心脏仅携带WT ATTR；因此，她被诊断为散发性WT-ATTR心肌病。另一颗患病的心脏来自一个63岁的黑人男性，他被诊断为遗传性V122I心肌病。年龄匹配的对照心脏是由联合器官共享组织网络在一名60岁的加勒比海（波多黎各）裔男性非心脏死亡后摘出的，该男性没有已知的心血管病史。淀粉样特异性染色和蛋白质组学检测确认对照心脏无淀粉样蛋白，对照心脏的结构染色显示正常的 cardiac 架构。为了减少实验变异性，从每颗心脏中同时制备了样本。未来将寻找晚期WT和变异型ATTR心肌病以及早期WT和变异型ATTR心肌病的更多生物学样本，因为目前这些结果还属于探索性研究阶段。

**通过MS的 ATTR心肌病蛋白质组学特征**
从每颗心脏中提取了3个样本（每个样本200毫克心室组织，来自心脏的不同区域），使用Ika-Werk Ultra-Turrax组织粉碎机在PBS中匀浆。每个样本被分成两半，其中一半样本在6M胍硫氰酸盐中过夜孵育。基于MS的组织分析揭示了预期的ATTR蛋白质组学特征（即，与对照组相比，患病样本中的血清淀粉样蛋白P [SAP]、载脂蛋白E、clusterin、vitronectin和载脂蛋白A-IV水平升高）（图1A）。使用串联质量标签（TMT）进行等位标记，可以实现多重检测并便于定量。每个样本组的强度在图1A中表示，强度差异的显著性使用LIMMA R包进行确定。样本由3个重复样本组成，每个样本来自心脏的不同区域（见方法部分）。组织样本的完整蛋白质组学结果在表S3中给出。

**图1. 蛋白质组学鉴定的特征淀粉样蛋白和淀粉样相关蛋白**
A. 通过自下而上的蛋白质组学方法从2个患病样本（WT-ATTR和V122I-ATTR）的心室组织匀浆中鉴定的特征淀粉样蛋白和淀粉样相关蛋白，与年龄匹配的对照组相比。条形图表示每种组织中蛋白质的TMT强度的几何平均值；误差条表示几何标准差。报告的P值是使用LIMMA算法计算调整后的P值。注意y轴的对数刻度。B. 绘制了WT ATTR（左）或V122I ATTR（右）患病组织匀浆中鉴定出的蛋白质的TMT强度的对数2比值与年龄匹配对照组（x轴）的对比，以及使用LIMMA算法计算的–log10调整后的P值（y轴）。水平虚线表示P=0.05。垂直虚线表示患病组织与对照组之间的2倍差异。对照组组织优势的蛋白质数据以浅蓝色显示，患病组织优势的蛋白质数据以浅红色显示，其他蛋白质数据以灰色显示。文中提到的蛋白质用深色标记。ATTR表示转甲状腺素淀粉样变性；TMT表示串联质量标签；WT表示野生型。

**转甲状腺素（TTR）**在ATTR心肌病中的表达量与对照组相比具有统计学上的显著增加（WT-ATTR心肌病为23.0 FCR，Padj=1.2×10^-5；V122I ATTR心肌病为31.9 FCR，Padj=4.9×10^-6）。WT-ATTR患病样本匀浆中的TTR/白蛋白比为0.91，V122I ATTR为1.78（表S3）；提取的纤维中的比为WT-ATTR为11.46，V122I ATTR为10.01（表S4）。我们还观察到SAP急性反应阶段蛋白clusterin、vitronectin以及淀粉样相关载脂蛋白A4和A5的FCR也有统计学上的显著升高。SAP（由APCS基因编码）已知可以与非天然蛋白质构象结合，包括淀粉样纤维，并在白细胞介素-6的作用下从肝脏分泌到血液中，作为体液模式识别受体，可以直接激活补体或与免疫细胞的Fc-γ受体结合以刺激吞噬细胞或细胞毒性细胞。SAP在钙存在下与C1q的类胶原蛋白区域结合，从而激活经典补体途径。SAP还在调节细胞外基质组成中起重要作用，并与几乎所有具有β-折叠片层结构的蛋白质共定位。WT-ATTR心肌病中的clusterin FCR显著升高（Padj=1.5×10^-5），V122I ATTR心肌病中的FCR为22.2（Padj=1.8×10^-5）。Clusterin是一种细胞外伴侣蛋白（独立于ATP），可以与非天然蛋白质结合以中和其毒理性。Clusterin还通过受体介导的内吞作用促进髓系细胞对非天然蛋白质的降解。一旦被巨噬细胞或小胶质细胞内化，clusterin与错误折叠的蛋白质形成的复合物会被运输到溶酶体中并被溶酶体蛋白酶降解。在WT-ATTR心肌病中，clusterin的FCR为13.9（Padj=3.4×10^-5），在V122I ATTR心肌病中为12.3（Padj=5.1×10^-5）。vitronectin是一种由肝脏分泌的糖蛋白，似乎与大多数采用β-折叠片层结构的蛋白质共定位，并通过与其他细胞外基质和血管成分的相互作用参与止血和血管重塑。在WT-ATTR心肌病中，vitronectin的FCR为10.0（Padj=3.4×10^-5），在V122I ATTR心肌病中为10.3（Padj=5.1×10^-5）。与淀粉样纤维相关的载脂蛋白A4和A5在WT-ATTR心肌病中的FCR分别为20.2（Padj=3.7×10^-5）和14.0（Padj=1.1×10^-4），在V122I ATTR心肌病中分别为7.7（Padj=3.4×10^-5）和10.3（Padj=2.3×10^-5）。MS在ATTR心肌病中鉴定了17,393个肽，其中792个独特的蛋白质与对照心脏样本相比具有不同的统计显著性（图1B；表S3）。观察到的总体趋势表明，野生型ATTR心肌病（WT ATTR）和V122I ATTR心肌病在表型上存在趋同性；实际上，在比较WT ATTR与V122I ATTR时，没有发现任何蛋白质存在显著差异（Padj <0.05）（表S3）。

