可扩展的微流控技术用于制备优化的磷脂纳米载体，以提高局部生物利用度：结合定量生物学（QbD）分析方法及体外皮肤渗透性评估

《International Journal of Pharmaceutics: X》：Scalable microfluidic fabrication of optimized phospholipid nanocarriers for enhanced topical bioavailability: Analytical QbD integration and ex vivo skin permeation assessment

　　朱利亚·布奇亚莱利（Giulia Bucciarelli）、朱利亚·库尔齐（Giulia Curzi）、马蒂亚·蒂博尼（Mattia Tiboni）、安娜丽莎·阿卢伊吉（Annalisa Aluigi）、安德烈亚·海因茨（Andrea Heinz）、卢卡·卡塞塔里（Luca Casettari）
乌尔比诺卡洛·博大学（University of Urbino Carlo Bo）生物分子科学系，地址：Via Ca le Suore 2，61029 Urbino，PU，意大利

**摘要**
18β-甘草酸（18β-GA）是甘草根中甘草苷（GL）的主要生物活性代谢物，具有抗炎、抗氧化和抗菌作用，同时具备优异的生物相容性，使其成为治疗皮肤病的有前景的候选物质。然而，其较差的水溶性限制了其局部应用的生物利用率。在这项研究中，我们采用了一种分析质量设计（Analytical Quality by Design，简称QbD）方法来开发并优化装载18β-GA的纳米载体，以提高皮肤渗透性并实现持续、可控的释放。通过创新的定制3D打印微流控芯片技术，制备了乙醇脂质体（ethosomes）、甘油脂质体（glycerosomes）和甘醇脂质体（glycethosomes），这些脂质体具有可控的粒径、较低的粒径分布（polydispersity）、较高的包封效率和良好的物理化学稳定性，并且制备过程可重复且成本较低。我们利用实验设计（Design of Experiments，简称DoE）策略确定了关键配方参数，并建立了预测性数学模型。三种优化后的配方被引入海藻酸盐水凝胶中，该水凝胶具有剪切稀化特性，非常适合局部应用。体外渗透实验表明，优化后的纳米载体能够调节18β-GA在皮肤中的传递机制，其中配方成分显著影响药物的分布情况。这些系统减少了药物向靶区的快速扩散，促进了可控的药物释放，实现了靶向递送。药物在皮肤层中的积累表明，药物的释放过程是整个递送过程的限制步骤。水凝胶表现出延长的药物释放时间，并改善了与皮肤的接触，从而实现了持续且均匀的局部应用。通过使用蠕动泵成功实现了工艺的规模化生产，这凸显了所提出的微流控技术在可控局部给药方面的稳健性、低成本及工业可行性。

**1. 引言**
植物来源的生物活性成分在皮肤病学和化妆品领域的治疗潜力日益受到重视。其中，甘草酸（GA）是一种从甘草根（Glycyrrhiza glabra）中提取的三萜苷元，因其良好的抗炎、抗氧化和抗菌特性而备受关注（Kowalska和Kalinowska-Lis，2019；Pastorino等人，2018；Shinu等人，2023；Yamaguchi等人，2010）。18β-甘草酸（18β-GA）是GA的主要活性立体异构体，是甘草提取物生物和药理作用的主要贡献者（Lin等人，2024；Bag和Majumdar，2012；Sun等人，2018；Cai等人，2022）。18β-GA在结构上类似于皮质类固醇，能够调节炎症途径、抑制细胞因子产生、抑制酪氨酸酶活性、减少UVB引起的红斑和色素沉着，并调节金属蛋白酶的异常表达（Li等人，2019；Saha等人，2015；Wang等人，2013；Quan等人，2021）。此外，18β-GA具有优异的皮肤耐受性和良好的安全性，过敏性接触性皮炎极为罕见（Kowalska和Kalinowska-Lis，2019；Verratti等人，2011；Wang等人，2024；Kong等人，2015；Andersen，2007）。然而，18β-GA的亲脂性和低水溶性显著降低了其在皮肤中的生物利用率，从而限制了其在皮肤病学中的应用。皮肤渗透性主要取决于化合物的分子量及其分配系数（log P），这反映了其亲脂性。最外层的角质层（stratum corneum，SC）具有高度亲脂性，是渗透的主要障碍。根据Bos和Meinardi的定义（Bos和Meinardi，2000），log P值在1到4之间、分子量低于500 Da的化合物适合经皮递送。尽管18β-GA的分子量为470.7 Da，但其高log P值（6.6）严重限制了其在皮肤中的扩散，因此需要采取策略来提高其渗透性（Kowalska和Kalinowska-Lis，2019；Quan等人，2021；Tiboni等人，2020；Raina等人，2023）。传统的脂质体由于其刚性结构，通常不适合经皮递送（Albakr等人，2024；Prow等人，2011）。乙醇脂质体（ethosomes）由磷脂、水和乙醇（体积分数20–45%）组成，形成柔软、灵活的囊泡，可增强皮肤渗透性。乙醇通过液化角质层脂质并增加细胞间和细胞内渗透性来提高渗透效果。这些灵活的囊泡可以穿越狭窄的皮肤孔隙，将包裹的药物释放到更深层次的皮肤中，尽管高乙醇含量可能导致脱水、不适并破坏皮肤脂质屏障（Abdallah等人，2025；Zahid等人，2018；Verma和Pathak，2010）。甘油脂质体（glycerosomes）由磷脂、水和10–50%体积分数的甘油组成，最初由Manca等人用于双氯芬酸的递送（Manca等人，2013），它们具有较高的包封效率、更好的皮肤渗透性和流动性及稳定性。甘油是一种安全且广泛使用的辅料，可作为边缘激活剂，增加脂质双层的灵活性（Gupta等人，2020a；Sharma等人，2023；Naik和Shabaraya，2004）。甘醇脂质体（glycethosomes）结合了乙醇和甘醇的优点，既能提高药物渗透性，又能减少皮肤刺激。Manca等人首次将这些囊泡系统用于克霉唑的递送（Abdallah等人，2025；Zhang等人，2022；Pleguezuelos-Villa等人，2020；Manca等人，2019）。

