受生物启发的ω-3脂肪酸与肽的自组装技术用于实现响应式药物输送

《International Journal of Pharmaceutics: X》：Bio-inspired self-assembly of omega-3 fatty acids and peptides for responsive drug delivery

　　西蒙娜·布拉恰 | 路易吉·阿尔法诺 | 玛丽亚·卡门·拉戈斯塔 | 罗莎·贝拉维塔 | 加布里埃拉·达乌里亚 | 埃马努埃拉·埃斯波西托 | 费德里卡·多纳迪奥 | 萨拉·帕拉迪诺 | 亚历山德罗·迪·瓦约 | 罗莎·卡梅林戈 | 卢西亚·法尔奇尼奥 | 安纳丽塔·法兰加 | 米凯利诺·德·劳伦蒂斯 | 安东尼奥·焦尔达诺 | 斯特凡妮亚·加尔迪耶罗
意大利那不勒斯费德里科二世大学医学院药学系

**摘要**
由于药物耐药性、全身性毒性和疗效不佳等问题，癌症治疗的长期临床效果往往不尽如人意。因此，需要开发新型药物递送平台以促进个性化医疗，从而提高患者的生活质量。在本研究中，我们开发并表征了一种基于二十碳五烯酸（EPA）的递送系统。该系统通过金属蛋白酶-9（MMP-9）特异性识别的蛋白水解序列实现了按需释放两种不同的抗癌药物——多柔比星或培美曲塞的功能化。我们制备了直径约为200纳米、 polydispersity 较低的 EPA-纳米颗粒（EPA-NPs），并对其聚集特性和结构稳定性进行了分析。最初在 HeLa 细胞（作为癌症模型）上测试了其治疗效果，因为这些细胞具有高转染效率和 MMP-9 的过表达。酶诱导的药物释放研究表明，在 MMP-9 存在的情况下，大约80%的药物在120分钟内被释放。共聚焦显微镜观察证实了有效的细胞内化过程；此外，多柔比星释放对 HeLa 细胞表现出抗增殖作用（24小时细胞毒性可达约60%），而对健康的角质形成细胞则无毒性。基于这些结果，该递送平台后来在更具有疾病特异性的间皮瘤模型上进行了测试，以验证其针对这种侵袭性癌症的治疗潜力。这些发现表明，EPA 纳米颗粒可能成为一个有前景的药物递送平台。

