利用全基因组SNP数据重新审视濒危奥地利图波列猪与巴尔干地区及商业养猪品种之间的遗传关系

《Animal Genetics》：Revisiting Genetic Relationships of the Endangered Austrian Turopolje With Balkan and Commercial Pig Breeds Using Genome-Wide SNP Data

　　**摘要**

濒危的奥地利图波尔杰（AT）猪种群起源于20世纪90年代初从克罗地亚引进的六只图波尔杰猪原种，目前通过一个国家级保护项目得以保存。本研究旨在利用中等密度的单核苷酸多态性（SNP）阵列，来确定AT种群与四种奥地利商业品种以及七种当地巴尔干品种之间的遗传关系、遗传距离和迁徙事件，并评估它们的近交水平。分析结果显示，AT种群与其他品种明显不同（通过多维缩放和混合分析确认），尽管在遗传上与克罗地亚图波尔杰、匈牙利曼加利察和斯瓦洛韦尔贝尔曼加利察有一定亲缘关系。除了班尼亚斑点猪（Banija Spotted）外，AT种群没有显示出来自其他品种的基因流迹象（通过Treemix分析验证）。AT种群的遗传多样性并未受到其近期人口历史（基于纯合子连续性的近交水平FROHav = 0.17 ± 0.05）的负面影响。尽管近交趋势有所增加，但与之相比，AT种群的近交程度并不令人担忧。总之，这项研究结果可能表明，对原本遗传基础狭窄的种群进行有效管理，有助于形成当前的保护种群特征。AT种群与其祖先种群（克罗地亚图波尔杰）之间的差异不仅反映了最初的奠基者效应，也可能源于过去三十年的不同管理方式。本研究是提高人们对这一具有地方特色的猪种群独特性的认识的第一步。

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**1 引言**

图波尔杰是一种原产于克罗地亚的猪品种，由希什卡（?i?ka）、克尔什科波尔杰（Kr?kopolje）和伯克郡（Berkshire）猪品种之间的杂交培育而成（Luki?等人，2020年）。在南斯拉夫战争及其后十年经历人口下降后，这一品种重新因其在克罗地亚环境和文化遗产中的重要角色而受到关注（?iki?等人，2003年）。在奥地利，当前的图波尔杰种群源自最初六只引进的克罗地亚个体，分别于1990年代和2000年代分两批引入（Druml等人，2012年）。具体来说，1993年，两只图波尔杰公猪和两只母猪在战争期间被抢救出来，以防止该品种灭绝（Baumung和Prevost，2010年）。随后在2000年，又有两只公猪从克罗地亚转移到奥地利，以补充现有种群（Baumung和Prevost，2010年）。自2001年以来，ARCHE Austria这个致力于保护稀有和濒危家畜品种的协会负责奥地利图波尔杰种群的原地保护工作（Baumung和Prevost，2010年）。此外，奥地利政府通过农村发展支持计划（?PUL）支持那些致力于保护濒危品种（包括图波尔杰猪）的农民（ARCHE Austria，2023年）。据报道，2015年奥地利图波尔杰种群共有93头繁殖动物（奥地利国家基因保护协会，2015年）。保护图波尔杰猪有助于维持农业生物多样性及低投入的 farming 系统，因为该品种适应了奥地利洪泛区和林地特征的广阔户外环境。保护这一小种群还有助于保持独特的遗传多样性，这对未来适应环境变化至关重要，并支持可持续的农村经济和高价值区域产品的开发（?korput等人，2024年）。根据谱系数据，AT种群由于源自少数奠基者，因此被认为具有较高的近交水平和较低的遗传多样性（Baumung和Prevost，2010年）。Druml等人（2012年）使用25个微卫星标记发现，与克罗地亚图波尔杰、匈牙利曼加利察、塞尔维亚曼加利察、黑斯拉沃尼亚（Black Slavonian）、皮特兰（Pietrain）和波斯尼亚山地猪（Bosnian Mountain Pig）相比，AT种群的近交程度最高（FIS值最高），等位基因丰富度（RMNA值最低）。研究还表明，AT种群在遗传上与其他猪群体存在显著差异，表明这些种群之间的基因流动较少。尽管图波尔杰猪的保护重要性得到认可，且克罗地亚和奥地利种群之间存在遗传分化（Druml等人，2012年），但目前缺乏支持这些亚种群差异的表型证据。同行评审的研究提供了关于克罗地亚图波尔杰猪的形态特征和生长表现的详细描述（Karolyi等人，2018年；?korput等人，2024年），但这些研究均未单独针对奥地利种群进行数据收集。同样，繁殖参数（如窝产仔数、首次产仔年龄、仔猪存活率及生长特性）主要在传统生产系统管理的克罗地亚种群中进行量化（Karolyi等人，2019年），目前尚无相应的奥地利种群数据。关于图波尔杰猪的基因多样性和关系的研究主要集中在使用全基因组SNP标记方面。因此，本研究的目的是利用中等密度SNP阵列，将AT种群的遗传背景与一组猪品种进行比较，包括四种在奥地利广泛养殖的商业品种（皮特兰、大白猪、长白猪和杜洛克猪）以及七种巴尔干本土品种（斯洛文尼亚的克尔什科波尔杰；克罗地亚的黑斯拉沃尼亚、班尼亚斑点猪；塞尔维亚的莫拉夫卡和斯瓦洛韦尔贝尔曼加利察；匈牙利的匈牙利曼加利察）。此外，我们还通过估计纯合子连续性（ROH）参数来监测种群的分子近交程度和区分近期与远期的近交事件。

