利用液相色谱与红外离子光谱联用技术对合成批次杂质的多模态结构进行表征

《Analyst》：Multi-modal structure characterization of synthetic batch impurities with liquid chromatography coupled to infrared ion spectroscopy

　　评估农用化学品的安全性需要彻底识别合成批次中的杂质结构。传统方法依赖于液相色谱与高分辨率串联质谱联用，但往往不足以完成完全的结构确定。红外离子光谱作为一种新型的分析方法，在质谱中的结构表征中崭露头角。该技术将红外光谱与质谱结合，可以在质谱仪内获得质量隔离离子的红外光谱，并可与液相色谱分离方法相结合。红外光谱模式为具有相同质量但不同结构的分子提供了独特的“指纹”，并且可以通过量子化学进行预测，从而无需参考标准品。我们通过成功识别出五个杂质结构来证明这种方法在分析农用化学品批次杂质中的应用，其中包括两种之前未记录的化合物，这些化合物是根据其计算出的光谱进行识别的。此外，我们还展示了对于一种会重新转化为母体活性化合物的微量杂质的检测和结构确定。在此过程中，使用了Born-Oppenheimer分子动力学计算来预测和分配红外光谱，解释了由于氢键作用而产生的实验中扩宽的吸收线形状。

在化学物质合成过程中，可能会产生副产物，从而污染最终批次。在农用化学品行业中，这些杂质可能具有导致毒理学效应或环境污染的潜力。因此，监管机构对化学行业中不同部门的新活性物质的杂质分析制定了严格的法规。完全去除多步骤合成过程中产生的有机杂质通常是困难的或成本高昂的。对于农用化学品和药品，所有含量超过主产品0.1%的成分都应进行表征和安全性评估。这一过程中的关键是对杂质进行结构识别。杂质通常使用液相色谱（LC）进行检测和定量，通常与质谱（MS）结合使用。分析化学的进步，特别是LC-MS（例如柱技术）和质谱的发展，使得可以直接从复杂的样品基质中识别非常微量的成分。近年来，高分辨率准确质量（HRAM）质谱仪的普及提高了确定分子式的能力；然而，确定化学结构仍然存在困难。从碎片质谱（MS/MS）获得的结构信息往往不足以完成完全的结构确定。另一方面，当能够分离出大量（>100 μg）纯形式的杂质时，核磁共振（NMR）通常可以直接提供分析物的结构信息。然而，由于杂质通常含量较低，分离出足够的NMR材料可能是一项昂贵且费力的任务。在这项工作中，我们展示了如何使用红外离子光谱（IRIS）来确定农用化学品批次杂质的结构。IRIS将红外（IR）光谱的结构信息与质谱的灵敏度和选择性结合起来，通过在离子捕获质谱仪中直接测量质量隔离离子的红外光谱来实现。该技术之前已被证明可用于识别代谢物、农用化学品衍生物、微污染物以及有机电子材料中的杂质。该技术可以与基于LC-MS的常见杂质表征工作流程结合使用。量子化学方法，特别是密度泛函理论（DFT），能够准确预测红外光谱，并为合成正确的化合物提供信心，防止不必要的合成不匹配的候选物；在某些情况下，甚至可能完全不需要合成标准品。在这项工作中，我们描述了一种含有取代氧杂二唑的新型杀菌剂的杂质分析。活性成分（方案1中的主要产品）是用对甲苯三氰胺通过五步合成得到的，其中最后两步形成了氧杂二唑。为了保护与目前正在专利开发中的化合物相关的专有结构信息，R基团没有进一步具体说明，但对于所示的所有中间体和杂质来说都是相同的。产生杂质的化学转化仅发生在分子的特定侧链上，从而可以解释形成机理，同时保护机密知识产权。在每一步过程中，都可能形成副产物，或者残留的反应物可能会带入最终批次。氧杂二唑是医药和农用化学中重要的结构基元，所识别的杂质可能会在通过类似合成路线制造的活性成分中出现。

图1展示了批次样品的LC色谱图，显示了杂质的分离及其通过LC-MS的检测结果。除了在13.42分钟处洗脱的主要产物峰之外，还观察到了五个杂质峰，分别标记为1-5。这些杂质在色谱过程中分离得很好。杂质1被鉴定为未反应的酰胺肟中间体（方案1中的B），其m/z值和保留时间与参考物质匹配。杂质3的m/z值和保留时间与腈中间体（方案1中的A）的参考物质匹配。杂质2的名义质量与N-羟基胺形成过程中的一种已知副产物的质量相匹配，在该过程中腈被水解为酰胺。杂质4和5之前是未知的。