**1. 引言**
虽然已开发出许多化疗药物，但其临床效果常常受到严重副作用和药物被健康细胞非特异性摄取的限制，导致广泛毒性并限制了治疗效果。纳米医学和先进的药物递送技术提供了有希望的替代方案，可通过提高疗效、减少全身毒性、延长药物循环时间、实现靶向递送到特定组织、提高患者依从性以及支持更多创新和有效治疗策略的发展来改善治疗效果（Bellavita 等，2023；Del Genio 等，2022a；Falanga 等，2024）。过去几十年中，药物递送技术的进步使得 mRNA 疫苗得以实现，这在 COVID-19 大流行期间发挥了关键作用（Park 等，2021）。未来的研究重点将集中在改进组织和细胞靶向性、开发长效和控释系统、实现个性化递送平台，以及整合人工智能和机器学习等技术以提高精度和性能（Geng 等，2025）。向个性化医疗的转变突显了需要可量身定制给不同患者亚型的模块化药物递送系统的需求（Zheng 等，2025；Liu 等，2026）。在这种情况下，模块化和可生物降解的递送平台对于减少毒性和保护健康组织和器官至关重要（Waheed 等，2024；Shameli 等，2026）。事实上，可生物降解的递送系统相比于不可生物降解的系统具有明显优势：它们可分解为无毒副产物，减少长期积累；由于与天然分子相似而降低免疫原性；无需手术移除；实现可控和持续的药物释放；支持局部和靶向治疗；并且使用后对环境友好，能降解为无害物质（Yun 等，2025）。在本研究中，我们开发了一种使用 omega-3 脂肪酸作为载体的新型可生物降解药物递送平台。文献中已报道 omega-3 脂肪酸作为治疗载荷而非载体系统的结构成分的应用。通过自组装过程，这些脂肪酸形成稳定的模块化纳米颗粒，并可功能化为实现靶向作用或穿透屏障的基团。特别是鱼来源的补充剂（如 omega-3，一组多不饱和脂肪酸）因其在预防炎症、癌症、高脂血症、糖尿病和心血管疾病等方面的多种健康益处而受到研究者广泛关注（Lobine 等，2022；Tsugane，2021）。三大主要类型的 omega-3 脂肪酸是 α-亚麻酸（ALA）、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）。近期研究强调了 EPA 和 DHA 在癌症治疗中的潜在作用（Fodil 等，2022；Soni 等，2022）。此外，当与多柔比星（Dox）联合使用时，omega-3 能增强其疗效并减少负面副作用（Theinel 等，2023；Pettersen 等，2023）。早期临床试验表明，接受蒽环类药物治疗的乳腺癌患者在使用具有抗氧化作用的 β-阻断剂卡维地洛和 DHA 治疗时，心脏损伤可能减少，因为 DHA 可增强心脏的天然抗氧化防御（Carrasco 等，2020）。多项近期研究还探讨了 EPA/DHA 和 Dox 在癌症治疗中的联合应用（Jameel 等，2024；Crovella 等，2023；Gurav 等，2023）。因此，omega-3 展示出作为自组装骨架的巨大潜力，可用于开发新的癌症治疗药物（Fattahi 等，2020；Li 等，2022）。可以通过将 omega-3 与疏水或亲水药物分子通过可切割连接共价结合来制备可自组装或稳定包封在各种递送基质中的前药（Huang 等，2021；Wu 等，2020）。虽然有一些将 omega-3 整合到药物递送系统中的初步尝试，但尚未有研究旨在开发完全由 omega-3 组成的递送平台。例如，研究表明 DHA 可抑制肿瘤生长并增强紫杉醇和多西他赛的抗肿瘤效果（Wang 等，2021a），从而将其用于基于聚合物的纳米颗粒癌症治疗（Wang 等，2021a；Lanna 等，2021；Xie 等，2020；Chen 等，2022；Wang 等，2021b）。本文描述了首个完全由 EPA 制成的纳米递送平台的开发，该平台可降解后释放 EPA，进一步在靶点部位发挥有益作用。与基于脂质的递送系统（包括脂质纳米颗粒、脂肪酸基载体和自组装前药平台）相比，本平台完全由未结合的 EPA 组成，作为唯一结构材料，无需辅料即可实现自组装。

**2. 材料与方法**
**2.1 材料**
二十碳五烯酸（EPA）购自 Carbosynth（英国伯克郡），熔点为 -54°C。Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 从 GL Biochem Ltd（中国上海）购买。Rink 胺基 p-甲基苯ifaxylamine（MBHA）树脂、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH、N,N′-二异丙基碳二亚胺（DIC）、Oxyma pure、1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1,2,3-三唑[4,5-b]吡啶inium 3-氧化物六氟磷酸盐（HATU）、N,N-二异丙基乙胺、三异丙基硅烷（TIS）、2-丙醇、1-羟基苯并三唑水合物（HOBt）、N,N,N′-FBTetramethyl-O-(1H-苯并三唑-1-yl)URA 磷酸盐（HBTU）、Nile Red、Aldoxorubicin、罗丹明 B、四苯基膦钯(0) Pd(PPh3)4、1,3-二甲丁酸（NDMBA）、Aldoxorubicin、罗丹明 B 和 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）购自 Merck（意大利）。Fmoc-L-Glu(OAll)-OH、Fmoc-L-Lys(Mtt)-OH、哌啶和三氟乙酸（TFA）从 Iris Biotech GmbH（德国 Marktredwitz）购买。无水溶剂 [N,N-二甲甲酰胺（DMF）和二氯甲烷（DCM）从 Merck（意大利米兰）购买。培美曲塞购自 MedChemExpress。所有化学品和试剂均为分析级，按收到状态使用。

