一种微创的、基于超声心动图引导的小鼠退行性二尖瓣反流模型能够再现心脏重塑和心律失常的发生过程

《Journal of the American Heart Association》：Minimally Invasive, Echocardiography‐Guided Mouse Model of Degenerative Mitral Regurgitation Recapitulates Cardiac Remodeling and Arrhythmogenesis

　　摘要
背景
退行性二尖瓣反流（MR）是一种进行性的瓣膜疾病，会导致心房扩大、心脏重塑、心力衰竭和心律失常。目前使用的啮齿动物模型受到开胸手术或插管的限制，这些操作增加了手术风险并降低了可重复性。

方法与结果
我们通过经左心室尖端插入27G针头刺穿前二尖瓣瓣叶，建立了一种微创的、经胸超声引导的小鼠MR模型。10周大的C57BL/6J小鼠在诱导MR之前进行了基线成像，而对照组则仅接受尖端穿刺而未破坏瓣叶。彩色多普勒检测到反流射流和静脉收缩期宽度增加，手术存活率超过90%。2周后，MR小鼠表现出明显的心脏左室扩大、分数缩短和心肌纤维化，这些变化与对照组相比更为显著。压力-容积环分析显示舒张末期容积增加和顺应性降低。左心房组织的RNA测序显示钙信号通路、凋亡和剪切应力通路的富集。组织学检查证实心肌细胞凋亡增加，同时Connexin-43表达下调和ryanodine受体2磷酸化水平升高。程序性心房起搏在MR小鼠中引发了心房颤动，这表明其具有增强的心律失常易感性和钙处理异常。

结论
这种闭合胸腔、超声引导的小鼠模型能够可靠地诱导MR，避免了开胸手术，并重现了人类疾病的关键特征，包括心腔扩张、纤维化和心律失常易感性。它为瓣膜性心脏病的机制研究、基因干预和药物测试提供了一个可扩展的平台。

非标准缩写和术语
MR：二尖瓣反流
临床视角
新进展：
• 开发了一种微创的、经胸超声引导的小鼠模型，能够重现性诱导慢性反流、心腔重塑和心律失常变化，无需开胸手术。
临床意义：
• 这种闭合胸腔的MR模型紧密模拟了人类病理生理学，为瓣膜性心脏病和心房重塑的新疗法的机制研究和临床前测试提供了实用平台。

退行性二尖瓣反流（MR）是一种进行性的瓣膜疾病，其特征是由于二尖瓣结构破坏导致血液从左心室逆流至左心房。与功能性MR（由心腔扩张和心肌功能障碍引起）不同，退行性MR源于瓣叶或瓣膜装置的本质性损伤，受血流应力直接影响，且通常不会因心力衰竭治疗或心肌功能恢复而改善。慢性MR会引发剪切应力和容量过载，从而导致左心房（LA）扩大、左心室（LV）扩张、适应性重塑，最终发展为心力衰竭和心律失常。尽管外科修复技术有所进步，但发病率和死亡率仍很高，目前尚无经验证的药物治疗方法可以延缓疾病进展。大型动物（如狗和羊）的MR模型虽然提供了机制学见解，但成本高昂、操作繁琐且规模有限。虽然已有使用开胸手术的啮齿动物模型，但由于侵入性操作和恢复期延长，存活率较低。大多数先前的研究主要集中在反流射流对心室重塑的影响上，而忽视了其对心房心肌病（包括膜电位改变、钙稳态紊乱和随后的心律失常形成）的深远影响。因此，缺乏一个可靠且可重复的小动物模型来研究生理条件下的MR诱导重塑。为解决这一空白，我们开发了一种微创的、经胸超声引导的闭合胸腔小鼠模型。该模型无需开胸即可可靠地诱导瓣叶穿孔，从而提高了手术存活率、缩短了操作时间，并增强了可重复性。本文描述了该方法，通过多模态成像和组织学验证了MR的诱导效果，并探讨了心脏重塑和心律失常表型。该平台支持MR诱导的心脏功能障碍的机制研究和临床前药物测试。

