可溶性血栓调节蛋白在COVID-19期间将病毒血症与死亡率联系起来：ACTIV-4a试验的结果

《Journal of the American Heart Association》：Soluble Thrombomodulin Links Viremia and Mortality During COVID‐19: Results From the ACTIV‐4a Trial

　　**摘要**
**背景**
COVID-19和其他呼吸道病毒感染可能导致心血管并发症。SARS-CoV-2病毒颗粒可以在血液中检测到，循环中的病毒RNA水平与死亡风险相关。我们假设病毒血症可能诱发血栓性内皮病变，从而加剧死亡。我们在因COVID-19住院并参与ACTIV-4a（加速COVID-19治疗干预和疫苗）随机试验的患者中研究了这种关系，该试验评估了抗血栓治疗的效果。

**方法**
我们量化了血浆中的SARS-CoV-2核衣壳RNA和蛋白质，并测量了它们与临床结果以及血栓炎症和内皮病变生物标志物之间的关联。我们使用Cox回归和Fine-Gray竞争风险模型来分析生存率和血栓形成。我们还进行了因果中介分析，以探讨血栓性内皮病变是否介导了病毒RNA与死亡之间的关系。

**结果**
在93名患者中，非存活者的SARS-CoV-2 RNA和N抗原水平较高。基线病毒RNA水平与90天死亡率增加（风险比[HR]为1.31 [95% CI, 1.17–1.46]）和血栓形成（HR为1.35 [95% CI, 1.24–1.47]）相关。病毒RNA比N抗原水平更能有效预测患者的生存情况。可溶性血栓调节蛋白（一种血栓性内皮病变的生物标志物）与病毒RNA水平呈正相关。中介分析显示，在调整年龄和性别后，可溶性血栓调节蛋白解释了病毒RNA与90天死亡率之间关系的12.2%（95% CI, 0.1%–32.3%；P=0.048）。

**结论**
在ACTIV-4a试验中，血浆中SARS-CoV-2 RNA水平升高与死亡风险相关，这一关系部分由可溶性血栓调节蛋白介导。我们认为，呼吸道病毒通过血液传播可能是导致心血管并发症的潜在机制。

**注册信息**
URL: https://www.clinicaltrials.gov; Unique Identifier: NCT04505774

**非标准缩写和首字母缩略词**
ACTIV-4a：加速COVID-19治疗干预和疫苗
ACTT-1：适应性COVID-19治疗试验
ATTAC：抗血栓治疗以缓解COVID-19的并发症
REMAP-CAPA：社区获得性肺炎的随机、嵌入式、多因素、适应性平台试验
RAGE：晚期糖基化终产物的可溶性受体
sTM：可溶性血栓调节蛋白
THBD：血栓调节蛋白基因

**研究展望**
• 在需要住院治疗的COVID-19感染期间，循环中的病毒RNA（即病毒血症）与血栓事件和死亡风险增加相关。
• 病毒RNA水平还与可溶性血栓调节蛋白相关，后者部分介导了病毒RNA与死亡之间的关系，表明病毒血症可能诱发内皮病变，导致更严重的临床结局。
• 未来的研究可以探讨其他呼吸道病毒感染（如流感）期间的病毒血症和可溶性血栓调节蛋白是否也与不良结局相关，以及是否可以通过治疗手段改善这些病毒感染期间的心血管结局。

**参考文献**
（此处列出相关研究的参考文献）C、D、盒须图显示了血浆病毒RNA（C）或N抗原（D）水平，按采样天数分层，并比较了未存活者（蓝色）和存活者（橙色）。虚线连接了每个组（存活者与未存活者）在每个采样日期的中位数值，以显示病毒RNA或N抗原水平的纵向趋势。在（C）中，样本分布如下：第0天：存活者（n=70），未存活者（n=18）；第3天：存活者（n=71），未存活者（n=17）；第7天：存活者（n=40），未存活者（n=16）；第14天：存活者（n=16），未存活者（n=11）。在（D）中，样本分布如下：第0天：存活者（n=62），未存活者（n=17）；第3天：存活者（n=63），未存活者（n=17）；第7天：存活者（n=37），未存活者（n=15）；第14天：存活者（n=14），未存活者（n=10）。显著性表示如下：不显著（空白），*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