心脏ATTR淀粉样变性中的凝血障碍和补体级联反应
与对照组相比，ATTR心肌病组织匀浆中观察到多种凝血级联因子水平升高（图2）。纤维蛋白原（凝血因子I）的大部分成分均有所增加，其中β链在WT ATTR心肌病中的FCR为2.9（Padj=5.6×10^-3），在V122I ATTR心肌病中为3.7（Padj=2.4×10^-3）；γ链在WT ATTR心肌病中的FCR为3.2（Padj=1.8×10^-3），在V122I ATTR心肌病中为4.1（Padj=7.8×10^-4）；α链在ATTR心脏中的水平也较高，但在WT ATTR心肌病中的FCR为1.9（P=0.073），在V122I ATTR心肌病中为1.8（P=0.098）。凝血酶原（F2）也有所增加，在WT ATTR心肌病中的FCR为5.5（Padj=1.7×10^-4），在V122I ATTR心肌病中为4.5（Padj=4.9×10^-4）。凝血因子IX和X的水平也有升高，分别在WT ATTR心肌病中的FCR为2.6（Padj=6.0×10^-3）和2.6（Padj=2.7×10^-3），在V122I ATTR心肌病中的FCR为2.5（Padj=9.1×10^-3）和2.7（Padj=2.8×10^-3）。此外，通过对WT和V122I ATTR心脏提取的纤维进行蛋白质组学分析，同样发现了外源性凝血级联反应和经典补体级联反应的成分（图2）。还检测到了冯·维勒布兰德因子及相关蛋白质、血小板相关蛋白质以及激肽-卡利克里酶系统蛋白质（表S3）。

**图2. 凝血炎症蛋白组学谱型。**


与对照组相比，在ATTR心肌病患者的室腔组织匀浆中检测到的蛋白质水平较高，这些蛋白质同样存在于同一患者的提取淀粉样纤维中，或在基因本体生物学过程数据库中得到确认。*血小板相关蛋白质包括参与血小板聚集、形成、激活、成熟、调节、血小板形态发生以及由血小板产生的生长因子。ATTR表示转甲状腺素淀粉样变性；CM表示心肌病。*

**3D组织分析显示心脏ATTR淀粉样变性中的微血管阻塞**
经光学处理的样本通过间接免疫荧光标记了血管内皮-钙粘蛋白（CDH5，更常见称为CD144；即内皮细胞间隙连接）和凝血酶。这些样本还用AmyTracker处理，这是一种寡噻吩染料，与淀粉样纤维结合时会发出荧光（Ebba Biotech）。3D可视化显示，直径小于10微米的血管中存在凝血酶，这与毛细血管水平的血管血栓形成相对应。血栓下游观察到血管完整性的丧失（图3），该位置与淀粉样染色区域边缘一致。血栓下游的血管结构丧失表明毛细血管稀疏，需要通过血管生成来恢复基础心肌细胞的全部功能。