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**2 材料与方法**

**2.1 样本与基因型**

AT种群的基因型数据是通过奥地利国家基因保护协会（?NGENE）实施的农村发展支持计划（?PUL）获得的，使用Ramos等人（2009年开发的Illumina PorcineSNP60 v2 Genotyping BeadChip芯片（包含232个SNP）对一部分繁殖动物进行了基因分型。对于商业品种（皮特兰、大白猪、长白猪和杜洛克猪），样本来自Pig Austria运营的奥地利国家繁殖计划。每种品种选取了70-82只动物，这些动物被纳入常规的基因组预测（ssGBLUP）流程中，使用Chip 1进行基因分型。克罗地亚图波尔杰（CT）、匈牙利曼加利察（HM）和黑斯拉沃尼亚（BS）的基因型数据来自Luki?等人（2020年）的研究，同样使用了Chip 1；班尼亚斑点猪（BJ）的基因数据来自Zorc等人（2022年）的研究，使用了GeneSeek Genomic Profiler（GGP）Porcine 80 K Bead Chip（Neogen, Lincoln, NE, USA）；而斯瓦洛韦尔贝尔曼加利察（SBM）、莫拉夫卡（MO）和克尔什科波尔杰（KP）的基因型数据来自Mu?oz等人（2019年）的研究，使用了GeneSeek SNP70 BeadChip（Mu?oz等人，2019年）。各群体的个体数量及使用的芯片格式详见表S1，地理起源信息见图1。图2展示了AT种群和巴尔干品种的形态特征。由于样本量差异可能影响分析结果，我们还为后续的ADMIXTURE分析准备了随机抽取的均衡子集（见“种群结构与遗传距离”部分）。实际上，基于模型的遗传聚类软件倾向于最大化簇解释的方差（Lawson等人，2018年）。大型种群可能会影响等位基因频率的估计，从而对模型产生不成比例的影响，可能错误地将代表性不足的种群归为一类，或将代表性过高的种群人为分割成多个簇（Meirmans，2019年）。

**2.2 质量控制**

合并后的数据集仅包含重叠的基因型，使用PLINK v1.90软件（Chang等人，2015年）进行了过滤处理。设定的参数包括SNP缺失阈值0.1、个体缺失阈值0.1和次要等位基因频率阈值0.02。这些参数是基于先前对猪的研究选定的（Banos等人，2022年；Lemus-Flores等人，2023年；Schiavo等人，2021年），最终得到了包含706个个体和32,114个变异体的初始数据集（I_D）。根据研究目的，对I_D应用了不同的过滤标准，得到了本研究中使用的数据集（见表S2）。

**2.3 种群结构与遗传距离**

使用PLINK v1.90对三个不同的数据集进行了多维缩放（MDS）分析，以重点关注AT种群。在去除大白猪、皮特兰、杜洛克猪和长白猪（MDS_NC_D）以及克罗地亚图波尔杰、匈牙利曼加利察和斯瓦洛韦尔贝尔曼加利察（MDS_R_D）后，得出了两个简化的数据集。为了推断种群结构，对多个数据集进行了四种混合分析：不平衡无监督（UB_US_D）、平衡无监督（B_US_D）、不平衡有监督（UB_S_D）和平衡有监督（B_S_D），其中“平衡”指的是每个种群的样本量，“有监督”指的是为除目标种群外的所有个体预先分配的群体归属信息。平衡数据集是通过从每个种群随机选择20个个体获得的，以解决样本量差异带来的偏差问题。ADMIXTURE 1.3.0（Alexander等人，2009）被用来进行上述分析。为确保使用独立位点，分析前先根据标记对之间的连锁不平衡进行了剪枝（--indep-pairwise）。采用窗口大小50 bp、步长5个标记和r2参数0.5进行混合分析。通过交叉验证（CV）估计了最佳的簇数量（K），并选择了CV误差最小的模型。结果通过Evanno方法进行了双重检验，该方法基于连续K值的CV误差差异（Evanno等人，2005年）。将成员成分（qi）低于0.8的AT个体定义为混血个体。为了进一步研究种群结构，使用R包NetView（Neuditschko等人，2012）进行了最近邻网络（MNN）分析。根据Neuditschko等人的建议，排除了偏离哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium）显著的标记（p < 0.001）。与混合分析不同，这里的K值表示软件为每个个体推断的最近邻居的最大数量。该过程形成了根据遗传关系连接不同个体的网络。分析中使用的K值范围为1至20。Fst指数描述了亚种群中包含的总遗传方差占总遗传方差的比例（Wright，1984年）。指数越高，表明种群间的遗传距离越大。