在本研究中，我们开发并优化了装载18β-GA的纳米载体，采用了分析质量设计（QbD）方法。通过创新的3D打印微流控芯片技术，制备了乙醇脂质体、甘油脂质体和甘醇脂质体，该芯片采用熔融沉积建模（FDM）工艺制造，可精确控制纳米颗粒的属性（Rahali等人，2024；Su等人，2023）。微流控技术和纳米颗粒制造领域的最新进展强调了控制生产策略在克服传统囊泡制备方法局限性方面的关键作用，特别是在重现性和批次间变异性方面。与批量技术相比，微流控辅助制造在囊泡尺寸分布和粒径分布控制方面表现出优越性（Duarte等人，2024；Xu等人，2025）。定制的设计使得能够生产出球形、粒径可控、粒径分布狭窄且稳定性优异的囊泡，同时确保了生产的成本效益和可重复性（Agha等人，2023）。我们系统地应用实验设计（DoE）策略建立了预测性数学模型，评估了配方变量对颗粒尺寸和粒径分布指数（PDI）的影响。通过体外渗透和保留实验，进一步评估了优化后配方的包封效率、长期稳定性以及其促进18β-GA在皮肤中积累的能力。最后，我们使用蠕动泵实现了生产的规模化，为临床转化提供了成本效益高且具有工业可行性的方法。总体而言，本研究不仅是一个配方开发和优化过程，通过体外表征和体外皮肤渗透研究提供了关于纳米载体性能和皮肤递送的关键见解，同时也为复杂纳米载体系统的合理设计提供了一个系统化和可扩展的框架。

**2. 材料与方法**
2.1. 材料
18β-甘草酸（GA）购自意大利米兰的Sharon Personal Care；Lipoid? S100（大豆卵磷脂，含94%磷脂酰胆碱）由德国路德维希港的Lipoid GmbH提供；植物甘油购自意大利巴列塔的Farmalabor；SAFIC’ Care T A 500（海藻酸盐）由意大利米兰的Safic Alcan提供；Creamelt? COC（环烯烃共聚物）3D打印丝材购自瑞士拉珀斯维尔-约纳的Creamelt；纯乙醇（EtOH ≥ 99.8%）购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich；高效液相色谱（HPLC）级别的甲醇（MeOH）购自比利时鲁汶的VWR；纯净水来自Millipore Milli-Q超纯水系统（Millipore，美国马萨诸塞州贝德福德）。

2.2. COC微流控芯片的3D打印
3D打印微流控芯片采用计算机辅助设计（CAD）软件进行设计，优化了内部结构以实现有效的被动混合。使用Ultimaker Cura 4.3软件（Ultimaker，荷兰乌得勒支）将其转换为可打印格式，并使用FDM 3D打印机（Ultimaker 3，荷兰）进行打印，打印速度为25 mm/s，喷嘴直径为0.25 mm，打印温度为240°C。最终设置中，使用探针针和聚乙烯管将3D打印芯片连接到安装在注射泵上的两个注射器（Aladdin，WPI Europe，德国弗里德贝格）。

2.3. 乙醇脂质体、甘醇脂质体和甘醇脂质体的微流控配方制备
通过微流控技术制备纳米载体时，将一定量的S100和18β-GA或S100、18β-GA和甘油溶解在纯乙醇中，然后以受控流速注入水中或水与甘醇的混合物中，保持最终乙醇浓度为25%体积分数。甘油在水和乙醇相中均匀分布，以符合配方要求。样品从芯片出口收集。对于甘油脂质体，使用样品浓缩器（Alltech Model 190 A，Alltech Inc., 美国）在真空条件下蒸发有机溶剂（图1）。所有纳米载体的具体实验条件均根据实验设计（DoE）确定。

**图1. 3D打印芯片的打印（A）；使用微流控芯片生产乙醇脂质体（B）；生产甘醇脂质体（C）；去除乙醇（E）；使用动态光散射（DLS）进行表征（F）**

2.4. 实验设计（DoE）
实验设计包括筛选设计和优化设计，使用Design Expert Stat-Ease?软件（版本23.1，Stat-Ease Inc., 美国）进行。该方法用于评估工艺参数（自变量）如S100浓度、18β-GA浓度、总流速（TFR）和甘油浓度及其对颗粒尺寸和粒径分布指数（PDI）的影响。筛选阶段采用两水平全因子设计（Montgomery，2017），优化阶段采用中心复合设计（CCD）和Box-Behnken设计（BDD）。通过ANOVA分析确定并验证多元回归数学模型。每个实验条件重复三次，采用随机区组设计，包含三个区组以考虑系统变异。统计评估的显著性水平为5%（p < 0.05）。回归性能通过决定系数R2、调整后R2（adj-R2）和预测R2（pred-R2）进行评估。R2值通常用于衡量模型对实验数据的拟合程度，但随着新变量的增加，R2值可能上升，即使这些变量实际相关性不高，也可能导致过拟合。相比之下，调整后R2更准确，考虑了模型中的预测变量数量，并仅在新变量显著改善模型性能时才增加。预测R2用于评估模型预测新数据的能力。adj-R2和pred-R2之间的良好一致性（差异小于0.2）表明模型既具有良好的拟合度，也具有较强的预测能力。