**图3. 微血管血栓的3D可视化。**


**与血管生成相关的蛋白质/蛋白多糖升高**
在病变样本中，许多与血管生成相关的蛋白质和蛋白多糖水平升高（图4；表S3）。IV型胶原是血管基底膜中最丰富的蛋白质，IV型胶原α1链和α2链在WT ATTR心肌病中的FCR分别为3.20（Padj=1.1×10^-3）和2.8（Padj=1.4×10^-3），在V122I ATTR心肌病中的FCR分别为3.3（Padj=1.0×10^-3）和2.7（Padj=2.1×10^-3）。基底膜成分perlecan（HSPG2）是一种促进TTR聚集的磺化蛋白多糖，在WT ATTR心肌病中的FCR升高至2.9（Padj=1.3×10^-4），在V122I ATTR心肌病中的FCR升高至2.5（Padj=4.4×10^-4）。其他参与血管生成的血管基底膜蛋白多糖包括decorin、versican和agrin，其在WT ATTR心肌病中的FCR分别为5.0（Padj=1.5×10^-3）、3.9（Padj=2.5×10^-5）和1.9（Padj=5.3×10^-4），在V122I ATTR心肌病中的FCR分别为3.6（Padj=6.4×10^-3）、3.0（Padj=7.0×10^-5）和1.9（Padj=6.3×10^-4）（表S3）。血管内皮生长因子受体FLT1在WT ATTR心肌病中的FCR升高至6.7（Padj=2.7×10^-4），在V122I ATTR心肌病中的FCR升高至4.5（Padj=1.3×10^-3）。受体LRP1在WT ATTR心肌病中的FCR也显著升高，为1.8（P=0.011），在V122I ATTR心肌病中的FCR为2.0（Padj=7.3×10^-3）。LRP1在有序血管生成中起关键作用，能结合载脂蛋白E和与淀粉样疾病相关的蛋白质，如α-突触核蛋白和tau，并且其表达受天然折叠的TTR四聚体调控。其他与血管生成相关的蛋白质在ATTR心肌病中也升高，包括LTBP1（潜在转化生长因子-β结合蛋白）、THBS4（血栓调节蛋白-4）、SFRP1（分泌型frizzle相关蛋白1）、ADAMTS1（具有血栓调节蛋白1基序的解整素和金属蛋白酶）、FBN1（纤维蛋白原-1）、FBLN5（纤维蛋白原-5）以及其他血栓调节蛋白和ADAMTS蛋白质（图4；表S3）。

**图4. 血管生成蛋白组学谱型。**


**3D组织分析显示血管结构的破坏**
经光学处理的样本用AmyTracker标记以显示淀粉样沉积；使用间接免疫荧光成像血管基底膜中最丰富的IV型胶原；并使用含有2个突变（F87M/L110M）的的单聚体TTR构建体作为TTR抗体（5D3）进行标记，这些突变使其在生理条件下不易形成天然TTR四聚体（Protego Biopharma）。该抗体能够识别部分热变性的TTR和患者来源的ATTR纤维（图S4A-D），但不会与天然四聚体TTR结合，尽管其序列表位（TSESGELHGLTTE，残基49-61）是暴露的（图S4E）。这些观察结果表明，5D3的结合取决于其表位的构象，并且它可以在非天然构象中广泛识别这一序列。3D可视化显示（图5；左心室游离壁），ATTR心肌病样本中的血管结构受到破坏，而年龄匹配的非心肌病对照组样本中则呈现出类似的金字塔状结构（顶部行）。在心肌病切片中观察到血管过度灌注（黑色箭头）和血管灌注不足（白色箭头）区域。淀粉样沉积区域下游观察到血管结构的丧失，这表明血管灌注丧失与淀粉样沉积有关。有趣的是，用5D3抗体识别的非天然TTR与用AmyTracker识别的纤维状TTR沉积只有部分重叠。相反，用5D3染色显示的区域通常是胶原IV缺失的地方（黄色箭头），有时在没有AmyTracker染色的地方也有这种染色，但更常见于AmyTracker染色密集区域的边缘。这一观察结果在讨论部分有进一步解释。

**图5. 3D可视化显示的无序血管生成。**


**体外ATTR淀粉样纤维的表征**
为了证明WT ATTR心肌病和V122I ATTR心肌病心脏中确实存在真正的淀粉样纤维，我们通过负染色透射电子显微镜检查了提取的纤维材料，发现这些纤维长度不一但厚度均匀（图S1）。假设它们的螺旋结构为左手螺旋，但未通过实验验证。提取的纤维足够规则，可以通过冷冻电镜（cryo-EM）确定其原子结构。在冷冻电镜中，纤维倾向于聚集，导致大量不合适的显微图像（图S1和S2A-C）。然而，获得了足够的经过处理的显微图像，可以用于在cryoSPARC中进行自动化纤维追踪和螺旋重建（图S2D）。在2D和3D分类过程中使用交叉β-层分离方法，选择合适的均匀螺旋片段堆叠，以获得WT ATTR纤维约3.2 ?和V122I ATTR纤维约3.4 ?的分辨率（图6A-C；图S2）。所有3种重建在螺旋对称性方面只有轻微差异，螺旋间距增加了4.85 ?，扭转角为-1.26±0.02°。因此，计算出的交叉距离在682至704 ?范围内（图6D；表S2）。

**图6. 心脏ATTR纤维的螺旋重建和表征。**
A-C：沿z轴观察的重建的ATTR纤维切片，旁边是显示原子模型的电镜密度等值面。WT顶端1用蓝色表示，WT顶端2用棕褐色表示，家族性心肌病变异型V122I用橙色表示。肽末端有标注。D：ATTR淀粉样蛋白的共识原子模型，其中较小的P11-K35肽用蓝色表示，较大的L58-T123肽用灰色表示。螺旋对称参数已标注：螺旋间距为4.85 ?，扭转角为-1.26°（±0.02°），样本间的差异值在图模型拟合旁边标注。E：共识ATTR纤维尖端的残基级别示意图。L58/L84之间的封闭门用红色箭头标记。酸性残基用红色表示，碱性残基用蓝色表示，极性残基用绿色表示，疏水性残基用粉色表示，甘氨酸用紫色表示。虚线表示未解析的残基范围。V122用红色突出显示。F：WT和V122I ATTR之间的结构保守性用Cα RMSD表示。RMSD值较大的残基用标注球体表示。ATTR表示转甲状腺素淀粉样变性；EM表示电子显微镜；RMSD表示均方根偏差；WT表示野生型。