样品的制备是将批次样品以1 mg/mL的浓度制备在乙腈中，随后用水稀释至100 μg/mL。

采用参考文献25中的色谱方法。将2 μL的样品注入Waters Acquity UPLC HSS T3 100 ?（2.1 × 100 mm, 1.8 μm）反相柱中。注射和梯度洗脱使用配备了柱箱和自动进样器的Bruker Elute UPLC系统。该系统与Bruker AmaZon四极杆离子阱质谱仪相连，质谱仪在正ESI模式下运行。洗脱液A由含0.1%甲酸的水组成，洗脱液B由含0.1%甲酸的甲醇组成。我们使用以下洗脱程序：0–1分钟，0% B；1–16分钟，0–100% B；16–20分钟，100% B；20–21分钟，100%–0% B；21–25分钟，0% B（流速：0.4 mL/min）。不对称因子是通过将最大值后的半宽除以最大值前的半宽来确定的。半宽是在峰高度的10%处测量的。

光谱实验是在之前详细描述过的Bruker AmaZon离子阱质谱仪上进行的，该质谱仪与FELIX自由电子激光器相连。组分在之前注射中确定的保留时间手动收集到小瓶中，并在5°C下过夜储存，然后进行光谱分析；或者使用在线心脏切割技术在60 μL样品环中收集。组分以2 μL/min的流速通过注射泵引入电喷雾离子源。IRIS实验是通过在750–1850 cm?1的光谱范围内以3–5 cm?1的步长扫描激光频率来记录质谱来进行的。然后使用频率依赖的IR光解产率来重建红外光谱，并对FELIX激光器的波长依赖的功率变化进行校正，并归一化到最高强度峰。

高分辨率质谱实验是在傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（FTICR，SolariX XR 7T，Bruker Daltonik，德国不来梅）上进行的，该质谱仪与上述色谱装置相连，并在正ESI模式下运行。

使用量子化学方法从SMILES表示的候选结构的2D表示开始预测红外光谱，采用之前描述的工作流程中的方法。使用RDKIT创建了互变异构体和质子化异构体，随后使用CREST v.2.1229为每个异构体生成构象体，采用GFN2-xTB30方法。CREST使用默认设置为每个质子化互变异构体生成构象体。根据它们的GFN2-xTB能量，构象体被选择到60 kJ/mol，并使用ORCA v.6.0在BP86/def2-SV(P)31–34水平上进一步优化，然后进行谐波频率计算以获得自由能。在相对自由能（高达25 kJ/mol）上过滤后，构象体在B3LYP/ma-def2-SVP36水平上进一步优化，然后进行谐波频率计算和单点DLPNO-MP2/def2-TZVP38计算。MP2能量与B3LYP热能结合，得到用于最终排名的自由能。B3LYP频率在2500 cm?1以下和以上分别缩放了0.975和0.955，振动粘滞谱通过半高宽为20 cm?1的高斯展宽函数进行卷积，以便与实验光谱进行比较。相似性分数（S）的范围是0到1000，是基于700到1900 cm?1频率范围内测量和预测光谱之间的余弦相似度计算的。两个光谱都归一化到最高强度峰，并通过对强度取平方根来减少带强度对分数的影响，从而增加光谱位置的重要性。相似性分数定义为

使用Turbomole 7.8和r2scan-D4/def2-SVP密度泛函方法进行Born-Oppenheimer分子动力学计算，采用从参考文献42中改编的方法。进行了四次独立的分子动力学（MD）运行，起始几何结构相同，但随机初始速度不同，以匹配250 K的动力学温度。使用了20 a.u.（约0.48 fs）的时间步长和350 K的Nosé-Hoover恒温器，时间耦合常数为400 a.u.，进行了45,000个MD步骤。在每56步之后移除围绕质心的漂移和旋转。分子电偶极矩使用DFT计算，并在每步写入文件。前5000步用于平衡系统，剩余的40,000步使用TRAVIS44软件包的电荷偶极子自相关函数的傅里叶变换来计算红外光谱。四个计算出的红外光谱平均得到最终光谱。为了校正方法中的系统误差，频率在2500 cm?1以下和以上分别缩放了0.980和0.955。大多数用于光谱预测的BOMD计算是为液体开发的，使用周期性计算和平面波基组DFT。在这些周期性系统中定义偶极子的方法并不简单，已经开发了不同的方法来获得偶极子。然而，当前的BOMD计算是使用原子中心基组进行的，这些基组特别适合气相计算。