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**图1** 12个猪群的地理起源地图。
**图2** 奥地利图波尔杰猪和七种巴尔干猪品种的形态特征：(a) 奥地利图波尔杰（ARCHE Austria，2023年）；(b) 班尼亚斑点猪（Zorc等人，2022年）；(c) 匈牙利曼加利察（Addo和Jung，2022年）；(d) 黑斯拉沃尼亚猪（Margeta等人，2019年）；(e) 克罗地亚图波尔杰（Karolyi等人，2019年）；(f) 斯瓦洛韦尔贝尔曼加利察（斯洛文尼亚农业研究所，2015年）；(g) 莫拉夫卡猪（斯洛文尼亚农业研究所，2015年）；(h) 克尔什科波尔杰（Batorek Luka?等人，2019年）。最终原始文件中仅保留了在各种芯片格式中共存的标记，这些标记是通过R v.4.2.2（R Core Team，2022年）比较得到的。由此生成的变体列表用于从合并的数据集中提取对应的SNP基因型。合并后的数据集包含710头猪和72,568个标记，其中32,563个标记在所有格式中均存在。

**2.3 质量控制**

合并数据集仅包含重叠的基因型，使用PLINK v1.90软件进行了过滤处理。设定的参数包括SNP缺失阈值0.1、个体缺失阈值0.1和次要等位基因频率阈值0.02。这些参数基于以往对猪的研究结果选定（Banos等人，2022年；Lemus-Flores等人，2023年；Schiavo等人，2021年），得到了初始数据集（I_D），包含706个个体和32,114个变异体。FST距离与Nei距离之间的区别在于影响等位基因频率的进化力类型。前者仅考虑随机漂变作为进化力，而后者还考虑了突变的影响；因此，这两种距离分别使我们能够观察到更近期和更久远的物种分化事件。最后，使用SplitsTree v.4.14.2（Huson和Bryant 2006）构建并绘制了基于这两种距离的两个邻居网络。

2.4 迁移事件的推断

为了评估迁移事件，我们使用了Treemix v.1.1.12（Pickrell和Pritchard 2012）测试了I_D，并采用了默认参数，除了-k参数，其中考虑了100个标记的LD窗口大小（-k 100），以考虑附近SNP并非独立的事实。此外，我们还使用R包OptM来推断m（迁移事件的数量）的最佳值。在Treemix软件中实现的f4测试用于检验四群体((A, B) (C, D))系统发育树的有效性。特别是，Z分数值显著偏离0与树中存在基因流有关，导致系统发育树不完全呈树状。显著正的Z分数表明A和C或B和D之间的群体之间存在基因流，而显著负的Z分数表明A和D或B和C之间的群体之间存在基因流。