所有3种重建都符合“尖端”构象，其特征是L58和L85之间的封闭“门”，这已在大多数解析出的ATTR淀粉样蛋白中得到证实（图6E；图S5A, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48），除了从眼玻璃体中提取的多态体（图S5A）。如之前的ATTR重建所示（图S5A），较短N端片段的交叉β结构清晰可见，P11-K35的密度明确，而较长的C端肽L58-T123的密度连续（图6E）。中间段落A36至G57的解析度较低。

比较使用Cα均方根偏差重建的3种结构显示，整体尖端折叠非常稳定（全局RMSD为0.4 ?），肽的环状区域只有局部差异。这些区域包括肽末端和残基A19-R21，但V122I的点突变并未引起局部折叠的可观察变化（图6F）。在所有解析出的ATTR淀粉样蛋白中，整体Cα均方根偏差<1 ?，最大差异位于门区域。这种高稳定性进一步支持了尖端构象优于其他多态体的观点（图S5B）。ATTR的尖端折叠通常被建模为两个不连续的肽链（在图6中用虚线连接）。由于螺旋重建依赖于重叠片段的平均和正确应用的螺旋对称性，对称化伪影和平均可能会使重建偏向于最丰富的构象。低丰度的构象状态和灵活区域可能无法解析，需要进一步的实验来理解局部突变及其疾病相关性。虽然我们无法解析A36-G57区域，但对冷冻电镜密度应用2-σ高斯处理后显示该区域可能是连接的但具有灵活性的（图S6A）。重新审视之前从心脏（图42）和眼玻璃体（图43）中解析出的ATTR淀粉样蛋白显示，A36-G57区域也有类似的灵活密度迹象（图S6B）。ATTR纤维通常是全长肽链和蛋白酶切割肽链的混合物，切割位点位于这一灵活区域。由此产生的混合全长和分段链纤维被称为A型纤维（较少见的B型纤维完全由全长TTR组成）。先前的研究强烈表明，淀粉样纤维的形成先于蛋白水解（尽管这一事件顺序尚未得到确凿证明）。在初始蛋白水解事件之后，产生的片段可以进一步被氨基肽酶修剪。因此，A型纤维的C端片段是“参差不齐的”，N端位于44至58位之间。使用针对TTR序列部分（残基71-98）的抗体（PA5-35315）对来自这两例ATTR患者心脏的孤立纤维进行Western印迹检测，结果显示，在野生型和V122I型心脏中，纤维主要由全长TTR组成，蛋白水解的TTR只是次要成分，从而将这些纤维鉴定为A型（图S7A）。支持这一观察结果的是，对野生型患者ATTR纤维进行胰蛋白酶消化的自下而上的蛋白质组学分析显示，存在覆盖整个TTR序列的片段（图S7B和C）。

心脏ATTR淀粉样纤维被COLVI修饰。检查我们的淀粉样样本发现，在所有3个体外制备的淀粉样提取物中，几乎所有显微照片中都存在一种未知的淀粉样纤维相关成分。这些具有额外成分的ATTR纤维采用了重复排列，这可能是由于与ATTR淀粉样纤维相互作用的大分子造成的，这种大分子本身也呈现纤维形态（图7A和7B）。在早期关于心脏轻链淀粉样蛋白的研究中，类似的组装被认为是与COLVI相互作用的AL淀粉样纤维，形成了半结构的超螺旋组装。COLVI将细胞表面与细胞外基质连接起来，为哺乳动物组织提供机械强度。它普遍表达，形成三螺旋纤维，最常见的重复亚单位构型是α1-α2-α3异三聚体，最近通过冷冻电镜进行了表征。我们使用单颗粒分析重建了来自野生型患者心脏数据集中非淀粉样COLVI微纤维的单个珠状部分，精度约为10 ?，没有强制点群对称性（C1）（图S3）。所有COLVI亚单位都包含富含脯氨酸的胶原三螺旋和重复的von Willebrand因子A型球状结构域，我们将这些结构域放入微纤维重建中以供可视化（图7C）。

尽管在COLVI的螺旋重建中由于施加了螺旋对称性而无法看到COLVI，但我们观察到在显微照片和投影层面上有非淀粉样成分装饰着ATTR纤维（图7D和7E）。选择对淀粉样结合蛋白呈阳性的2D类别后，得到了装饰有COLVI的ATTR纤维的低分辨率重建（图7E）。由于给定的分辨率限制，我们无法明确地将这种结合伴侣鉴定为COLVI。然而，COLVI结构域与我们观察到的密度相符，这支持了这种被ATTR结合的物种是COLVI的观点，此外微纤维的珠状之间的距离为1100 ?（图7A，55，56），以及我们的质谱分析显示COLVI是我们纤维提取物中最丰富的胶原类型（表S4）。因此，我们暂时将ATTR纤维的结合伴侣鉴定为COLVI。