图1展示了批次样品的LC色谱图，显示了杂质的分离及其通过LC-MS的检测结果。除了在13.42分钟处洗脱的主要产物峰之外，还观察到了五个杂质峰，分别标记为1-5。这些杂质在色谱过程中分离得很好。杂质1被鉴定为未反应的酰胺肟中间体（方案1中的B），其m/z值和保留时间与参考物质匹配。杂质3的m/z值和保留时间与腈中间体（方案1中的A）的参考物质匹配。杂质2的名义质量与N-羟基胺形成过程中的一种已知副产物的质量相匹配，在该过程中腈被水解为酰胺。杂质4和5之前是未知的。

图1是批次样品的分离基线色谱图。主要产物在13.42分钟洗脱，观察到5种不同的杂质，分别标记为1-5，它们的洗脱时间早于主要成分。相对定量是通过将高斯函数积分到质子化离子的色谱图（SI图S1）中得到的。保留时间和相对丰度显示在表1中。所有发现的杂质丰度都超过0.1%，因此需要根据标准规定进行鉴定。最低强度特征的离子强度是背景信号的三倍，表明这接近该方法的检测限（LOD）（基于3:1的信噪比）。为了提高灵敏度，可以使用更大的注射体积或浓度，但这样做有使柱子过载的风险。此外，主要产品的峰值是尾峰（也见图S1中的拟合高斯曲线，不对称系数为1.29）。如果有一种杂质与主要产品同时洗脱或洗脱时间较晚，它可能会被主要成分掩盖。表1显示了检测到的化合物的概览。

**化合物**
m/z [M + H]
保留时间（分钟）
表观相对丰度（%）

**杂质1**
282
5.46
1.91

**杂质2**
267
7.24
0.24

**杂质3**
249
9.26
0.26

**杂质4**
378
10.09
1.16

**主要产品**
360
13.42
95.7

**杂质鉴定**
杂质的IRIS光谱是通过直接注入收集的馏分并在离子阱中隔离相应的m/z值来测量的；它们在图2中以黑色轨迹显示。对于杂质1和3，有参考标准品可供使用，它们的IRIS光谱在图2A和C中以灰色阴影显示。

**图2说明**：
黑色轨迹：杂质1、2、3、4在脱水后的实验IR光谱（分别在A到F面板中）。灰色阴影轨迹：可用参考标准的IRIS光谱。蓝色阴影轨迹：使用密度泛函理论预测的所示结构的IR光谱。所有计算结构的R基团都是相同的。光谱相似性评分（S）用于评估与杂质光谱的匹配程度。质子化的杂质1的IR光谱在1653 cm?1处有一个最强烈的峰，这是由于N-羟基胺的CN伸缩引起的。此外，还可以观察到1698 cm?1处的羰基伸缩。在杂质的光谱中，这些峰重合，而在参考分子的光谱中可以看到一个肩峰。这些差异可以归因于FEL辐射的光谱宽度和功率轮廓的日变化。对于杂质3，也可以进行类似的比较，如图2C所示。杂质的光谱和参考标准的光谱在峰值位置和相对强度上非常吻合。相似性评分能够根据它们与参考材料光谱的匹配程度唯一地鉴定杂质1和3（见表S1）。在没有标准品的情况下，暂定的归属结果得到了量子化学计算的IR光谱的支持（在图2中以蓝色阴影显示）。对于杂质1和3，它们在完整的光谱范围内与实验光谱非常吻合。因此，我们得出结论，理论的水平足以可靠地预测这些分子的IR光谱。尽管杂质2之前是用LC方法鉴定的，但我们没有参考标准品。为了确认鉴定结果，将实验IR光谱与计算预测的光谱进行了比较，后者也显示出良好的吻合度，而另一种醛肟候选物（见图S2）的吻合度较差，进一步支持了这一归属。杂质5与任何反应物或已知的杂质都不匹配。我们根据高分辨率质谱得到的准确质量确定了其分子式（见图S3），并提出了图2F中显示的化学结构。它含有一个2-甲氧基丙酰基，预计是通过2-甲氧基丙酰氯与胺肟（方案1中的B）的反应形成的，当反应混合物中存在其微量时。这种结构的IR光谱是使用量子化学预测的，并且与杂质5的实验光谱非常吻合（见图2F）。此外，与另一种异丙氧基衍生物的比较（见图S4）显示出较差的吻合度和较低的相似性评分，从而加强了这一归属。杂质4的m/z比主要产品高18个单位，可能是由于加水反应的结果。经过分馏后，如果在夜间储存，它会重新转化为具有主要产品m/z的化合物。如图2D所示，这种脱水后的杂质4的IRIS光谱与主要产品的光谱相匹配，证实了它在夜间会重新形成。计算出的光谱无法完全解释1185–1230 cm?1处的峰。计算出的1185 cm?1处的峰对应于C–F伸缩振动模式，但我们的DFT方法预测的频率过低。