2.4.1. 筛选设计
采用两水平全因子设计（2^3）评估乙醇脂质体的工艺参数（S100浓度、18β-GA浓度、TFR）；对于甘油脂质体和甘醇脂质体，则采用两水平全因子设计（2^4）（S100浓度、18β-GA浓度、TFR和甘油浓度）。各因素的实际值和编码值见表S1，颗粒尺寸和PDI作为响应变量。为提高模型准确性并估计实验变异，设计分为三个区组，并增加了三个中心点。因此，乙醇脂质体共进行了27次实验（表S2），甘油脂质体和甘醇脂质体分别进行了51次实验（表S3和表S4）。

2.4.2. 优化设计
根据研究因素的数量，采用了不同的优化设计。对于乙醇脂质体，由于只考虑了两个自变量（S100浓度和TFR），采用中心复合设计；对于甘油脂质体和甘醇脂质体，则采用Box-Behnken设计，评估了三个因素（S100浓度、TFR和甘油浓度）。根据筛选设计的结果确定各因素的取值范围，18β-GA浓度固定为0.5 mg/mL。各因素的实际值和编码值见表1，颗粒尺寸和PDI作为响应变量。

**表1. 优化设计中选定因素的实际值和编码值**
| 因子 | 编码值 | 实际值 |
|-----------------|-----------------|-----------------|
| S100浓度（mg/mL） | ?10 | 68 |
| TFR（mL/min） | 20 | 30 |
| 甘油浓度（%v/v） | 10 | 30 |
| 50 | | |