通过显微照片水平测量，COLVI微纤维中珠状结构之间的三螺旋间隔约为700 ?（图7A），这与ATTR淀粉样纤维的交叉距离（682–704 ?）和已解析的AL59轻链淀粉样纤维交叉距离（1200 ?）相匹配，可能支持通过引导的手性转移过程形成共纤维，即天然淀粉样蛋白的扭曲转移到不扭曲的COLVI三螺旋纤维上。图7F提出了一个ATTR和COLVI的共纤维模型。图7中显示的细胞外基质成分与ATTR纤维之间的强烈、紧密关联表明，细胞外基质成分可以创建促进具有互补结构的交叉β-折叠淀粉样纤维沉积的组织微环境，或者阻止其清除。

基于结果部分中的观察结果，我们假设野生型和遗传性ATTR心肌病是一种在血栓炎症性毛细血管阻塞背景下血管生成失调的微血管病变。这一假设包括以下事件序列：血管床中的内皮细胞激活，可能由氧化脂蛋白、凝血酶或错误折叠的TTR引发，导致组织因子的释放和外在凝血级联的激活，在毛细血管中形成纤维蛋白凝块（图8，第1面板）。同时，激肽酶将激肽原转化为缓激肽，引发血管扩张和血管基底膜的暴露。暴露的胶原蛋白IV以及血清淀粉样蛋白P触发C1复合物的合成，启动经典补体途径（图8，第2面板）。毛细血管阻塞（图3）引发下游的缺氧（图8，第3面板），需要重新血管化以恢复氧合（图8，第4面板）。最近的研究推测四聚体TTR在血管生成中可能起作用（表S6）。暴露的血管基底膜由“特征性的淀粉样蛋白结合蛋白”和其他成分组成，如蛋白聚糖，这些成分已知可以与错误折叠的TTR结合，形成淀粉样纤维形成的成核点（图8，第3面板；见下一段），可能是通过构象转换实现的。如果没有减轻缺氧信号，TTR将继续到达该部位，导致TTR积累和基底膜的堵塞（图8，第4面板）。基底膜的堵塞限制了新生血管的生成空间，导致血管结构的丧失，表现为淀粉样沉积物周围的过度血管化和淀粉样沉积物区域的血管减少（图5）。尽管我们的蛋白质组学数据中没有组织因子，但最近的一项研究表明，用含有或不含tafamidis的血浆处理培养的内皮细胞后，组织因子的表达和活性降低，这阐明了几种稳定型 Transthyretin 在凝血止血中的作用。如果循环中的非天然TTR负责引发凝血的内皮细胞激活，这可以解释为什么tafamidis在没有淀粉样蛋白清除的情况下如此有效地减缓心肌病的进展。

本研究使用的ATTR心肌病患者的心脏处于疾病晚期，因此在确定导致这些图像的事件顺序方面价值有限。然而，正如我们上面提到的，抗天然TTR抗体（5D3）的染色在AmyTracker染色的淀粉样沉积物缺失或更常见的是在其边缘发生。鉴于我们已经证明抗天然TTR抗体可以结合分离的ATTR纤维（图S4），我们推测它不结合密集的ATTR淀粉样沉积物核心的原因可能是由于其表位的空间阻塞，这可能是由于ATTR纤维之间的相互作用（与它们在图S1中的聚集倾向一致），或者是ATTR纤维与淀粉样结合蛋白/糖胺聚糖之间的相互作用，无论是循环中的（如SAP）还是细胞外基质中的（如COLVI）。这种相互作用的强度通过图7中显示的COLVI和ATTR纤维之间的密切和结构特异性关联得到了证明。因此，非天然TTR抗体可能与不成熟的、非纤维状的ATTR沉积物相关（这些沉积物预计不会被AmyTracker染色），以及密集淀粉样沉积物周围的纤维状和非纤维状物质相关。基于这些观察结果，我们假设我们的结果与一个过程一致，即非纤维状的TTR聚集体（寡聚体/原纤维），最有可能是全长TTR，首先沉积在血管基底膜中。已知这些寡聚体在ATTR多神经病变和心肌病患者的血液中循环。随后可能发生两个过程，通常是平行的。首先，沉积的聚集体为循环中的非天然寡聚体TTR提供了一个有利的“着陆区”，因为两者之间的同型相互作用促进了沉积物的生长。其次，沉积的结构异质性聚集体会发生构象转换，形成更密集、更有结构且更稳定的交叉β-折叠淀粉样纤维。与COLVI（图7）和硫酸化糖胺聚糖（39，57，58）等物质的相互作用可能促进这种构象转换。