血浆SARS-CoV-2 RNA水平与血栓形成有关
十三名患者（14%）在住院期间有临床记录的血栓事件。有血栓记录的患者与死亡患者之间存在重叠（13名有血栓的患者中有6名[46%]）。无论初始疾病严重程度如何，有血栓记录的患者的RNA水平均较高（图2A）。仅当比较整个队列中的所有患者时，N抗原水平在有血栓的患者中更高（图2B）。在时间上，有血栓的患者的RNA水平在整个研究期间都较高（图2C；组间交互项Study Day*Thrombosis的P值为1.24×10^-5）。然而，有血栓和无血栓的患者之间的N抗原时间趋势没有显著差异（图2D；组间交互项Study Day*Thrombosis的P值为0.72）。

A、B、盒须图显示了按疾病严重程度分层的血浆病毒RNA（A）和N抗原（B）水平，并比较了血栓事件的发生率。统计比较使用了Wilcoxon秩和检验。C、D、盒须图显示了按采样天数分层的血浆病毒RNA（C）或N抗原（D）水平，并比较了“有”血栓（紫色）和“无”血栓（棕色）的情况。虚线连接了每个组（“有”血栓与“无”血栓）在每个采样日期的中位数值，以显示病毒RNA或N抗原水平的纵向趋势。在（C）中，样本分布如下：第0天：“无”血栓（n=75），“有”血栓（n=13）；第3天：“无”血栓（n=75），“有”血栓（n=13）；第7天：“无”血栓（n=42），“有”血栓（n=14）；第14天：“无”血栓（n=18），“有”血栓（n=9）。在（D）中，样本分布如下：第0天：“无”血栓（n=66），“有”血栓（n=13）；第3天：“无”血栓（n=67），“有”血栓（n=13）；第7天：“无”血栓（n=38），“有”血栓（n=14）；第14天：“无”血栓（n=16），“有”血栓（n=8）。显著性表示如下：不显著（空白），*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

血浆SARS-CoV-2 RNA水平与血栓炎症生物标志物相关
鉴于病毒RNA与血栓事件之间的关联，我们测量了9个关键的宿主反应血栓炎症生物标志物，以确定它们与循环SARS-CoV-2 RNA水平的相关性。所有测量生物标志物在不同疾病严重程度下的分布见图S2和表S3。如图3A所示，RNA水平与整个队列中可溶性晚期糖基化终产物受体（sRAGE）、前钙调蛋白原、pentraxin-3、白细胞介素-8、白细胞介素-6和fractalkine的血浆水平显著相关。我们发现，在非重症组中，RNA水平与sRAGE、pentraxin-3和白细胞介素-6显著相关。在重症组中，RNA水平与sRAGE和fractalkine的血浆水平相关。与血栓炎症生物标志物不同，我们发现血浆SARS-CoV-2 RNA水平与凝血标志物之间的相关性很少（图3B）。值得注意的是，病毒RNA水平仅与sTM相关，sTM是一种广泛表达在内皮细胞管腔表面的膜糖蛋白，其他研究表明它与COVID-19期间的更差临床结果有关。tPA抗原的水平也与血浆RNA水平相关（Spearman r=0.31，未调整时的P=0.022，但在多变量校正后这种相关性不再显著（P=0.056），这可能是由于可用样本较少（n=56）。基于SARS-CoV-2 RNA水平与sTM之间的这种新关联，我们试图更好地理解SARS-CoV-2与sTM之间的生物学关系。