可以使用在线心切LC-MS方法减少馏分的储存时间，这使我们能够记录杂质4的IRIS光谱。使用DFT预测了三种候选结构的谐波IR光谱，其中氧杂二唑环是水合的。在候选物4a中，环水合为二氢氧杂二唑-5-醇；在候选物4b中，环水解为N-酰基，N′-羟基-氨基甲酰基；而在候选物4c中，环水解为O-酰基氨基肟。这三种结构基团及其与主要产品的反应在文献中有描述。异构体4a的结构基团之前已经被分离出来，并且已经在室温下进行了缓慢脱水。候选物4a的计算光谱在视觉检查和相似性评分的基础上与实验光谱最为吻合。1700到1850 cm?1之间缺乏振动峰特别具有 diagnostic 性，表明酰胺或酯中不存在自由的羰基，说明氧杂二唑环是完整的。较高频率范围中OH和NH伸缩的存在为这一归属提供了额外的信心。缺失的主要胺NH2伸缩和存在的自由OH伸缩（除了单个羰基伸缩）进一步确认了这一归属。我们观察到大约在2800到3400 cm?1之间的宽特征，这是由于质子化位点的分子间氢键造成的。谐波近似无法准确描述氢键的动态行为。已经证明BOMD计算能够准确描述这些动态，并为这类系统提供更好的光谱预测。图3显示了与实验IR光谱的一致性，包括质子伸缩模式的宽化轮廓。不仅在高频范围内匹配得更好，而且在低频范围内，BOMD计算也紧密预测了光谱特征的宽度，而谐波频率计算只是简单地用一个均匀的高斯线宽化函数进行了卷积。BOMD光谱与参考标准的光谱质量相匹配，因此在没有参考材料时为归属提供了额外的信心。

**杂质4的光谱（黑色轨迹）与预测光谱（彩色）的比较**。谐波DFT预测的光谱（彩色实线曲线）显示了三种候选物及其与实验光谱的相似性评分（S）。异构体4a（蓝色）与实验光谱的匹配度最高。BOMD计算（上面板中的蓝色轨迹）改善了匹配度，并正确预测了峰的宽化。所有候选物的R基团都是相同的。由于杂质4会转化为主要成分，它预计会与主要成分处于平衡状态，这可能会根据环境条件（pH、温度、溶剂）而变化，并且在分析过程中可能形成。我们预计这种类型的水合反应在其他含有1,2,4-氧杂二唑的分子中也很常见，可能会引起杂质分析人员的注意，这些杂质可能被错误地鉴定为污染物。通过应用心切LC-MS，有效减少了馏分的储存时间，从而能够在观察到显著脱水形式之前测量到杂质4的原始状态的IRIS光谱。

**结论**
我们成功地通过结合色谱和IR离子光谱的多模态分析方法鉴定并表征了五种杂质，其中两种是以前未知的化合物。当没有参考标准品时，可以通过将IRIS光谱直接与参考标准的光谱或量子化学计算预测进行比较来进行结构归属。在这里，BOMD IR光谱预测为匹配提供了更多的信心，因为它们明确预测了光谱的宽度。虽然像NMR这样的传统方法需要大量的样品量和耗时的分离程序，但IRIS在直接从色谱分离中分析超低丰度合成杂质方面表现出更 superior 的能力。五种杂质的表征，从反应中间体和文献中描述的杂质到一种完全新颖的1,2,4-氧杂二唑水添加产物，证明了该方法在工业环境中的适用性。在无参考标准的情况下，关键步骤是初始候选结构的形成，其中化学直觉和补充的分析数据（HRAM、MS/MS）仍然非常有价值。展望未来，这种分析方法为农化和药物化学中的杂质分析提供了高效的途径，可能加速开发过程并增强结构归属的信心。

**作者信息**
TvW：研究、可视化、写作——原始草稿。SJP：概念化、研究、写作——审稿与编辑。AC：概念化、研究、写作——审稿与编辑。JO：写作——审稿与编辑。GB：写作——审稿与编辑。MS：概念化、研究、写作——审稿与编辑。JM：概念化、研究、写作——审稿与编辑。

**利益冲突**
没有需要声明的利益冲突。

**数据可用性**
所有数据都可以在合理请求下从相应作者处获得。补充信息（SI）：包括杂质和主要产品的提取离子色谱图、高斯拟合、相似性评分、高分辨率质谱和MS/MS光谱。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d5an01339a。

**致谢**
作者衷心感谢FELIX小组提供的优秀技术支持。我们还要感谢SURFsara超级计算中心和NWO ENW-domain提供的计算资源（NWO Rekentijd Grant 2024.009），这些资源使得量子化学计算成为可能。