2.5. 纳米载体的物理化学表征
2.5.1. 动态光散射（DLS）
使用动态光散射仪（Zetasizer Nano S，Malvern Panalytical Srl，英国伍斯特）对制备的制剂进行平均粒径（Z-average）和粒径分布指数（PDI）的表征。样品在纯化的去离子水中进行稀释（1:100 v/v），测量在25°C下进行，所有实验均重复三次。结果以平均值±标准差表示。2.5.2 药物包封效率（EE%）研究 采用间接方法对优化配方的包封效率（EE%）进行了研究。首先，将样品在去离子水中稀释1:6，然后在45000 rpm和4°C下进行60分钟的超速离心，接着使用HPLC（Agilent 1260 Infinity II，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）测量上清液中的未包封18β-GA含量，该仪器配备有C18柱（InfinityLab Poroshell 120 C18柱，3 × 100 mm，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA），流动相为0.5%甲酸和甲醇的等渗混合物（比例15:85 v/v），流速为1 mL/min。注射体积为20 μL，检测信号在254 nm（紫外灯）处记录，分析系统保持在室温。在分析之前，使用0.001至0.25 mg/mL范围内的多个浓度准备了18β-GA标准品的校准曲线，相关系数（R2）分别为ethosomes的0.9967，glycethosomes的0.9985和glycerosomes的0.9995。检测限和定量限分别为1.89 μg/mL和0.057 μg/mL。所有实验均重复三次。结果以平均值±标准差表示。18β-GA的EE%通过以下公式计算（公式（1）：(1)E% = (Tdrug ? Sdrug) / (Tdrug × 100)，其中Tdrug是用于配方的总药物量，Sdrug是用HPLC测量的上清液中的药物量。2.5.3 纳米粒子追踪分析（NTA）和ζ电位 使用NanoSight LM10仪器（Malvern Panalytical Srl，Worcester，UK）对优化配方的纳米粒子追踪分析（NTA）和ζ电位进行了测量。测试前，样品用蒸馏水逐级稀释至适合NTA分析的粒子浓度，然后用1 mL无菌注射器注入LM单元。录制了五个60秒的视频，随后使用NTA 3.1分析软件（NanoSight，Malvern，UK）进行分析。所有实验均重复三次。结果以平均值±标准差表示。2.5.4 透射电子显微镜（TEM） 优化配方还通过透射电子显微镜（TEM，HT 7800系列，Hitachi，Tokyo，Japan）进行了表征，使用100 kV的加速电压来确认囊泡的形成并评估其形态。分析前，样品用磷钨酸溶液（1%）染色。简要来说，将一滴纳米粒子悬浮液滴在涂有碳的铜网上，然后用滤纸吸干多余液体。接着向网上加入一滴1%磷钨酸溶液进行负染色。去除多余液体后，用两滴水洗涤网格，并在室温下空气干燥。2.6 稳定性研究 通过在4°C下储存优化后的纳米载体配方3个月，并定期（0、7、14、21、30、60、90天）进行分析，评估其稳定性。所有配方均重复三次，结果以平均值±标准差表示。2.7 凝胶制备和表征 选择优化配方制备用于局部应用的凝胶，使用海藻酸盐作为凝胶剂。海藻酸盐是一种天然的阴离子多糖，主要由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古鲁糖醛酸残基组成，加水后可形成粘稠的凝胶（Abka-khajouei等，2022）。简要来说，在室温下，将0.4% w/v的海藻酸盐缓慢加入到含有0.5%（w/v）18β-GA的囊泡悬浮液中，并持续搅拌（300 rpm），直到聚合物完全水化并形成均匀的凝胶。选择此浓度是基于初步测试，以确保适合局部应用，易于涂抹并具有适当的皮肤粘附性。使用流变仪（MCR302e，Anton Paar，Graz，Austria）和板-板几何结构（PP，25 mm ?，间隙1 mm）对凝胶的pH值和流变特性进行了表征。流动曲线是在25°C下，剪切率从0.1增加到100 s^-1的范围内获得的，而振幅扫描测试在固定频率1 Hz下进行，应变值范围从0.01%到1000%。2.8 使用Franz型扩散细胞的体外渗透研究 2.8.1 皮肤制备 由于猪皮的形态与人类皮肤相似（Summerfield等，2015），本研究使用了猪皮。从哥本哈根大学兽医和动物科学系获得的新鲜猪皮用PBS（pH 7.4，25°C）清洗，切下皮肤样本并修剪毛发。随后使用Zimmer Dermatome AN（Zimmer Biomet Denmark，Albertslund，Denmark）将皮肤切片至500 μm厚度。切好的皮肤样品储存于-20°C待进一步使用。2.8.2 皮肤渗透和保留研究 皮肤样品安装在垂直的Franz扩散细胞（Phoenix DB-6 Dry Heat Diffusion Cells，Teledyne Hanson Research，Chatsworth，CA，USA）上，扩散表面积为1 cm2。使用10 mL的EtOH:PBS混合物（30:70 v/v）作为受体溶液，在实验过程中持续搅拌（600 rpm）。添加EtOH以确保药物在受体介质中的充分溶解（Tiboni等，2020）。系统设定在35 °C ± 0.1 °C下，以保持皮肤表面温度为32 °C ± 0.1 °C（Oh等，2020）。测试前，受体溶液通过超声处理脱气30分钟。解冻后的皮肤切片表皮侧朝上固定在Franz细胞上，放置约30分钟以达到平衡。为了确认皮肤完整性，使用AquaFlux? AF200探头（Biox Systems Limited，London，UK）测量经皮水分流失（TEWL），该探头配备有耦合元件，可以从Franz细胞的供体室直接测量数据。TEWL < 20 g/m2/h的皮肤被广泛认为是完整的SC屏障，包含在实验中（OECD，2004；Levin和Maibach，2005；Fluhr等，2006）。在渗透研究前后进行了测量，每个皮肤样本至少测量三次。通过预先测试18β-GA在受体介质中的溶解度，确保满足沉降条件。在皮肤上施用了含有0.5% 18β-GA的配方740 μL（Summerfield等，2015）。在特定时间点（19、20、21、22、23和24小时），从受体室取出600 μL的样本，补充新鲜受体溶液并离心（21,130 × g，20分钟）。收集上清液，并使用HPLC测定18β-GA的含量。选择24小时的实验时间框架，符合标准的Franz扩散细胞协议，适用于评估在受控体外条件下的短期皮肤渗透和保留情况。使用以下公式（公式（2）计算时间t时通过皮肤的18β-GA累积量（Qt）（Fda和Cder，2026）：(2)Qt = CtVR + ∑i=1t?1CiVsA，其中：Ct（mg/mL）是时间t时收集的样本中18β-GA的浓度，VR（mL）是受体溶液的体积，∑i=1t?1Ci是从i到t-1的时间点样本中18β-GA的总浓度，VS是样本的体积，A是渗透面积（1 cm2）。通过以下公式（公式（3）计算随时间累积的18β-GA百分比（Q%）（Coderch等，2021）：(3)Q% = Qt / (Total amount of 18βGA applied × 100)。24小时后，收集供体室中的所有液体，并用棉签去除皮肤表皮表面剩余的配方。样品放置30分钟以确保细胞内环境干燥。之后，通过测量TEWL来评估配方对皮肤完整性的影响。对于未渗透的18β-GA，将棉签转移到5 mL的Eppendorf管中，并加入1 mL的提取溶剂（MeOH）。为了分析药物保留情况，拆卸Franz细胞，然后将皮肤切片包裹在铝箔中，在60 °C的烤箱中加热15分钟，然后用手术刀和镊子分离表皮和真皮。每个分离的皮肤层放入5 mL的Eppendorf管中，并加入1 mL的提取溶剂（MeOH）。所有管子均超声处理（20分钟），涡旋混合后在室温下静置24小时。最后，离心（21,130 × g，20分钟），收集上清液，并使用上述方法测定18β-GA的含量。2.9 扩展性研究 进行扩展性研究，以评估是否可以在保持实验室规模下优化的理化性质的同时增加纳米粒子的产量。为了生产更大体积的样品，用蠕动泵替换了注射泵，同时保持微流控芯片设计和关键配方参数不变，包括乙醇、甘油、S100和18β-GA的浓度。由于蠕动泵无法达到注射泵的相同TFR，因此将流速设置为可实现的最大值，同时保持FRR不变以维持最终的配方组成。对于甘油颗粒，有机溶剂在50 °C的加热搅拌器上蒸发过夜，因为小规模使用的样品浓缩器不适合较大体积。通过比较大尺度批次和实验室规模参考配方在粒度和多分散指数（PDI）方面的差异，评估了扩大生产对纳米粒子质量的影响。2.10 统计分析 使用OriginPro软件（版本2022）（OriginLab Corporation，Northampton，MA，USA）进行数据分析。对于DoE，进行了方差分析ANOVA，以5%的显著性水平识别显著因素。使用p值、F值以及回归系数R2、adj-R2和pred-R2评估模型质量。当p < 0.05时认为模型显著，并根据最高的adj-R2和pred-R2-adj-R2差异小于0.2来选择最佳拟合模型。编码方程用于识别影响因素和相互作用，而基于实际因子水平的方程用于生成响应表面图。对于皮肤完整性测试，使用了双向ANOVA，随后进行Tukey的多重比较测试以确定组间统计差异。组间皮肤保留率的差异通过单向ANOVA和Tukey的多重比较测试确定。结果以平均值及其标准差表示，统计显著性用p值表示：(*)表示p ≤ 0.05，(**)表示p ≤ 0.01，(***)表示p ≤ 0.001，(****)表示p ≤ 0.0001。使用OriginPro软件创建了3D图表。3. 结果和讨论 3.1 3D打印微流控芯片的制备和性能 使用定制的3D打印微流控芯片生产纳米载体，通过被动微混合精确控制粒子大小和PDI。芯片设计促进了水相和乙醇相之间的高效层流共流，这两种相分别从不同的入口进入，在微混合区域合并后收集。这种配置确保了快速的均匀混合，有利于控制脂质囊泡的成核和生长。微流控技术相比传统方法具有优势，因为微尺度上的层流使得混合可预测，粒子形成均匀，批次间变异性最小，同时支持高药物装载效率。结合熔融沉积建模（FDM），这种方法提供了一个低成本、易于获取且可扩展的平台，用于生产具有严格质量控制属性的纳米载体（Tiboni等，2021；Zhang等，2023）。3.2 通过微流控筛选纳米载体制造过程 采用2-Level全因子设计来评估独立变量S100浓度（X1）、TFR（X2）、18β-GA浓度（X3）和甘油浓度（X4）及其相互作用对依赖变量粒子大小（Y1）和PDI（Y2）的主要影响。编码方程和FIT统计参数报告在表S5和图S1中。根据编码方程的系数，ethosomes的粒子大小随着S100浓度的增加和TFR的降低而增大。相比之下，glycethosomes和glycerosomes的粒子大小随着S100、18β-GA浓度和甘油浓度的降低以及TFR的升高而增大。ethosomes的PDI随着S100浓度、TFR和18β-GA浓度的增加而降低，glycethosomes的PDI随着S100浓度、TFR和18β-GA浓度的增加以及甘油浓度的降低而降低，而对于glycerosomes，PDI随着S100浓度的增加和TFR的降低以及18β-GA和甘油浓度的降低而降低。根据分析结果，选择了能够生产出最小和最大平均粒径以及最佳颗粒分布指数（PDI）的制造条件，为后续研究做准备。我们专注于变量X?（S100浓度）、X?（TFR）和X?（甘油浓度）进行优化过程，同时将X?（18β-GA浓度）固定在0.5?mg/mL。尽管X?在某些方程中是一个重要参数，但为了确保结果的可比性，我们将其从变量集合中排除。这种药物浓度代表了在保持纳米粒子可接受PDI的同时能够成功封装的最高值，这一点也得到了Tiboni等人先前研究的证实（Tiboni et al., 2020）。