A、B、气泡图显示了按疾病严重程度分层的细胞因子（A）或血栓标记物（B）与血浆病毒RNA之间的相关性。点代表Spearman相关系数估计值，点的大小表示统计显著性。注意：在多变量校正后，所有队列中tPA与血浆RNA水平之间的正相关性的P值为0.055。Ang-2表示血管生成素-2；IL表示白细胞介素；sRAGE表示可溶性晚期糖基化终产物受体；sTM表示可溶性血栓调节素；sTNFR表示可溶性肿瘤坏死因子受体；tPA表示组织纤溶酶原激活剂。

血栓调节素RNA转录本在肺部和心脏中的数量最多，而在COVID-19感染期间，血栓调节素表达细胞中更可能出现SARS-CoV-2 RNA转录本。编码血栓调节素的THBD基因在全身组织的内皮细胞和其他细胞中广泛表达。然而，关于其在急性病毒感染（如SARS-CoV-2）期间的表达了解较少。我们使用了17名死于COVID-19的患者的肺、心脏、肝脏和肾脏样本进行的公开单核RNA测序数据。图4A显示，THBD在肺（3.34%的细胞）和心脏（2.64%）中的表达频率高于肝脏（0.66%）和肾脏（0.62%）。通过自动注释肺样本分配的簇和预测的细胞类型（图4B；N=99,735个细胞核），THBD转录本在内皮细胞（包括血管内皮和淋巴内皮细胞）以及单核吞噬细胞（包括巨噬细胞和单核细胞）中最丰富（图4C）。值得注意的是，这些细胞类型中报告的病毒转录本更可能是流产性复制。有趣的是，我们有发现表达SARS-CoV-2 RNA的细胞更有可能表达THBD（图4D）。总之，血栓调节素在肺和心脏内皮中转录，并与SARS-CoV-2 RNA相关，为其心血管并发症提供了生物学上的合理机制。因此，我们试图了解病毒RNA、sTM和临床结果之间的关系。

我们使用未调整和多变量调整的时间至事件生存分析来估计90天死亡的概率，考虑了血栓、血浆病毒RNA和N抗原水平以及凝血标志物。调整后的估计值见表S4。在未调整的模型中，临床记录的血栓与所有患者的90天死亡风险比（HR）增加相关（HR，3.44 [95% CI, 1.29–9.21]；P=0.014）以及非重症组患者的HR（HR，21.04 [95% CI, 2.86–154.49]，P=0.003），但在重症组患者中则不相关（HR，1.41 [95% CI, 0.44–4.49]，P=0.57，如表2所示）。此外，对于SARS-CoV-2血浆RNA水平每增加1个标准差，所有患者的90天死亡风险比为2.53（95% CI, 1.7–3.77；P<0.001），非重症组患者的HR为4.36（95% CI, 1.57–12.08；P=0.005），重症组患者的HR为1.98（95% CI, 1.18–3.33；P=0.01）。重要的是，我们没有发现N抗原水平与90天死亡之间存在任何统计学上的显著关联。我们还发现sTM水平与死亡之间存在显著关联，因为sTM水平每增加1个标准差，所有患者的90天死亡风险增加（HR，1.58 [95% CI, 1.15–2.16；P=0.005）以及非重症组患者的HR（HR，1.89 [95% CI, 1.12–3.18；P=0.016），但在重症组患者中则不相关（HR，1.33 [95% CI, 0.86–2.06；P=0.2）。sTM水平与治疗组分配之间没有显著的相互作用。值得注意的是，对于血浆纤维蛋白原每增加1个标准差，重症组的90天死亡风险降低（HR，0.54 [95% CI, 0.31–0.97；P=0.038），这可能反映了一些重症COVID-19患者的消耗性凝血病。总体而言，这些数据表明SARS-CoV-2 RNA和sTM水平与90天死亡之间存在剂量依赖性关联。