2.5 近亲繁殖、CNVs和杂合性

使用PLINK v.1.90的--het命令为I_D的每个单一样位点估算了个体近亲繁殖系数（FIS）。此外，根据默认参数计算了GD_I_D的纯合性运行，除了最小SNP密度（--homozyg-density 100）和最小SNP数量（--homozyg-snp 15）。实际上，对于这些参数，我们决定采用更宽松的阈值，以适应数据集的SNP密度。CNVs根据以下长度范围被分为四个任意组：2–4 Mb、4–8 Mb、8–16 Mb和> 16 Mb。这一步对于推断每个群体的近亲繁殖年龄至关重要。实际上，基因组中较大CNVs的数量较多可能与最近的近亲繁殖有关，因为重组事件没有足够的时间来缩短CNVs的长度（Schiavo等人2021）。基于CNVs的总体近亲繁殖系数（FROH），以及所有窗口大小和阈值的FROH，是通过将个体识别的CNVs总和除以Sus scrofa的常染色体基因组总长度（2265.77 Mb）来计算的（Warr等人2020），根据以下公式（McQuillan等人2008）：
其中∑LROH是所有超过指定最小长度的个体CNVs的总长度，Lauto是除着丝粒外SNP覆盖的常染色体基因组的长度。同时，也使用R包detectRUNS（Biscarini等人2018）进行了纯合性运行，该软件使用的是“连续SNP”方法，与PLINK使用的“滑动窗口”方法不同。如果基因组片段长度超过最小阈值（1000 Kb）且其中没有杂合标记，则该软件会识别出一个CNV；因此，它不考虑CNV中多态性位点的最小数量，与“滑动窗口”方法不同（后者允许每1000 Kb窗口中有一个杂合基因型）。通过使用R包BITE（Milanesi等人2017）对同一数据集进行杂合性分析，也评估了群体内的遗传变异。

3 结果

3.1 多维尺度分析（MDS分析）

在整体数据集上进行的MDS图显示了良好的品种分离（图3），巴尔干地区的猪（BJ、MO、SBM、BS、CT、HM、KP）位于AT群体和奥地利商业品种之间。特别是，巴尔干品种被分为两组，一组（包括Black Slavonian、Banija Spotted、Moravka和Kr?kopolje）更接近商业品种，另一组（包括Hungarian Mangalitsa、Croatian Turopolje和Swallow bellied Mangalitsa）更接近AT群体。与预期相反，只有少数个体在Croatian和AT群体之间有重叠，表明两组之间的分化程度相对较高。为了进一步测试观察到的关系模式的稳健性，进行了另一次MDS分析，考虑了MDS_NC_D（图S1a）。在这种情况下，AT群体与Hungarian Mangalitsa、Croatian Turopolje和Swallow bellied Mangalitsa的分化更为明显，而与Banija Spotted的关系更为接近。通过在对MDS_R_D进行的MDS分析也确认了AT和Banija Spotted之间的遗传关系（图S1b）。

3.2 混合分析

在经过LD修剪的数据集（包含19,891个位点）上进行的非平衡无监督混合分析（UB/US）（K = 2，CV误差：0.65）支持了MDS的结果，表明AT群体在遗传上与奥地利商业品种分离。此外，巴尔干品种表现出两个成分（即商业成分和与AT相关的成分），表明尽管有记录显示它们过去与商业品种有过杂交事件，但仍然保留了一些本土遗传物质（图4a）。在K = 6（CV误差 = 0.56）时，四个商业品种和AT各自形成了自己的簇。Swallow bellied Mangalitsa和Hungarian Mangalitsa品种聚集在一起。其余的巴尔干品种（BJ、MO、BS、CT、KP）高度混合，明显显示出商业和本地遗传背景（图4b）。在ADMIXTURE 1.3.0上进行的分析中，每条垂直线代表一个个体，并被分为K个段落。段落长度与属于特定簇的遗传成分成正比。这里是UB/US分析的主要显著K值：K2（a）、K6（b）和K11（c）。根据最小CV误差的模型以及EVANNO模型（图S2），最佳K值为K = 11（CV误差 = 0.53）（图4c）。在这个值下，几乎每个品种都有自己的簇，有一些例外，例如（i）Banija Spotted，它表现出高度混合（主要具有Landrace和Black Slavonian的基因成分），（ii）Moravka，显示出Landrace和Swallow bellied Mangalitsa的成分占主导，以及（iii）Black Slavonian和Hungarian Mangalitsa，只有少数个体混合。同样，混合分析也突出了AT群体中混合个体的存在（混合主要涉及Duroc和Landrace品种），这也同时在MDS图中显示。总体而言，184个个体中有22个是混合AT个体（11.96%）（表S3）。K = 11时的B/US分析结果似乎与UB/US分析观察到的结果非常相似（图S3a）。相反，K = 2时的结果显示出AT群体中主要存在可归因于商业品种的遗传成分（图S3b）。在MDS图中观察到的AT和Banija Spotted之间的遗传关系也得到了平衡监督（B/S）ADMIXTURE分析的支持，该分析为所有品种（除了AT）提供了先验的群体成员信息（图5a）。由于上述结果可能受到Banija Spotted高混合程度的影响，我们首先进行了不指定AT个体或Banija Spotted个体数据的B/S分析。在这种情况下，两个群体样本都显示出主要属于Landrace的遗传成分，这种现象可能与Banija Spotted对AT的“拖拽效应”有关（见讨论部分）。然后，我们对没有强烈混合品种的数据集（BJ和MO）进行了B/S分析（R_B_S_D），从而突出显示AT群体现在与其主要遗传成分Black Slavonian共享（图5c）。