动物和二尖瓣穿刺程序
所有程序均符合台湾Chi-Mei医学中心机构动物护理和使用委员会的指导原则（113–07）。本文所涉及的所有数据均可根据请求提供。使用10周大的雄性C57BL/6J小鼠（30–35克）。小鼠使用异氟烷（5%诱导浓度，2%维持浓度）麻醉，并通过心电图和体温监测进行麻醉管理。基线超声检查确认二尖瓣功能正常。小鼠随机分为对照组和MR组。在超声引导下，通过经胸尖端途径将27G针头插入左心室尖端并指向前二尖瓣瓣叶，在实时成像下进行穿刺（图1A；视频S1和S2）。对照组仅接受相同处理但不破坏瓣叶。彩色多普勒检测到反流射流和静脉收缩期宽度增加（图1B）。如果出现心包积液或急性血流动力学不稳定，动物将被排除。术后监测包括连续超声检查、体重测量、存活评估和非侵入性血压测量。在研究开始前，制定了研究方案，明确研究问题、关键设计特征和分析计划。

图1. 建立了一种微创的小鼠MR模型。A：通过左心室尖端插入27G针头经胸超声引导穿刺前二尖瓣瓣叶的示意图。B：代表性手术中图像及超声引导下的针头可视化（红色箭头表示左心室；黄色箭头表示二尖瓣）。C至G：对照组和MR组小鼠的体重、心率、收缩压、舒张压和平均血压的纵向变化。H：彩色多普勒检测到的MR组与对照组的心房颤流。I至M：心房直径、静脉收缩期宽度、间隔壁厚度、左心室内径和分数缩短的量化。N：存活曲线显示手术存活率超过90%（对照组N=8，MR组N=10）。数据以平均值±标准误表示。P值通过Student's t检验确定。AO表示主动脉；BW表示体重；DBP表示舒张压；FS表示分数缩短；HR表示心率；IVSD表示舒张期间隔壁厚度；LA表示左心房；LV表示左心室；LVIDd表示舒张期左心室内径；MR表示二尖瓣反流；MV表示二尖瓣；SBP表示收缩压；VC表示静脉收缩期宽度。*P<0.05。

超声随访
使用高频（30–40 MHz）线性阵列探头（S-Sharp Prospect T1系统，台湾）进行连续经胸超声检查，帧率大于150 Hz。小鼠使用1%至2%异氟烷轻度麻醉，并置于温度控制的平台上以保持正常体温。持续监测心率并控制在每分钟400至500次，以减少麻醉相关的心脏抑制。标准胸骨旁长轴（PLAX）图像用于评估心房直径、舒张期间隔壁厚度、左心室内径和二尖瓣形态。左心室分数缩短通过胸骨旁长轴视图中乳头肌水平的M模式记录测量。MR严重程度通过彩色和连续波多普勒成像评估。彩色多普勒成像在AP4C视图中进行，关注区域放大，调整Nyquist限制（40–60 cm/s）、最小壁滤光片和颜色增益以避开噪声。在收缩期，于二尖瓣开口下游的反流射流最狭窄处测量静脉收缩期宽度，电子卡尺垂直于射流方向放置。连续波多普勒检测二尖瓣反流射流时小心对齐以最大化信号强度。调整多普勒增益以避免信号饱和，并提高扫描速度（200–300 mm/s）以提高时间分辨率。记录反流峰值速度以用于MR特征分析。每个参数的测量值取3至5个连续心动周期的平均值。为确保可重复性，2名独立观察者分别进行两次静脉收缩期宽度的盲测。通过线性回归和组内相关性分析评估观察者间和观察者内的可靠性（图S1）。

血压测量
使用非侵入性的尾袖式容积描记系统（CODA High Throughput System，Kent Scientific，美国康涅狄格州托灵顿）测量血压。小鼠在测量前在温度控制平台上适应10至15分钟，以减少压力引起的变异。在尾部基部放置压迫和容积-压力记录袖带。每只小鼠获取≥10个有效测量值，并使用平均收缩压进行分析。测量由同一操作者在同一时间进行。