我们使用Fine-Gray竞争风险分析来估计血栓事件的发生概率，同时考虑了死亡的竞争风险。调整后的分析见表S5。未调整的分析显示，在所有患者中，血浆RNA水平每增加1个标准差，血栓的HR（HR，2.84 [95% CI, 2.11–3.82]；P<0.001），非重症组患者的HR（HR，5.13 [95% CI, 2.14–12.31；P<0.001），以及重症组患者的HR（HR，2.37 [95% CI, 1.69–3.34；P<0.001）。我们还发现非重症组患者中sTM每增加1个标准差，血栓发生率显著增加（HR，1.65 [95% CI, 1.09–2.52；P=0.019）和tPA每增加1个标准差，血栓发生率也显著增加（HR，2.27 [95% CI, 1.11–4.64；P=0.024）。如图S4所示，有血栓的患者的生存情况更差（P=0.0087），而非重症组患者的生存情况也较差（P<0.0001），但在重症组患者中则不显著（P=0.56）。鉴于SARS-CoV-2病毒血症、sTM水平与死亡之间的强烈关系，我们应用了中介模型来评估因果效应。

Cox比例风险比率用于按疾病严重程度分层的死亡分析。所有变量：非重症组（HR，95% CI；P值）和重症组（HR，95% CI；P值）。HR表示危险比；sTM表示可溶性血栓调节素；TPA表示组织型纤溶酶原激活剂。sTM介导了血浆病毒血症与死亡率之间的一部分关系。我们假设由sTM所模拟的血栓性内皮病变可能介导血浆病毒血症与死亡率之间的关系。图5展示了一个表示这种概念关系的有向无环图。基于我们的发现，即sTM与血浆RNA血症相关（图3），并且血浆RNA水平和sTM都与90天死亡风险增加有关（表2），我们进行了因果中介分析。我们使用了sRAGE作为生物对照，它是肺上皮损伤的标志物，与血浆RNA水平的相关性最强（图3A）。在对整个队列进行未调整的分析中，sTM显著介导了90天死亡与基线病毒RNA水平之间的一部分关系（中介效应的比例为14.8% [95% CI, 0.9%–39.6%]），在调整年龄和性别后这一效应仍然显著（效应为12.2% [95% CI, 0.3%–30.4%）（表4）。sRAGE的趋势相似，但没有达到统计显著性，因为未调整和调整后的模型置信区间有重叠（未调整的95% CI为-1.1%至60.3%；调整后的95% CI为-0.3%至59.5%）。总体而言，这些数据表明sTM具有因果关系，部分介导了SARS-CoV-2病毒血症与90天死亡率之间的关联。

**图5. 表示SARS-CoV-2 RNA与90天死亡率（直接效应）之间概念关系的有向无环图。**曲线箭头表示可能由内皮功能障碍（以sTM的对数10水平衡量）或上皮损伤（以可溶性RAGE的对数10水平衡量）介导。RAGE表示晚期糖基化终产物的受体；sTM表示可溶性血栓调节素。

**表4. 按疾病严重程度分层的血浆SARS-CoV-2 RNA与生物标志物的因果中介分析**

| 值 | Log(sTM) | Log(RAGE) | 未调整 | 调整后 | 未调整 | 调整后 | 系数（95% CI） | P值 | 系数（95% CI） | P值 | 系数（95% CI） | P值 | 系数（95% CI） | P值 | 总效应 |
|----------------|---------|-----------|-----------|-----------|-----------|-----------|-----------|-----------|-----------|-----------|-----------|-----------|-----------|
| 0.33 | (0.178至0.489) | <2e-16 | 0.32 | (0.196至0.473) | <2e-16 | 0.32 | (0.162至0.457) | <2e-16 | 0.31 | (0.155至0.452) | <2e-16 | |
| 平均中介效应 | 0.048 | (0.003至0.118) | 0.024 | 0.039 | (0.001至0.099) | 0.040 | (?0.004至0.164) | 0.058 | (?0.01至0.141) | 0.092 | |
| 平均直接效应 | 0.28 | (0.127至0.441) | 0.002 | 0.28 | (0.162至0.432) | <2e-16 | 0.26 | (0.079至0.4) | 0.002 | 0.26 | (0.083至0.404) | 0.002 |
| 介导的比例 | 0.15 | (0.009至0.396) | 0.12 | (0.003至0.304) | 0.18 | (?0.011至0.603) | 0.16 | (?0.03至0.595) | | | |