3.3. 通过微流控技术优化纳米载体制造过程
选定的优化范围为S100浓度在6至10?mg/mL之间，TFR范围在20至40?mL/min之间，甘油浓度在10至50%（v/v）之间（对于glycethosomes和glycerosomes），18β-GA浓度固定为0.5?mg/mL。对于ethosomes采用了中心复合设计（CCD）（表2），而对于glycethosomes和glycerosomes分别采用了Box–Behnken设计（BBD）（表3和表4）。为了提高结果的可靠性，每个中心点进行了三次重复实验，ethosomes共进行了11次实验，glycethosomes和glycerosomes共进行了15次实验。观察到的响应首先被拟合到二次数学模型中，然后通过消除方程中p值大于0.05的不显著项来进行精炼，总结见表5。在所有筛选设计中，精炼后的模型显示出比二次模型更低的p值和更高的adj-R2值，表明准确性和可靠性得到了提升。此外，预R2值与adj-R2值吻合良好，两者之间的差异小于0.2，除了ethosomes的PDI（Y2）的精炼数学模型外，其预R2值为负，这表明该模型在所研究的实验范围内的预测能力有限。因此，这一限制并不影响DoE方法的整体稳健性，因为优化策略主要是基于粒径这一关键质量属性，而PDI则被视为次要描述符，在所有配方中始终保持在可接受的范围内。因此，确认实验对于验证选定的最佳条件并确保在设计空间内的模型可靠性是必不可少的。