压力-容积环分析
研究结束时进行侵入性血流动力学评估。小鼠使用乌拉坦（500 mg/kg，腹腔注射）麻醉，暴露右颈动脉。使用PowerLab（ADInstruments）仪器逆行插入2.0F导管（SPR-838，Millar Instruments，美国）进入左心室。稳定后，记录稳态压力-容积环数据。先进行闭合胸腔测量，然后进行开放胸腔测量。通过轻微的外部压迫封闭下腔静脉以获得负载独立的指标。收缩功能通过舒张末期压力、容积、+dP/dt、动脉弹性和舒张末期压力-容积关系进行量化。舒张期指标包括舒张末期压力、容积、-dP/dt、松弛常数（Tau）和舒张末期压力-容积关系。

组织学和免疫染色
二尖瓣穿刺28天后，在深度麻醉下通过颈椎脱位处处死小鼠。取出心脏，称重并按胫骨长度标准化。组织固定在4%戊二醛中，包埋在石蜡中，切片厚度为5 μm。进行苏木精-伊红染色以观察形态，Masson三色染色用于量化心肌纤维化（蓝色染色表示胶原蛋白与红色染色心肌的比例）。使用phalloidin-Alexa Fluor 488荧光染料对固定细胞或心脏组织切片进行免疫荧光染色，以可视化F-actin和Connexin-43（1:200；Cell Signaling Technology，马萨诸塞州）或小麦胚芽凝集素（Biotium，加利福尼亚州）的初级抗体，随后使用Alexa Fluor-结合的二级抗体。用DAPI对细胞核进行复染。使用TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP标记）检测心脏切片中的凋亡细胞，并将同时表达F-actin和TUNEL的心肌细胞计为凋亡心肌细胞。在用小麦胚芽凝集素染色的左心室切片上评估心肌细胞横截面积，使用ImageJ软件对具有中心核的横向切割心肌细胞进行分析，每颗心脏分析≥30个细胞。荧光图像使用Olympus BX51显微镜（Olympus光学有限公司，日本东京）拍摄，每个切片随机选择10个区域进行量化。

心房颤动诱导
通过程序性起搏测试心房颤动（AF）的易感性。在轻度麻醉（1%–1.5%异氟烷）下，将1.1F八极导管经食道插入后左心房。使用Grass S88刺激器以20 Hz（脉冲宽度2毫秒，超过舒张压阈值）频率进行2至3秒的爆发性起搏。实时监测心电图。心房颤动定义为起搏后持续超过1秒的不规则心房节律。每只小鼠进行3至5次起搏尝试。易感性以触发AF的起搏次数比例表示，每次发作的持续时间进行测量。

RNA测序
从接受假手术或手术诱导MR的成年C57BL/6小鼠（每组n=3只）中提取左心房组织。使用Tritzol试剂提取总RNA，并通过Bioanalyzer验证RNA完整性。使用Poly-A选择制备文库，并在Illumina平台上进行测序，生成150 bp的配对末端序列。经过FastQC质量控制后，将清洁序列与小鼠参考基因组（GRCm39）对齐。使用StringTie进行转录组组装和量化，然后使用DESeq2进行差异表达分析。|log2倍数变化|>1且P<0.05的基因被视为显著基因。使用clusterProfiler进行基因本体论和京都基因与基因组百科全书途径的功能注释和富集分析。使用heatmap生成热图和聚类图，以可视化MR组和对照组之间的基因-途径相互作用，突出显示MR组的心房重塑特征。所有原始测序数据已存入Gene Expression Omnibus，访问号为GSE325528。