像图7中观察到的那样，细胞外基质成分与ATTR纤维之间的强烈、紧密的关联表明，细胞外基质成分可以创建促进具有互补结构的交叉β-折叠淀粉样纤维沉积的组织微环境，或者阻止其清除。

讨论：根据结果部分中覆盖的观察结果，我们假设野生型和遗传性ATTR心肌病是一种在血栓炎症性毛细血管阻塞背景下血管生成失调的微血管病变。这一假设包括以下事件序列：毛细血管床中的内皮细胞活化，可能由氧化脂蛋白、凝血酶或错误折叠的TTR引发，导致组织因子的释放和外在凝血级联的激活，在毛细血管中形成纤维蛋白凝块（图8，第1面板）。同时，激肽酶将激肽原转化为缓激肽，引发血管扩张和血管基底膜的暴露。暴露的胶原蛋白IV连同血清淀粉样蛋白P触发C1复合物的合成，启动经典补体途径（图8，第2面板）。毛细血管阻塞（图3）引发下游的缺氧（图8，第3面板），需要重新血管化以恢复氧合（图8，第4面板）。最近的研究提出了四聚体TTR在血管生成中的潜在作用（表S6）。暴露的血管基底膜由“特征性的淀粉样蛋白结合蛋白”和其他成分组成，如蛋白聚糖，这些成分已知可以与错误折叠的TTR结合，形成淀粉样纤维形成的成核点（图8，第3面板；见下一段），可能是通过构象转换实现的。如果没有减弱缺氧信号，TTR将继续到达该部位，导致TTR积累和基底膜的堵塞（图8，第4面板）。基底膜的堵塞限制了新生血管生成的空间，导致血管结构的丧失，表现为淀粉样沉积物周围的过度血管化和淀粉样沉积物区域的血管减少（图5）。尽管我们的蛋白质组学数据中没有组织因子，但最近的一项研究表明，用含有或不含tafamidis的血浆处理培养的内皮细胞后，组织因子的表达和活性降低，这阐明了稳定型Transthyretin在凝血止血中的作用。如果循环中的非天然TTR负责引发凝血的内皮细胞激活，这可以解释为什么tafamidis在缺乏淀粉样蛋白清除的情况下仍能有效减缓心肌病的进展。

本研究使用的ATTR心肌病患者的心脏处于疾病晚期，因此在确定导致这些图像的事件顺序方面价值有限。尽管如此，我们注意到抗天然TTR抗体（5D3）的染色在AmyTracker染色的淀粉样沉积物缺失或更常见的是在其边缘发生。鉴于我们已经证明抗天然TTR抗体可以结合分离的ATTR纤维（图S4），我们推测它不结合密集的ATTR淀粉样沉积物核心的原因可能是由于其表位的空间阻塞，这是由于ATTR纤维之间的相互作用（与它们在图S1中的聚集倾向一致），或者是ATTR纤维与淀粉样结合蛋白/糖胺聚糖之间的相互作用，无论是循环中的（如SAP）还是细胞外基质中的（如COLVI）。这种相互作用的强度通过图7中显示的COLVI和ATTR纤维之间的密切和结构特异性关联得到了证明。因此，非天然TTR抗体可能与不成熟的、非纤维状的ATTR沉积物相关（这些沉积物预计不会被AmyTracker染色），以及密集淀粉样沉积物周围的其他纤维状和非纤维状物质相关。基于这些观察结果，我们假设我们的结果与这样一个过程一致：非纤维状的TTR聚集体（寡聚体/原纤维），最有可能由全长TTR组成，首先沉积在血管基底膜中。已知这些寡聚体在ATTR多神经病变和心肌病患者的心脏中在血液中循环。然后可能发生两个过程，可能是平行的。首先，沉积的聚集体为循环中的非天然寡聚体TTR提供了一个有利的“着陆区”，因为两者之间的同型相互作用促进了沉积物的生长。其次，沉积的结构异质性聚集体会发生构象转换，形成更密集、更有结构且更稳定的交叉β-折叠淀粉样纤维。与COLVI（图7）和细胞外基质中的硫酸化糖胺聚糖（39，57，58）等物质的相互作用可能促进这种构象转换。像上面描述的构象转换过程已经在许多淀粉样蛋白生成蛋白的体外实验中被广泛观察到。此外，这一事件序列与TRANSgenic小鼠模型中的观察结果一致，在这些模型中，非淀粉样TTR沉积物在较年轻的年龄就出现在特定器官中。这些过程会产生具有由细胞外基质成分和其他纤维结合蛋白组成的密集纤维核心的TTR沉积物，周围环绕着非纤维状的TTR聚集体，血管病理学从初始沉积物形成时就开始了，但随着沉积物的增长和稳定而持续恶化，因为它们转变为了纤维形式。在这个背景下，淀粉样纤维与COLVI（如其他特征性的淀粉样结合蛋白）之间的相互作用被认为可以防止免疫系统识别和清除纤维，从而影响ATTR心肌病的进程和清除阶段。