表2. 通过DoE优化ethosomes的微流控制造过程：不同运行次的粒径和PDI。
标准运行
输入 输出
X1 X2 Y1 Y2
S100浓度（mg/mL） TFR（mL/min） 粒径（nm） PDI
4 10 40 9?±?20.2 3?±?0.01
12 62 94 4?±?20.2 3?±?0.02
23 10 20 144 4?±?50.3 3?±?0.03
64 10 30 122 2?±?10.2 6?±?0.01
11 58 30 101 1?±?20.2 3?±?0.01
36 64 74 108 2?±?10.2 1?±?0.01
97 30 98 20.2 2?±?0.02
58 63 98 140.2 3?±?0.05
109 30 95 10.2 2?±?0.02
71 10 82 110 10.2 3?±?0.01
81 84 090 10.2 2?±?0.01

表3. 通过DoE优化glycethosomes的微流控制造过程：不同运行次的粒径和PDI。
标准运行
输入 输出
X1 X2 X3 Y1 Y2
S100浓度（mg/mL） TFR（mL/min） 甘油浓度（% v/v） 粒径（nm） PDI
1 18 20 50 125?±?10.2 1?±?0.01
12 62 20 30 85?±?10.28 1?±?0.02
93 20 10 94 10.22 1?±?0.01
34 64 03 64 10.29 1?±?0.01
10 58 40 108 10.19 1?±?0.01
86 10 30 50 161 1?±?20.36 1
12 78 40 50 130 10.35 1
13 83 30 80 10.24 1
14 83 30 100 10.35 1
15 83 30 79 10.24 1
15 63 10 107 1
16 30 50 121 10.24 1
11 10 30 149 20.4 1
12 10 20 30 116 1
14 13 83 30 110 2
15 83 30 79 10.24 1
15 63 10 107 1
16 30 50 121 10.24 1
11 10 30 116 1
14 13 83 30 10.4 1
15 83 30 96 1
15 63 10 107 1

表4. 通过DoE优化glycerosomes的微流控制造过程：不同运行次的粒径和PDI。
标准运行
输入 输出
X1 X2 X3 Y1 Y2
S100浓度（mg/mL） TFR（mL/min） 甘油浓度（% v/v） 粒径（nm） PDI
2 10 20 30 117 30.26 1
3 10 20 30 97 20.51 1
13 83 30 98 10.25 1
14 83 30 96 10.26 1
10 58 40 109 10.24 1
14 83 30 95 10.24 1
11 78 20 50 147 2
12 84 40 50 175 3
15 83 30 79 1
15 63 10 107 1
16 30 50 220 10.39 1
10 10 30 50 188 2
11 82 10 101 1
15 82 10 101 1
12 63 30 108 4 10.26 1
11 36 20 30 100 10.27 1
14 10 30 107 1

表5. 粒径和PDI的方差分析（ANOVA）。
空单元 R2 Adj-R2 Pred-R2
精炼模型（编码方程）
粒径（Y1） Ethosomes 0.8842 0.8346 0.6471
Y1=54 471.63+3298 9.15 X1?31 246.19 X2+2903 8.03
X12 Glycethosomes 0.8929 0.8500 0.7992
Y1=90 44+18.4 X1?5.44 X2+21.75 X3+21.98
X32 Glycerosomes 0.9559 0.9228 0.8167
Y1=0.00 037?4x10?6 X1+0.00 03 X2?1.6x10?5 X3+0.00 06X?3?4x10?6 X23?1.1x10?5 X32

基于编码方程的系数（表5），ethosomes的粒径随着S100浓度的增加和TFR的降低而增大。同样，glycethosomes的粒径随着S100和甘油浓度的增加以及TFR的降低而增大。相反，glycerosomes的粒径随着S100和甘油浓度的降低以及TFR的增加而增大。对于ethosomes，PDI随着S100浓度的降低和TFR的增加而减小。对于glycethosomes，PDI随着S100浓度的降低和甘油浓度的增加而减小。图2展示了与ethosomes（图2a-b）的粒径和PDI与TFR和S100浓度之间的相关性，以及glycethosomes（图2c-d）和glycerosomes（图2e-f）的粒径和PDI与甘油和S100浓度之间的相关性。通过将选定配方的预测值与实验结果进行比较，验证了开发模型的可靠性，并支持了优化策略的稳健性（表S6）。

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图2. 优化设计空间揭示了过程参数与样品形态之间的相关性。ethosomes的粒径（A）；ethosomes的PDI（B）；glycethosomes的粒径（C）；glycethosomes的PDI（D）；glycerosomes的粒径（E）；glycerosomes的PDI（F）。

3.4. 优化配方的物理化学表征
根据优化研究的结果，选择了三种配方进行进一步表征。这些配方基于其粒径在理想的纳米范围内（70–100?nm），可接受的PDI表明粒径分布均匀，以及固定的甘油浓度（30% v/v）和18β-GA浓度（0.5?mg/mL），以确保不同纳米载体系统之间的一致性和可比性。选定的优化配方分别为ethosomes、glycethosomes和glycerosomes一个，它们在小粒径、低PDI和适当的辅料组成之间达到了最佳的平衡，这一点由精炼的DoE模型预测并通过实验得到证实。因此，这些优化的纳米载体被选用于全面的物理化学表征和纳米结构评估（表6）。