Western Blot检测凋亡蛋白和ryanodine受体2磷酸化
将左心房组织在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中匀浆。使用BCA试剂（Thermo Fisher Scientific）测定总蛋白浓度。将等量的蛋白质（20–40 μg）分离并通过SDS-PAGE转移到PVDF膜上。在5%非脂肪牛奶中封闭后，膜在4°C下过夜孵育，加入针对cleaved caspase-3（1:500；Cell Signaling，马萨诸塞州）、Bax（1:500；Cell Signaling，马萨诸塞州）、RyR2（ryanodine受体2；1:500；Cell Signaling，马萨诸塞州）和磷酸化RyR2（Ser2814；1:500；Cell Signaling，马萨诸塞州）的初级抗体。使用增强化学发光法检测蛋白质，并在ImageJ中通过密度计量化。GAPDH（1:5000，Sigma-Aldrich Co., 圣路易斯，密苏里州）作为内部加载对照。

流式细胞术检测心肌细胞凋亡
使用胶原酶消化和机械分离方法从左心房组织中新鲜分离心肌细胞，然后通过40 μm网孔过滤得到单细胞悬浮液。细胞与结合有FITC的抗心肌肌钙蛋白T抗体一起孵育，以识别心肌细胞；在分析前立即加入碘化丙啶以检测凋亡/坏死细胞。流式细胞术在BD FACSAria III（BD Biosciences）上进行。数据使用FlowJo软件进行分析，门控基于前向/侧向散射和荧光强度。碘化丙啶+/肌钙蛋白+细胞被量化为每个样本中凋亡心肌细胞的百分比。每只小鼠至少获取10,000个肌钙蛋白阳性事件。

**统计分析**
所有数据以平均值±标准误（SEM）呈现。使用Shapiro–Wilk检验评估正态性。对于正态分布的变量，使用非配对Student's t检验比较两组；对于非正态分布的变量，使用Mann–Whitney U检验进行比较。对于多个组之间的比较，根据情况应用1-步ANOVA后跟Tukey's post hoc检验或Kruskal–Wallis检验并使用Dunn's校正。分类变量使用Fisher's精确检验进行分析。生存分析使用Kaplan–Meier曲线进行，组间差异通过log-rank检验评估。在随机选择的动物亚组中，使用2-元混合效应模型评估超声心动图的测量内观察者可靠性。来自RNA测序的基因表达差异使用DESeq2进行分析，并应用Benjamini–Hochberg校正以控制假发现率（<0.05）。双侧P值<0.05被认为具有统计学意义。统计分析使用GraphPad Prism（v8.0）进行。所有超声心动图、组织学和Western blot分析均由不了解组分配的研究人员执行。

**结果**
**小鼠MR模型的手术可行性与生存率**
在C57BL/6J小鼠中，通过经胸超声心动图引导，对前尖瓣膜进行微创、超声引导的闭合胸腔穿刺。通过彩色多普勒可视化新的反流喷流确认了MR的存在，且静脉收缩期宽度显著增加，这与中度至重度MR一致（图1B；视频S3和S4）。排除了有心包积液或急性血流动力学不稳定的动物。MR诱导后，体重和心率保持不变，但收缩压、舒张压和平均血压低于假手术组（图1C–G）。连续超声心动图显示，在2周和4周时左心房（LA）逐渐扩大和左心室（LV）扩张（舒张末期LV内部尺寸），同时射血分数降低，表明尽管心室壁厚度（舒张期心室间隔）没有显著变化，但仍存在收缩功能障碍（图1H至1M）。手术生存率超过90%，大部分死亡发生在前10天内，之后生存率稳定（图1N）。静脉收缩期测量的内观察者可靠性显示出良好的相关性（R2=0.972），独立观察者之间的共识也很高（R2=0.979），证实了测量方法的稳健性和一致性（图S1）。此外，压力-容积环分析显示LV舒张末期容积增加和顺应性降低，这与容积超负荷和不良重构一致（图2）。这些发现与慢性MR患者观察到的血流动力学改变非常相似。详细的超声心动图和血流动力学参数显示在表S1中。

**组织病理学重构**
如图3A所示，MV穿刺28天后，尸检显示MV前瓣膜有一个明显的孔洞。与假手术组相比，MR组的心脏重量与体重比和心脏重量与胫骨长度比显著增加（图3B）。值得注意的是，所有MR小鼠的心脏尺寸均增大（图3C）。Masson三色染色显示，MR小鼠的心房和心室组织中的间质纤维化明显增加（图3D和3E）。通过量化小麦胚芽凝集素标记的F-Actin阳性心肌细胞的横截面积，我们观察到MR小鼠的心肌细胞宽度与假手术对照组相似（图3F至3G）。