**所有结果均以估计值（95% CI）报告。**调整后的模型包括年龄和生物性别的潜在混杂因素。计算使用R “mediate”包完成。RAGE表示晚期糖基化终产物的受体；sTM表示可溶性血栓调节素。

**讨论**
我们在ACTIV-4a随机试验中发现了SARS-CoV-2病毒血症、sTM水平与COVID-19住院患者死亡率之间的一种新的、可能是因果的关系。我们发现，非生存者的血浆SARS-CoV-2 RNA浓度显著高于生存者，尽管血浆SARS-CoV-2 N抗原蛋白浓度在疾病后期对感染的敏感性更高，但两者之间没有显著差异。我们发现血浆RNA水平与血栓形成之间存在类似关联，这与临床记录有血栓形成的患者和死亡患者的重叠一致。值得注意的是，非严重SARS-CoV-2感染患者在出现血栓事件时的死亡风险显著增加，而严重感染患者则没有。这与REMAP-CAP（一个随机、嵌入式、多因素、适应性平台试验，用于社区获得性肺炎）、ACTIV-4a和ATTACC（抗凝治疗以改善COVID-19并发症）研究人员的发现一致，他们发现治疗性抗凝在非严重SARS-CoV-2感染中具有死亡益处，但在严重感染中则没有益处。我们还发现了病毒RNA与sTM之间的显著关联，sTM是血栓性内皮病变的标志物。我们使用公开的转录组数据确认了这种关联的生物学合理性，这些数据表明血栓调节素转录本在肺细胞和心脏细胞中最常见，频繁出现在内皮细胞和单核细胞中，并且在感染期间与病毒RNA相关。最后，SARS-CoV-2病毒血症和sTM水平都与90天死亡风险增加和血栓形成风险增加相关。重要的是，sTM介导了病毒血症与死亡率之间的一部分关系。总体而言，我们解释这些发现表明完整的SARS-CoV-2病毒颗粒从肺部转移到血液中可能促进血栓性内皮病变，为理解病毒性呼吸道感染与其心血管并发症之间的关系提供了一种潜在机制。

我们的发现表明，SARS-CoV-2核衣壳RNA可能比核衣壳蛋白水平更能区分临床结果，尽管两者有中等程度的相关性，这可能表明它们的动力学存在重要差异。几项研究表明，核衣壳RNA和抗原与急性COVID-19的严重程度和不良预后相关。这种关联的类型和强度可能取决于时间、患者和疾病特征以及检测平台的差异。在同时检测血浆病毒RNA和抗原的研究中，临床结果与血浆抗原之间的关系比病毒RNA更为复杂。例如，在住院患者中，RNA血症比抗原血症更早可以被检测到，基线时的RNA血症与非生存者的关联比抗原血症更强烈，但在住院期间任何可检测到的抗原血症也与死亡强烈相关。在ACTT-1（适应性COVID-19治疗试验）中，基线时的血浆病毒RNA，而不是基线时的血浆抗原，可以区分中度/重症和危重疾病以及生存情况，而且RNA血症和抗原血症的下降都与恢复时间缩短和死亡减少相关。检测血浆抗原水平的复杂性可能反映了血液中SARS-CoV-2特异性免疫反应的动态。血液中存在的核衣壳特异性抗体可能在不同程度上掩盖核衣壳抗原的检测，这取决于抗体与抗原的相对水平。因此，进一步研究COVID-19期间血液中病毒RNA和蛋白的检测差异可能有助于将病毒血症作为潜在的诊疗标志物。我们进一步推测，研究其他呼吸道病毒感染（如流感）期间的病毒血症可能有助于阐明下呼吸道感染与其心血管并发症之间的联系。