表6. 选定的配方参数。
空单元 S100（mg/mL） TFR（mL/min） GA（mg/mL） 甘油（%v/v） 粒径（nm） PDI
Ethosomes 6 30 0.5/78?±?10.1 8?±?10.18?±?0.02
Glycethosomes 6 30 0.5 307 3?±?10.18?±?0.04
Glycerosomes 10 40 0.5 309 120.27?±?0.04

3.4.1. 药物包封效率（EE%）、ζ-电位和稳定性研究
通过长时间的稳定性研究评估了优化后的配方，测量了90天期间多个时间点的粒径和PDI，同时在0时刻和储存结束时确定了EE和ζ-电位。这些参数共同提供了关于囊泡结构完整性、胶体行为和整体适用性的全面指示（Danaei et al., 2018）。稳定性研究证实了优化纳米载体的稳健性。ethosomes在整个90天期间保持了狭窄的粒径范围（77–92?nm），仅略有增加，而PDIs保持在较低水平（0.18–0.27）。Glycethosomes表现出类似的稳定特性，囊泡尺寸从73?nm适度变化到93?nm，PDI值始终较低（0.18–0.22）。Glycerosomes最为稳定，纳米尺寸几乎不变（93–92?nm），并且初始PDI略高，随着时间推移保持稳定（0.27–0.28），没有出现囊泡聚集或结构不稳定的迹象。所有配方的EE%均令人满意，尽管与它们的组成一致，显示出不同的趋势。Ethosomes显示出最高的药物负载能力（超过81%），这证明了18β-GA对乙醇流化磷脂双层的强烈亲和力。Glycethosomes和glycerosomes的值略低（分别超过69%和63%），这与它们较低的乙醇含量以及甘油对囊泡膜的结构增强作用相符。重要的是，在研究结束时没有观察到EE%的显著变化，从而证实了没有药物泄漏或囊泡不稳定的现象。所有系统的ζ-电位值均为负值，反映了磷脂头基的阴离子性质以及乙醇和/或甘油的存在。Ethosomes在0时刻显示出最负的值（?24?mV），90天后略微降至?17?mV，而glycethosomes和glycerosomes的负电荷略微降低（分别为?20?mV和?17?mV），并且随时间保持稳定。这些值表明了良好的胶体稳定性，并与分散良好的囊泡系统的形成一致。总体而言，这些数据表明所有三种优化配方都表现出高药物负载能力、适当的表面电荷以及优异的物理化学稳定性，从而支持它们适用于后续的皮肤递送分析（表7）。图3显示了优化纳米粒子的TEM分析，证实了纳米囊泡的形成。所有纳米粒子均匀、光滑且呈规则的球形，具有均匀的分布。在glycethosomes和glycerosomes中观察到了围绕囊泡的甘油层，导致紧密排列并形成了三维网络，这与Manca等人之前的报告一致（Manca et al., 2019）。

表7. 稳定性研究、EE和ζ-电位。数据为三次独立实验的平均值±标准差。
Day Ethosomes Glycethosomes Glycerosomes
粒径（nm） PDI EE% ζ-电位（mV）
0 77?±?10.18 80.7?±?3.9 ?24.2?±?1.27
3 77?±?10.18 63.0?±?2.3 ?20.0?±?4.2
9 77?±?10.18 3?±?12 0.27 ?20.0?±?4.2
6 77?±?10.18 65.8?±?8.7 ?17.3?±?3.2
7 77?±?10.18 71?±?12 0.18 ?92?±?15
9 77?±?10.18 148 1?±?10.22 ?92?±?15
14 77?±?10.18 81?±?10.22 ?90?±?15
10 77?±?1然而，对于实际的外用给药来说，水凝胶制剂具有优势，因为它们能更好地附着在皮肤上，提高接触时间，并确保更均匀的涂抹效果，这与观察到的流变行为一致。对照组1和对照组2在皮肤中的药物浓度更高，这可能是由于饱和溶液产生的陡峭浓度梯度以及没有载体介导的释放限制，从而导致药物快速扩散。这些发现表明，从制剂中释放药物是控制皮肤给药速度的关键步骤，特别是对于甘油载体脂质体（glycethosomes）和水凝胶系统而言。因此，纳米载体充当基于制剂的储存系统，调节药物在皮肤表面的可用性，并支持可控和局部的给药（Manca等人，2013年；Peralta等人，2018年）。不同制剂之间的差异可以归因于甘油、乙醇和磷脂之间的特定相互作用。甘油载体脂质体（含30%甘油和25%乙醇）由于甘油与磷脂头部基团的氢键作用而表现出更高的双层刚性，增强了局部微粘度并稳定了膜结构（Manca等人，2013年；Abou-Saleh等人，2019年）。虽然乙醇通常会使脂质膜液化，但其效果被甘油部分削弱，因为甘油会竞争氢键位点（Chanda等人，2006年）。这导致了更稳定、渗透性更低的膜，并减少了18β-GA的释放。不含乙醇的甘油载体脂质体由于能够保持皮肤表面的水分而改善了皮肤的渗透性，而含乙醇的乙酰甘油载体脂质体（ethosomes）则由于其液体的高可变形性而实现了良好的18β-GA渗透效果（Zhang等人，2022年）。总体而言，甘油载体脂质体具有很高的稳定性，但皮肤渗透性较低；而甘油-乙醇载体脂质体结合了高物理化学稳定性和增强的皮肤保留能力，使其成为18β-GA局部给药的最佳载体。它们无乙醇的组成进一步降低了刺激风险，支持了重复的外用应用和药物在皮肤中的持续沉积。