**分子重构与凋亡**
为了进一步研究MR诱导的流应力对转录的影响，对3只假手术组和3只MR小鼠的左心房（LA）组织进行了RNA测序分析。基因本体论（GO）富集显示了与钙离子转运、氧化应激和细胞骨架组织相关的通路（图4A）。京都基因组与基因百科全书（KEGG）通路和热图聚类分析显示流体剪切应力、动脉粥样硬化、钙信号传导和凋亡的显著富集（图4B和4C）。Circos可视化进一步说明了基因-通路关联，强调了在MR诱导的血流动力学应力下，心房组织从凋亡、钙信号传导到流体剪切应力的分子重编程（图4D）。使用TUNEL染色，我们确认MR小鼠的心房心肌细胞凋亡增加（图5A至5C）。流式细胞术还显示MR心房中碘化丙啶+/肌钙蛋白+心肌细胞增加（图5D）。Western blot和Bax、caspase-3及其切割产物的量化显示MR心房中凋亡信号的上调（图5E至5G）。

**心房颤动（AF）的易感性和激活的钙信号传导**
为了评估MR是否也再现了AF的表型，我们进行了经食道爆发放电，并观察到MR小鼠中AF的发生比例显著高于假手术组（图6A和6B）。值得注意的是，connexin-43免疫染色显示MR心房中的间隙连接表达模式受损，表明电耦合受损（图6C和6D）。同样，connexin-43的蛋白质表达在MR心房中也下调（图6E和6F）。相比之下，MR心房中RYR2（RyR2，一种关键的细胞内Ca2+释放通道调控因子）的磷酸化也增加，这与钙处理异常一致（图6E和6G）。这些结构改变共同表明了不良重构，激活了凋亡通路并破坏了钙平衡。心房纤维化、间隙连接重构和钙调节异常可能增加了心律失常的发生。这些结果表明该模型再现了退行性MR及其后续AF的关键临床并发症（图7）。