TTR作为血管生成急性期反应物的作用仍在研究中，因此我们调查了TTR在病变组织中丰富的其他潜在解释。对组织匀浆和提取的纤维进行的蛋白质组学分析未能发现视黄醇结合蛋白4的存在，这使得视黄醇转运成为不太可能的机制。TTR是甲状腺素的次要载体，而其主要载体（甲状腺结合球蛋白）在蛋白质组学中的缺失表明TTR的存在与甲状腺素的输送无关。由于TTR/白蛋白的比例，也排除了被动血管渗漏的可能性。如图5所示，LV自由壁的心脏ATTR淀粉样变性的微血管结构与年龄匹配的对照组相比发生了损失，表现为过度血管化和血管减少的区域。这表明了异常的血管生成。异常的血管生成通常与肿瘤微环境相关，这是由生长中的肿瘤增加的代谢需求驱动的。我们样本中观察到的异常血管生成不太可能是由于代谢需求增加，因为没有肿瘤存在，如果血管生成是由增加的心肌需求驱动的，微血管的分布应该更加均匀。如果没有增加的代谢需求，血管生成的另一种解释是由于缺氧和血管化丧失引起的局部缺血信号。确实，图3显示在凝血异常的环境中（图2），毛细血管水平上出现了血栓，这会导致局部缺氧，并需要重新建立血管通路，从而触发血管生成。尽管这是首次在ATTR心肌病中发现毛细血管血栓的研究，但Yeh等人最近在A97S ATTR变异患者的腓肠神经中发现了伴有血栓炎症的微血管病变。这与我们在ATTR心肌病样本中观察到的病理生理学现象一致，表明两种组织趋向性可能存在共同的病理生理机制。Bellotti小组的研究也表明ATTR心肌病存在止血功能障碍，证明了TTR四聚体可以被胰蛋白酶和生理相关的血浆蛋白酶纤溶酶切割，这一假设在本研究中并未进行探讨。多项临床研究同样证实了ATTR心肌病中的微血管功能障碍。在一项针对心脏淀粉样变性（包括ATTR和AL型）患者的研究中，Chacko等人使用定量应力灌注心脏磁共振成像和心肌血流图谱技术发现，心脏淀粉样变性与严重的可诱导心肌缺血相关，其特征是弥漫性缺氧和微血管结构的破坏，伴有血管淀粉样沉积物、管腔狭窄和广泛的毛细血管损失。Netti等人在400名ATTR心肌病患者中检测出56%存在可量化的微血管阻塞。Clemmensen等人2018年的研究报告了类似的结果，临床心脏淀粉样变性患者的心肌氧消耗增加，心肌外部效率降低，这与超声心动图上的疾病进展相关。Dorbala等人观察到心脏淀粉样变性患者存在冠状微血管功能障碍和心绞痛症状，即使没有心外膜病变。基于这些观察结果，我们提出了一种新的ATTR淀粉样病变病理生理学假说：在血栓炎症性微循环阻塞的背景下，血管生成失调。毛细血管凝块的形成可能是由于内皮细胞与不稳定的错误折叠的TTR接触而被激活，从而产生局部缺氧环境，触发血管生成以重新供应缺氧组织的血液。我们假设，如果稳定的TTR能够结合并上调LRP1蛋白，将有助于有序的血管生成和适当的愈合。然而，如果不稳定的野生型TTR或遗传变异TTR结合但不激活LRP1，由于竞争性抑制和受体上调不足，会导致无序的血管生成。无序的血管生成阻碍了缺氧信号的消退，促使TTR迁移到缺乏目标受体的区域。在血管内皮细胞激活的血栓炎症环境中，血管通透性增加，毛细血管水平的血管壁缺失暴露出血管基底膜。在血管扩张和毛细血管通透性增强的情况下，局部高浓度的TTR会导致TTR外渗，错误的折叠TTR与基底膜的各种成分（尤其是COLVI）相互作用，导致TTR逐渐转化为β-折叠片状淀粉样纤维，进而堵塞血管基底膜。这种限制会阻碍细胞间的通讯，阻止有序的血管重建，从而导致ATTR心肌病中观察到的病理重塑和心脏储备功能下降。值得注意的是，如果上游的前毛细血管括约肌闭合，将在流动研究（如血管造影）中无法观察到微血管阻塞。由于tafamidis能够显著减少循环中的结构异质性TTR聚集体，它也可能通过抑制细胞外基质中的TTR构象转化，显著减少症状性心肌病患者的淀粉样沉积。Levites等人的最新研究使用阿尔茨海默病（AD）小鼠模型中的未富集蛋白质组学方法，识别出组织中对淀粉样β蛋白的反应变化。此外，这项研究还结合了Seifar等人的蛋白质组学分析，提供了更多证据，证明这些变化也存在于人类AD脑组织中。我们的ATTR心脏组织蛋白质组学数据与AD小鼠和人类AD脑组织的蛋白质组学谱型有显著重叠。关键的是，与淀粉样蛋白相互作用的蛋白质以及凝血、补体和血管生成相关的蛋白质在AD小鼠、AD人类大脑、野生型ATTR心肌病（与对照组相比）和V122I ATTR心肌病（与对照组相比）数据集中都有显著变化（P<0.05）。这些包括淀粉样标志蛋白载脂蛋白E、血管生成蛋白ADAMTS1、SFRP1和VCAN（versican），以及凝血和补体级联蛋白纤维蛋白原γ链。在AD小鼠、AD人类大脑和野生型ATTR（与对照组相比）数据集中，淀粉样标志蛋白VTN（维罗纳蛋白）以及凝血和补体级联蛋白纤维蛋白原α链和β链也发生了显著改变。总体而言，野生型ATTR和V122I ATTR数据集与Levites等人和Seifar等人的数据集有27%的重叠。我们的数据集与Levites等人的AD小鼠数据有36%的重叠，与Seifar等人的AD人类大脑数据集有57%的重叠。我们的研究使用了IP2分析管道来识别蛋白质，而AD研究使用了FragPipe。使用FragPipe重新分析可能会在我们的数据中发现额外的蛋白质，这也可以解释为什么在AD数据中识别出的关键蛋白质（如MDK和PTN）在我们的数据中缺失。因此，尽管转甲状腺素淀粉样变性和AD是不同的蛋白质病理，但组织中对淀粉样蛋白生成的反应可能存在共同之处。未来应进一步研究TTR在血管生成中的作用及其与LRP1的相互作用。理解TTR四聚体稳定性和LRP1激活之间的关系尤为重要，因为TTR四聚体的解离是ATTR聚集和纤维形成的限速步骤，而LRP1还与其他淀粉样疾病有关。这类研究对于理解TTR沉默疗法的长期安全性以及tafamidis在心脏ATTR治疗之外的潜在用途至关重要。如果这一假设正确，我们预计tafamidis治疗在疾病早期最为有益，因为在血管膜堵塞之前，还有足够的空间进行血管生成。进一步研究稳定型TTR四聚体在血管生成中的作用也可能表明tafamidis在治疗需要血管重建的微血管病变中的潜力。