3.3 最近邻网络分析

与MDS和混合分析类似，MNN网络分析在任意选择的K = 12值下（图6）主要显示了Banija Spotted、Moravka和Black Slavonian之间的联系。与混合分析不同，CT和KP品种在这里明显与其他品种分开。在K = 19时观察到上述巴尔干品种组（BJ、MO、BS）与AT之间的联系（图S4）。这种联系是由七个AT个体介导的，其中五个之前被标记为混合个体。图6使用R包Netview进行。每个点代表一个个体，其颜色表示所属的群体。

3.4 遗传距离分析

遗传距离是在考虑了706个个体和32,148个标记的数据集上推断出的（即，没有使用--maf参数进行过滤）。Wright的成对FST指数（表S4）显示出值范围（0.08–0.35），这些值与文献中报告的相应品种的值一致。根据混合和MDS结果，Banija Spotted品种似乎通常与其他品种最为接近。AT的FST指数在0.14到0.26之间（分别与Banija Spotted和Duroc相比）。Nei的距离遵循FST描述的相同模式（Mantel测试相关性指数：0.91；p值：10^-4），虽然有一些例外，如Croatian Turopolje和Hungarian Mangalitsa的值不太极端（表S4），与其他品种相比。基于FST（图7a）和Nei（图7b）距离的网络描述了所考虑品种之间的遗传联系，将BJ品种置于最接近根的位置，DC位于最远的位置。此外，两个网络都将AT群体置于Croatian Turopolje、Swallow bellied Mangalitsa和Hungarian Mangalitsa附近。为了进一步测试巴尔干品种与AT群体之间观察到的FST距离的稳健性，创建了一个新的网络，去除了数据集中的商业品种。结果显示AT群体与上述三个本地巴尔干品种之间的关系模式保持不变（图S5）。

3.5 迁移事件

如表S5所示，软件Treemix在m（迁移边数）从0到15的范围内，反映了数据集中的几个品种之间的迁移事件。根据R包OptM，m的最佳值介于3到6之间，具体取决于所考虑的模型（图8a）。基于在两个模型（分段线性和Bent Cable）中 seulement在m = 3时变化点的重叠，我们选择了显示这个m值（图8b）。上述m值的结果显示了地方巴尔干品种之间的迁移流动，特别是CT、SBM、HM和BJ之间。树状拓扑结构一致地突出了一组巴尔干品种的聚集（CT、SBM、HM、BJ和AT）。其余巴尔干品种（BS、KP和MO）的位置表明可能受到商业品种的影响。值得注意的是，BS与Duroc接近，Moravka与包含商业品种LW、LN和PT的分支聚集在一起。三个迁移事件按照推断的范围顺序分别是：LN和BJ（边权重范围：0.4–0.6），克罗地亚Turopolje-Mangalitsa分支和BS（边权重范围：0.4–0.6），以及克罗地亚Turopolje-Mangalitsa分支和MO之间的迁移（边权重范围：0.2–0.4），如图8b所示。当考虑到m=0到m=15的所有结果时，这三个迁移事件得到了最大的支持（几乎占所有测试实例的100%）。图8在图形查看器中打开。

使用R包OptM获得的OptM图（a），其中m（迁移边的数量）的范围从0到15。白色点代表不同的m值，星号代表变化点，而不同颜色的线条代表四种考虑的推断模型。只有在m=3时，四个变化点中有两个（分段线和弯曲电缆线）发生了重叠。TreeMix对具有三个迁移事件的猪群系统网络的估计以及它们之间的关系（b）。

3.6 F4测试

对于AT品种，Treemix的四群体分析在最高Z分数值（≥50）下，突出了CT（32次）、SBM（25次）和HM（25次）巴尔干品种中最多的迁移事件。当考虑Z分数值≤-50时，显示了相同的模式，从而证实了在MDS和距离网络分析中观察到的结果（表S6）。此外，如图8c,d所示，AT品种与商业DC品种之间也有大量的迁移事件。

3.7 优系个体的识别、近交水平和杂合度

每个品种的个体近交系数（FIS）和平均FIS显示在表S7中。最低值出现在Landrace（FIS=0.06±0.03），而最高值与克罗地亚Turopolje（FIS=0.46±0.11）和匈牙利Mangalitsa（FIS=0.56±0.14）相关。表1显示了所考虑品种的平均优系个体数量（NSEG）、平均片段长度（LROH）、平均FROH（>1Mb）值和平均杂合度（HETobs），而图9a则报告了基于ROHs>1Mb的近交系系数的箱形图。表1. 每个考虑品种的ROHs参数。