除了病毒RNA和蛋白水平之间的差异外，我们还注意到血栓性内皮病变标志物的一些复杂性。在当前研究中，我们观察到血浆sTM对基线时血浆SARS-CoV-2 RNA水平与90天死亡率之间有适度的中介效应。我们还注意到tPA抗原水平与病毒RNA水平以及血栓事件之间的相关性，同时考虑了死亡的竞争风险。这些发现共同表明血栓性内皮病变参与了COVID-19感染中的死亡和心血管并发症。然而，尚不清楚为什么另一种内皮生物标志物血管生成素-2的水平与该队列中的病毒RNA水平无关，尽管先前的研究报道血浆血管生成素-2水平与COVID-19的重症监护病房入住有关。其他人报告了不同供体的肺微血管内皮细胞在SARS-CoV-2感染期间细胞因子释放的显著变异性，这可能导致观察到的内皮损伤生物标志物的差异。重要的是，我们注意到血浆病毒RNA水平与上皮损伤标志物sRAGE之间存在强相关性，尽管这种关联不是病毒血症与死亡率之间关系的显著中介因素。因此，我们发现的病毒血症与血栓性内皮病变之间的新联系值得进一步研究，特别是对于抗凝治疗的潜在影响，由于样本量不足，我们在本研究中无法对其进行研究。

我们注意到几个限制。首先，我们只获得了ACTIV-4部分患者的生物样本，而且此处报告的每个具体检测的生物样本可用性并不完全重叠。因此，我们的结果可能无法反映整个试验人群，我们可能无法检测到某些生物标志物的差异。此外，血栓是通过临床决策而不是标准化筛查来识别的，这可能会在血栓检测中引入偏差。虽然我们确实检测到了血浆sTM水平对死亡的中介效应，但由于事件发生率低，这可能影响了中介分析的显著性。因此，我们使用了惩罚Firth方法来降低假阳性分析的概率。我们使用了ACTIV-4a试验提供的临床D-二聚体水平，这些水平是通过不同的方法获得的，这可能限制了我们D-二聚体发现的普遍性。最后，我们没有足够的样本量来探究抗凝治疗等治疗对病毒血症、血栓性内皮病变及其与COVID期间死亡之间的潜在治疗相关效应，这应该是 future研究的重点。

**结论**
我们提出了SARS-CoV-2病毒血症、sTM与COVID-19住院患者死亡率之间的一种新的、可能是因果的关联。这一新的关联确定了下呼吸道病毒感染与心血管并发症之间的一种潜在机制，可能会指导未来的研究。

**资金来源**
该研究部分由美国国立卫生研究院通过国家心肺血液研究所评估COVID-19和治疗策略网络协议1OT2HL156812（W.B., J.J.）以及CHEST基金会静脉血栓栓塞症研究奖（J.S.）资助。本文表达的观点仅代表作者本人，并不一定反映退伍军人事务部、国立卫生研究院或美国政府的立场或政策。

**致谢**
作者感谢使ACTIV-4a试验成为可能的患者、患者家属和工作人员；ACTIV机制研究网络生物库工作人员和研究者提供了生物样本并对文中呈现的结果提供了深思熟虑的反馈；感谢匹兹堡大学的Steve Wisniewski和Edvin Music为整个ACTIV-4a试验提供了患者数据总结。B.E.Z.和K.W.I.设计、执行、分析并解释了数据并撰写了手册。S.M.N.设计、执行、分析并解释了数据并修改了重要内容。N.B.、A.N.、S.Q.和C.Y.H.执行了实验、分析了数据并修改了重要内容。Y.Z.、F.A.S.、L.S.、C.S.D.C.、L.Z.、B.J.M.、A.M.和M.D.N.解释了数据并修改了重要内容。J.S.、G.D.K.、J.W.M.、D.A.L.、P.Y.K.和J.L.J.设计、执行、分析并解释了数据并撰写了手册。W.G.B.构思、设计、执行、分析并解释了数据并撰写了手册。