**局限性**
本研究是对晚期散发性及遗传性ATTR心肌病的临床快照，患者表现出晚期病理特征；在我们的研究水平上，这些ATTR心肌病的病理特征基本无法区分。应对早期心肌病患者进行更多的微血管成像研究，以检验我们的假设并加深对病理过程的理解。尽管我们的病理成像和蛋白质组学数据缺乏患者间的变异信息，但这些数据表明，在心脏组织中对TTR聚集的反应以及人类脑组织中对淀粉样β聚集的反应在识别出的蛋白质方面有57%的重叠，包括那些与凝血、补体和血管生成相关的蛋白质，这为进一步验证这些假设提供了依据。收集更多早期和晚期ATTR心肌病心脏样本的必要性还在于，晚期A97S TTR多神经病患者中观察到的腓肠神经中的血栓炎症性微血管病变。

**结论**
这是首次使用组织清除技术对厚心脏样本进行三维成像，以可视化人类心脏淀粉样变性的病理情况。结合视觉化样本的蛋白质组学分析，这些数据共同提供了一个定性的蓝图和构建ATTR心肌病病理生理学叙事的基础。通过对散发性（野生型）和遗传性继承性ATTR心肌病（V122I）样本的研究，我们能够证明晚期ATTR心肌病中血管结构的丧失以及高血管化和低血管化区域的存在。野生型ATTR心肌病和V122I ATTR心肌病在表型上具有收敛性，这一点通过蛋白质组学和3D成像得到了证实，并通过冷冻电镜对淀粉样纤维结构的表征得到了进一步支持，同时还涉及COLVI等细胞外基质成分。此外，我们还观察到在凝血异常环境中毛细血管（直径<10 μm）水平的血栓形成。需要使用更大的样本队列和不同疾病阶段的样本进行进一步验证，以加强ATTR心肌病的微血管病变假说。然而，临床研究中也观察到缺氧和毛细血管丢失的情况，表明高血管化和低血管化是由缺氧诱导的血管生成所驱动的。尽管成像和蛋白质组学结果缺乏患者间的变异信息，使得结论具有探索性，但我们的成像数据和组织蛋白质组对淀粉样β和TTR聚集的反应的相似性提出了多个值得进一步研究的假设。

**资金来源**
该项目部分由美国国家神经疾病和中风研究所（NS095892）授予Gabriel C. Lander的资金、美国国家癌症研究所（R33CA281918）授予Li Ye的资金以及美国国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（DK046335）授予Jeffery W. Kelly的资金支持。Jan-Hannes Sch?fer获得了德国研究委员会（项目编号556478029）的资助。Robert T. O'Neil获得了George E. Hewitt医学研究基金会的资助。

**致谢**
Victoria Nudell为早期组织清除实验提供了培训和反馈。作者感谢Scripps研究所的Jean-Christophe Ducom和Charles Bowman在计算方面的支持。Emily P. Bentley提供了专业的编辑反馈。