表1. 每个品种的ROHs参数
NSEG (SD)
LROH (SD)
FROHav (SD)
HETobs (SD)

奥地利Turopolje
34 (6.6)
11.11 (2.4)
0.17 (0.05)
0.29 (0.02)

Banija Spotted
24 (11.5)
8.34 (3.9)
0.09 (0.09)
0.35 (0.05)

Black Slavonian
16 (5.8)
10.41 (3.8)
0.08 (0.04)
0.34 (0.02)

克罗地亚Turopolje
55 (13.4)
14.44 (2.7)
0.35 (0.08)
0.20 (0.04)

Duroc
51 (6.6)
7.11 (0.8)
0.16 (0.03)
0.31 (0.02)

匈牙利Mangalitsa
57 (15.7)
15.85 (4.3)
0.41 (0.14)
0.17 (0.06)

Kr?kopolje
23 (5.0)
10.36 (2.9)
0.11 (0.04)
0.35 (0.02)

Landrace
30 (5.5)
6.53 (1.1)
0.09 (0.02)
0.36 (0.01)

大白猪
40 (6.0)
6.58 (0.9)
0.12 (0.02)
0.35 (0.01)

Moravka
19 (9.8)
10.53 (5.4)
0.11 (0.09)
0.34 (0.04)

Pietrain
41 (6.3)
8.28 (1.2)
0.15 (0.03)
0.34 (0.02)

鹦鹉腹Mangalitsa
39 (6.9)
10.84 (2.5)
0.19 (0.05)
0.24 (0.02)

注：NSEG：每个品种的优系个体平均数量及其标准差（SD）。LROH：每个品种的优系个体平均长度（以Mb为单位）及其标准差（SD）。FROHav：每个品种的平均近交系数及其标准差（SD）。HETobs：每个品种的平均观察杂合度及其标准差（SD）。图9在图形查看器中打开。

表1. 每个分析品种的近交系数。使用PLINK 1.9识别出的与ROHs相关的总FROH（a），以及长度在8到16Mb之间的ROHs相关的总FROH（b）。Black Slavonian和匈牙利Mangalitsa显示了最低（16）和最高（57）的NSEG值。Landrace和大白猪显示了最低的LSEG（分别为6.53和6.58Mb），而匈牙利Mangalitsa显示了最高的LSEG（15.85Mb）。就平均FROH值而言，Black Slavonian的值最低（FROHav=0.08±0.04），而匈牙利Mangalitsa（FROHav=0.41±0.14）和克罗地亚Turopolje（FROHav=0.35±0.08）的值最高，这与平均FIS值一致。总体FROH结果与使用R包detectRUNS获得的结果（r2PLINK/R=0.95）以及之前对相同巴尔干品种进行的研究（Luki?等人2020；Schiavo等人2020；Zorc等人2022）一致。基于FROH范围的2–4Mb、4–8Mb、8–16Mb和>16Mb的箱形图在图9b中呈现。2–4Mb范围内，各个品种之间没有显著差异，除了商业品种的值略有升高。考虑到4到8Mb的FROH范围，我们还观察到CT和HM的近交值有所增加。最后，对于较高的FROH窗口（8–16Mb和>16Mb），HM和CT成为近交程度最高的品种，个体近交系数值的变异范围也很广（表2）。

表2. 基于不同窗口大小的AT和CT品种的ROHs参数。

表2. 基于不同窗口大小的AT和CT品种的ROHs参数
代数前
年数前
FROHav (SD) AT
FROHav (SD) CT

2–4
25–12
75–36
0.01 (0.004)
0.01 (0.005)

4–8
12–6
36–18
0.03 (0.009)
0.04 (0.014)

8–16
6–3
18–9
0.04 (0.015)
0.08 (0.027)

>16
3–1
9–3
0.09 (0.045)
0.22 (0.063)

注：FROHav：每个品种的平均近交系数及其标准差（SD）。FROH值高于0.25的个体比例最高的是匈牙利Mangalitsa（88.9%），其次是克罗地亚Turopolje（87.5%）。根据近交结果，观察到的最低平均杂合度（HETobs）（表1）与匈牙利Mangalitsa相关（HETobs=0.17±0.06），其次是克罗地亚Turopolje（HETobs=0.20±0.04）。相反，Banija Spotted的值明显较高，而AT位于中间位置（HETobs=0.29±0.02），这证实了总体模式（图10）。