**讨论**
在这项研究中，我们开发并验证了一种新型的微创、经胸超声心动图引导的小鼠MR模型。该模型相比之前的方法（依赖于开胸手术或大型动物模型）具有重要的方法学进步。通过消除开胸手术，我们缩短了手术时间，提高了术后生存率，并增强了可重复性。重要的是，该模型再现了人类退行性MR的特征，包括心腔扩张、收缩功能障碍、心肌纤维化和心律失常易感性。我们的结果强调了高频超声心动图在手术指导和术后验证中的实用性。彩色多普勒可靠地确认了瓣膜穿孔和反流流动，连续成像显示了渐进性重构。值得注意的是，我们之前已将这种微创MR模型应用于大鼠，以研究药物干预，并证明 dapagliflozin显著改善了心脏功能，减少了纤维化，并减轻了内质网应激相关损伤。这些发现进一步验证了该模型在测试针对MR诱导的心脏重构和心力衰竭的治疗策略中的转化价值。能够进行重复的非侵入性评估允许进行纵向随访，并减少了动物数量，符合精简和减少动物研究的原则。我们的结果表明，反流流动引起的流应力破坏了钙处理，激活了凋亡通路，并下调了connexin-43，共同导致纤维化和电不稳定。这些结果与先前研究一致，表明内质网应激和活性氧信号在MR诱导的重构中起作用。此外，MR小鼠左心房组织的RNA测序分析揭示了独特的转录重编程，整合了凋亡、钙调节紊乱和纤维化。Bax和切割caspase-3的上调表明凋亡级联的激活，这与慢性容积超负荷下的心房心肌细胞丢失一致。Ryr2和钙依赖性信号分子的改变表达突显了钙平衡的破坏，这是收缩功能障碍和心律失常形成的关键驱动因素。Mmp2、Mmp9、Vcam1和Icam1的上调表明细胞外基质周转和炎性细胞黏附增强，这与MR中的组织学观察结果一致。流体剪切应力相关通路的富集进一步支持了异常血流动力学力量在激活机械敏感性和氧化应激反应中的作用。总之，这些发现表明MR中心房的不适应回归不是单一过程，而是机械应力、氧化损伤和分子信号网络的共同作用结果，提供了潜在的治疗靶点以减轻纤维化和功能障碍。与我们之前报道的MR小鼠模型相比，我们的经胸超声心动图引导的尖瓣穿刺平台具有几个重要的方法学和病理生理学优势。早期的模型依赖开胸手术结合射频烧灼来破裂尖瓣膜，这引入了显著的围手术期风险和病变大小的变异性；而较新的闭合胸腔方法主要关注心室扩张和血流动力学变化，对心房病理学的表征有限。相比之下，我们的模型专门设计用于研究MR诱导的心房心肌病，并可重复地再现心房重构的关键特征，包括左心房扩大、间质纤维化、心肌细胞凋亡、connexin-43下调、RyR2过度磷酸化以及心房颤动易感性的增加。由于小鼠心率较高（约500次/分钟），尖瓣膜在27号针孔处的重复振荡产生了持续的、生理相关的机械应力，无需电外科损伤，且尸检一致地确认了局部瓣膜破坏而没有附带的热损伤。重要的是，我们对左心室重塑的分析显示，在小麦胚芽凝集素染色切片上，假手术组和磁共振（MR）组小鼠的心肌细胞横截面积相当，这表明没有细胞扩张现象；这一发现与Wu等人的先前研究结果一致，他们的研究表明磁共振主要诱导心肌细胞的纵向生长，这与体积过载驱动的离心性重塑相符，而不是压力过载相关的心肌肥大。综合这些数据，我们的模型被认为是一个可靠且具有转化意义的平台，能够捕捉到钙代谢紊乱和心房心律失常的机制，从而有助于对磁共振诱导的心房疾病进行深入研究。在解释我们的发现时，需要承认几个限制因素。首先，尽管这种外科穿刺模型具有可重复性和微创性，但它并不能完全模拟人类磁共振引起的心脏病变谱系，特别是腱索断裂和后叶受累的情况。叶片的急性机械损伤可能与慢性重塑过程不同，可能会影响后续的分子反应。其次，虽然磁共振组小鼠可以存活数月，但我们的研究仅持续了4周，这足以观察心房心肌病和心律失常的发生，但可能无法完全反映心房纤维化、心室重塑或代偿性适应的长期进展。第三，虽然我们识别出了一些关键途径，但尚未探讨其机制上的因果关系，需要功能研究将特定的分子改变与心律失常联系起来。第四，本研究中的磁共振诱导是在雄性小鼠中进行的；然而，性别差异可能会影响磁共振诱导的重塑过程，包括雌激素信号对心肌肥大和纤维化的调节作用。未来的工作将把这种磁共振模型扩展到雌性小鼠身上，以探讨这些潜在的性别依赖性反应。最后，仅使用年轻的雄性C57BL/6J小鼠限制了该模型在性别、品系和年龄上的普适性，这些因素可能会影响其对磁共振诱导重塑的敏感性。

**结论**

我们提出了一种可重复的、微创的小鼠模型，能够准确反映人类的病理生理学特征。该平台支持高通量的机制研究、基因操作和临床前药物测试，代表了瓣膜性心脏病转化研究的重要进展。

**资金来源**

我们感谢启美医疗中心和国立中山大学为这项工作提供的资金。Chang Wei-Ting得到了台湾教育部的Yu-Shan奖学金的支持。

**致谢**

Chang Wei-Ting、Chen Chin-Yu和Shih Jhih-Yuan对研究概念的提出做出了贡献。Chang Wei-Ting负责研究设计和实验实施。Wu Nan-Chun和Shih Jhih-Yuan参与了文章的撰写。所有作者都对本文进行了审阅。