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图5. 18β-GA在皮肤中的保留和渗透情况。“表皮”和“真皮”条形图表示各自皮肤层中保留的18β-GA量，“残留”条形图表示24小时后供体腔室中剩余的18β-GA量，“受体”条形图表示24小时后渗透到皮肤中的18β-GA量。数据为6次重复实验的平均值±标准差。

3.7. 扩大规模研究
通过定期（0、10、20、30和40分钟）收集微流控芯片的输出来进行放大生产，然后分析粒子大小和多分散指数（PDI）（表8）。乙酰甘油载体脂质体的TFR（输送速率）为23.5 mL/min，甘油载体脂质体为25.5 mL/min，甘油载体脂质体为29.2 mL/min。粒子大小和PDI值与优化实验设计（DoE）预测的值相符。预测值与观察值之间的差异在可接受范围内，进一步证实了模型的预测可靠性，并支持了优化策略的稳健性。与实验室规模条件相比，降低TFR仅导致粒子大小和PDI略有增加，但仍然处于可接受的范围内，适合外用给药。结果还确认了生产过程的稳定性：在整个收集期间，粒子大小和PDI保持相对恒定，表明纳米颗粒的形成是可重复且受良好控制的。这些发现表明，3D打印的微流控芯片结合蠕动泵可以实现18β-GA载脂纳米颗粒的连续生产，而不影响关键的质量属性。总体而言，该过程具有稳健性和可扩展性，支持其在受控和可重复条件下的大规模生产应用。

表8. 在放大生产过程中不同时间点收集的18β-GA载脂纳米颗粒的粒子大小和PDI。数据为三次独立实验的平均值±标准差。

时间（分钟）
乙酰甘油载体脂质体
甘油载体脂质体
甘油载体脂质体
粒子大小（nm）
PDI
粒子大小（nm）
PDI
0
90 ± 10.2
10
± 0.01
18
± 10.2
9
± 0.03
15
± 20.3
± 0.01
10
9
7
± 10.2
5
± 0.02
8
6
± 20.3
1
± 0.03
9
7
± 10.2
5
± 0.01
20
8
2
± 10.1
6
± 0.01
7
1
± 10.2
2
± 0.01
10
6
± 20.3
3
± 0.01
30
8
7
± 10.1
8
± 0.02
7
1
± 10.2
4
± 0.01
11
2
± 20.3
7
± 0.02
40
8
7
± 10.1
7
± 0.01

4. 结论
在这项研究中，使用定制的3D打印微流控芯片成功生产了含有18β-GA的乙酰甘油载体脂质体、甘油载体脂质体和甘油载体脂质体，实现了对粒子大小和PDI的精确且高度可重复的控制。基于FDM的3D打印技术与微流控技术的结合有效克服了与成本效益和可重复制造相关的挑战，实现了18β-GA的外用给药。的质量设计（QbD）方法的应用使得能够为每种纳米载体类型开发预测性数学模型和设计空间，从而确定出具有定制物理化学性质的纳米颗粒的最佳配方参数。长期稳定性研究证实，所有优化后的配方在90天内保持了其粒子大小、PDI、电荷效率（EE）和ζ-电位。将其掺入海藻酸盐水凝胶中赋予了理想的剪切稀释流变行为，便于外用应用，同时保持了囊泡的完整性。体外皮肤渗透研究表明，配方组成显著影响了药物输送过程。乙酰甘油载体脂质体实现了对表皮和真皮的可测量药物输送，而甘油载体脂质体表现出增强的结构稳定性但皮肤吸收有限；甘油载体脂质体在不使用乙醇的情况下实现了良好的皮肤渗透，支持了重复的外用应用。水凝胶制剂进一步减少了药物释放和皮肤渗透，反映了聚合物基质引入的额外扩散屏障。结果表明，从制剂中释放药物是控制皮肤给药速度的关键步骤，表明是一种基于配方的给药机制。在这种情况下，纳米载体在配方层面充当储存系统，调节药物在皮肤表面的可用性，并支持可控和局部的给药。尽管开发的模型在定义的设计空间和配方条件下表现出良好的预测能力，但它们对其他药物的适用性需要进一步的实验验证。这项研究的优势在于其基于QbD的开发策略的通用性，而不仅仅是一个普遍适用的模型。尽管如此，所提出的框架可以通过根据不同药物的特定物理化学性质重新定义设计空间而轻松适应其他药物。最后，使用蠕动泵进行的放大生产实验证实了纳米颗粒生产的连续性，突显了微流控芯片的稳健性和可重复性，并支持其作为成本效益高、可扩展、连续且适合工业化的临床转化制造方法的潜力。

**作者贡献声明**
Giulia Bucciarelli：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据分析。
Giulia Curzi：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、概念化。
Mattia Tiboni：撰写——审阅与编辑、监督、方法学、数据分析。
Annalisa Aluigi：撰写——审阅与编辑、监督、方法学、数据分析。
Andrea Heinz：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、方法学、概念化。
Luca Casettari：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、监督、项目管理、资金筹集、概念化。

**资助**
本工作得到了欧盟NextGenerationEU项目第4任务第2组的支持，由意大利大学和研究部（MUR）的国家创新生态系统资助（ECS00000041 - VITALITY – CUP H33C22000430006）。