讨论

本研究强调了AT品种与其他品种之间的遗传分离。这一分离主要来自于MDS分析和K=2时的无监督混合分析。这种分离可能是由于随机漂变现象造成的，可能是（i）从种群建立时开始的（创始人效应），（ii）由个体随后的繁殖隔离引起的，或者（iii）由前两个事件的协同效应所致。另一个假设可能是遗传物质从数据集中未考虑的品种引入到AT品种中。由于缺乏历史科学证据，这个假设似乎不太可能。在当前研究中，AT品种没有显示出来自其他考虑品种的显著基因流迹象。例如，AT品种在MDS图中的空间分布相当密集，而且观察到的杂合度水平与其他品种（如CT和HM）相比并不高。尽管有创始人效应和上述的繁殖隔离，AT品种的FROH较低（0.17对比0.35），观察到的杂合度值较高（0.29对比0.20）。这可能与CT品种在战争后经历了更严重的遗传多样性丧失有关（Begemann 2016），或者与AT品种相比，CT品种的近交管理措施较为薄弱。MDS分析和聚类网络显示AT品种与克罗地亚Turopolje、匈牙利Mangalitsa和Swallow bellied Mangalitsa品种之间存在一定的遗传邻近性。奥地利Turopolje品种与克罗地亚Turopolje品种的接近性可以很容易地归因于后者作为近代的起源品种（Baumung和Prevost 2010），而与其他两个品种的接近性可能是由于HM和SBM与商业品种之间很少有大规模的杂交事件（Radovi?等人2019；Kasprzyk和Walenia 2023）。这种缺乏可能导致了祖先特征的保护，可能是由于它们都起源于塞尔维亚的?umadinka品种（Radovi?等人2019；Radnóczi 2012；Kasprzyk和Walenia 2023）。在平衡的监督混合分析中，也确定了AT品种与Banija Spotted品种和Black Slavonian品种之间的某些遗传邻近性关系。与解释AT与CT接近性的假设类似，AT与BJ和BS的接近性也可能是由于Banija Spotted和Black Slavonian基因组中保留了祖先遗传成分。实际上，根据Lukovi?等人（2023）的研究，BJ品种是在19世纪末通过将当地Turopolje猪与改良品种杂交而发展的，而BS品种则起源于克罗地亚Mangalitsa（Hrasnica 1958）。至少对于AT-BJ来说，这种现象也得到了Treemix拓扑结构的证实，并且通过两种品种毛色的相似性在表型上也得到了支持。MDS分析还显示，一些巴尔干品种，包括Black Slavonian、Banija Spotted和Kr?kopolje，也与商业品种在遗传上相近。上述关系可以通过它们的遗传和繁殖历史来解释。事实上，正如上面提到的，Black Slavonian是通过将克罗地亚Mangalitsa母猪与伯克郡猪杂交发展而来的，然后通过将后代与伯克郡和大型黑猪进行改良（Hrasnica 1958）。另一方面，Kr?kopolje通过与各种英国品种杂交来增强经济上重要的特征（Kastelic和?andek-Potokar 2013）。同样，Moravka在20世纪初也与伯克郡和约克郡猪进行了杂交（?ivkovi?和Kosti? 1952）。Banija Spotted品种自建立以来也与伯克郡和Landrace类型的猪进行了杂交事件（Lukovi?等人2023）。后者基因流（LN-BJ）也通过Treemix分析推断出的迁移事件得到了证实。因此，BJ的历史背景可能解释了其混合个体的高数量以及其在B/S ADMIXTURE分析中对AT品种的“拖累效应”（图5b）。这种现象指的是一个品种（AT）由于与混合中间品种（BJ）的共同祖先而吸引另一个品种（LN）。实际上，高度混合品种的复合等位基因频率结构可能会主导算法试图解释的共享模式。这可能导致一个“总体”群落，类似于许多个体中共享的主要成分（例如，类似Landrace的），因为该信号在数据中统计上很突出，即使它不是真正的祖先结构，正如ADMIXTURE模拟研究中所报告的（Alexander和Lange 2011）。K=11时的无监督混合分析显示，AT品种中有一小部分个体的混合比例在10%到25%之间。这些个体可以在育种计划中被识别并谨慎使用，以保护和进一步扩展AT品种。有趣的是，只有在过去3-6代中，克罗地亚Turopolje品种的近交趋势似乎比奥地利品种更为显著（ROH大小为8–16Mb），对应于大约9-18年前的时间段（假设世代间隔约为3年，如Zhang等人2022所述）。这一结果可能与这两个品种最近的遗传管理有关。实际上，CT品种在战后时期（1996年）也经历了新的种群建立，从12头母猪和仅3头公猪开始（Begemann 2016）。尽管在2008年（Begemann 2016）和2022年（克罗地亚农业和食品局2022）报告了该品种的人口扩展，但我们目前没有关于种群创始人间原始关系的信息。如果它们之间有很高的亲缘关系，避免后续世代的近交将是具有挑战性的。至于AT品种，尽管近交趋势自25代前开始增加，但似乎并不令人担忧。这可能与过去十年中开展的旨在保护和重新引入本地品种的各种项目有关。上述农村发展支持项目（?PUL）在这方面发挥了作用，保护了奥地利的本地畜禽品种（ARCHE Austria 2023）。这些和其他类似项目反映了FAO通过提出新政策来支持和促进本地畜禽品种的保护和利用（FAO 2007）的变革方向。为了保护遗传多样性、降低近亲繁殖水平、维持品种特性以及管理混血个体，未来可以利用高密度SNP阵列的AT基因型数据，更精确地重建和推断杂合度、近亲繁殖程度、有效种群规模以及混血个体的分布（Eusebi等人，2020年）。此外，通过“最优贡献（OC）”方法减少繁殖动物之间的共同祖先概率，有助于最大化保留现有的遗传多样性。该方法确实推荐用于小型家畜种群，其核心原理是根据每个繁殖动物与种群其他成员的关系为其分配一个贡献分数，优先选择亲缘关系较远的个体以降低近亲繁殖（Fernández等人，2011年）。在这方面，在核心纯种群体规模较小的情况下，可以适度利用混血AT个体进行繁殖计划。最后，定期重新评估遗传多样性，并根据有效种群规模、近亲繁殖趋势和适应性特征调整繁殖目标，有助于制定长期适应性管理系统（T?p?loag?等人，2025年）。另一种能够提高种群内遗传多样性并减轻近亲繁殖负面影响的策略是，尤其是在考虑两个种群所经历的创始人事件和种群瓶颈的情况下，规划奥地利和克罗地亚Turopolje种群之间的严格控制下的杂交计划。受控的基因流确实可以提高杂合度并增强适应性潜力（Kristensen等人，2015年；Hoffmann等人，2020年）。然而，此类干预必须谨慎实施，因为不适当的杂交可能导致远交衰退或损害品种特性（Weeks等人，2011年）。为了最小化这些风险，需要进行严格的基因组和表型监测，以确保遗传丰富性与局部适应之间的平衡。总之，AT种群在基因上似乎足够独立，未来有可能被认定为一个独立的品种。此外，AT的遗传变异性值得进一步研究，因为它可能包含对经济性状有价值的变异。最后，AT与具有祖先特征的品种的亲缘关系以及其在广泛农业系统中良好的适应能力，有助于保护传统的奥地利农业生态景观。

作者贡献：
Marco Santo Cannarella：正式分析、调查、数据可视化、初稿撰写。
Gábor Mészáros：概念化、数据管理、研究方法设计、监督、撰写、审稿和编辑。
Silvia Bruno：正式分析、撰写、审稿和编辑。
Elena Ciani：研究方法设计、监督、撰写、审稿和编辑。
Johann S?lkner：概念化、资金筹集、研究方法设计、监督、撰写、审稿和编辑。

致谢：
作者感谢ARCHE Austria、奥地利稀有濒危品种协会（?NGENE）和TREASURE联盟的合作以及提供的基因型数据。同时感谢本地养殖户提供的生物样本。维也纳土壤文化大学/KEM?提供了开放获取资金的支持。

关于资金：
本研究未获得任何直接资金。新生成的SNP基因型数据的基因分型工作由ARCHE Austria的常规基因分型项目承担。

伦理声明：
猪的血液样本由专业人员在农场或屠宰场按照标准繁殖程序和健康监测规范采集。未对动物进行任何需要符合2010/63/EU指令的伦理协议的要求的处理或其他操作。先前项目收集的DNA或样本也重新用于本研究。

利益冲突：
作者声明没有利益冲突。

数据可用性：
本研究生成的数据包含在本文及其支持信息文件中。克罗地亚Turopolje、匈牙利Mangalitsa和Black Slavonian的基因组数据可在Luki?等人（2020年）的文章中找到（链接：https://doi.org/10.3389/fgene.2020.00261）。Banija Spotted的基因组数据来自Zorc等人（2022年）的研究（链接：https://doi.org/10.1186/s12711-022-00718-6）。Swallow bellied Mangalitsa、Moravka和Kr?kopolje的基因组数据来自Mu?oz等人（2019年）的研究。商业品种及AT种群的基因组测序数据将在签订材料转移协议后提供给学术用途，数据所有者可以对数据的使用施加合理的限制，例如保密或禁止商业利用。