**2.2 肽类合成与纯化**
使用 Rink 胺基树脂（负载量为 0.63 mmol/g）作为肽类合成的固体支持。先用 30% 含哌啶的 DMF 溶液处理 2 分钟后去除 Fmoc 保护基团。以 Fmoc-Lys(Mtt)-OH 作为每个肽的第一个氨基酸，在赖氨酸侧链上进行 EPA 的偶联（图 S1）。每个反应分两步进行：第一步，将 Fmoc-氨基酸（2 当量）与 N,N′-二异丙基碳二亚胺（DIC，2 当量）和 Oxyma pure（2 当量）在 DMF 中混合 40 分钟；第二步，将 Fmoc-氨基酸（2 当量）与 HATU（2 当量）和 DIPEA（4 当量）在 DMF 中混合 40 分钟。为了共价偶联脂肪酸，先去除侧链上的赖氨酸 Mtt 基团。然后用 DCM:TFA:TIS（94:1:5, v/v/v）混合物处理树脂以完成 Mtt 去保护。该过程在室温下重复十五次，每次循环 20 分钟。使用 Kaiser 测试监测去保护进度（用于检测固相中的初级胺），以此确定 Mtt 的完全去除。随后使用二十碳五烯酸（2 当量）、DIC（2 当量）和 Oxyma pure（2 当量）在 NMP 中过夜进行脂肪酸偶联；第二步偶联使用 HATU（2 当量）和 DIPEA（4 当量）在 NMP 中进行 2 小时。通过将肽与罗丹明 B（Rho）（2 当量）、HoBt（2 当量）和 HBTU（2 当量）及 DIPEA（4 当量）在 DMF 中混合 3 小时进行标记。然后用 TFA/H2O/TIS（95/2.5/2.5, v/v/v）溶液在搅拌条件下将肽从树脂上分离 3 小时。肽沉淀在乙醚中并通过离心（2 × 15 分钟，6000 rpm）分离。肽溶解在 HFIP（20%）和 H2O（0.1% TFA）中，并通过 RP-HPLC 半制备型（Jasco）在 Phenomenex Kinetex C18 柱（5 μm，100 ?，150 × 21.2 mm）上进行纯化，使用线性梯度溶剂 B（0.1% TFA 在乙腈中）在溶剂 A（0.1% TFA 在水中）中从 10% 提升至 90%，流速为 15 mL/min，紫外检测波长为 220 nm。然后，纯肽通过分析型HPLC（Jasco LC-NetII/ADC）进行分离，使用的是Phenomenex Jupiter 4u Proteo柱子，柱径为90 ?，长度为150 × 4.6 mm，并在15分钟内以线性梯度从10%增加到90%（图S2-S8）。所有参与EPA纳米粒子形成的肽都列在表1中。表1. 用于EPA基纳米粒子形成的肽序列。

2.3. 多柔比星 conjugation
多柔比星通过共价键连接到肽Ac-Cys-PLGSYL-GGG-K(EPA) N端引入的半胱氨酸残基上的自由巯基上。肽Ac-Cys-PLGSYL-GGG-K(EPA)的N端带有乙酰基，其合成和纯化方法如上所述。 conjugation是在溶液中的马来酰亚胺部分（2当量）和半胱氨酸（2当量）之间进行的（Xie等人，2020年）。反应通过将肽溶解在DMF中（浓度为1 mg/mL）和多柔比星溶解在DMF中（浓度为1 mg/mL）来进行。肽溶液在40°C下在磁力搅拌板上搅拌，同时使用注射泵以25 μL/min的流速滴加多柔比星。此外，还向混合物中添加了DIPEA（5当量）。在药物完全加入肽后，反应在40°C下搅拌1小时，然后在室温下过夜反应。随后去除DMF，并对化合物进行冻干处理。所得到的化合物通过制备型HPLC进行纯化。反应过程通过NMR监测（补充材料图S9面板A）。

2.4. 佩梅特雷克塞德 conjugation
为了实现佩梅特雷克塞德的 conjugation，合成了一种含有MMP-9可切割序列Pro-Leu-Gly-Ser-Tyr-Leu的肽。该序列通过一个三甘氨酸连接器与用于EPA连接的C端赖氨酸分离。肽的N端还包括一个被烯丙基保护的谷氨酸残基，其α-氨基被乙酰化，随后在其侧链的γ-羧基处与佩梅特雷克塞德偶联。具体来说，烯丙基是使用Pd(PPh3)4（0.15当量）和NDMBA（3当量）在干燥的DCM/DMF（3:2, v/v）溶液中去除的，并在Ar下轻轻摇晃1小时。过滤后，用DMF和DCM洗涤树脂并使其干燥。然后再次进行烯丙基的去保护过程。用0.5%的N,N-二乙基二硫代氨基甲酸盐溶液在DMF中洗涤树脂两次（每次30分钟），然后使用LC-MS分析确认所有烯丙基都被去除。在偶联之前，通过将药物转化为其二甲基酯衍生物PEM(OMe)2（使用SOCl2在甲醇中），按照Miklán等人描述的步骤（Miklan等人，2011年）保护佩梅特雷克塞德的两个羧基。然后，将保护的的药物（3当量）与谷氨酸残基的羧基使用PyAOP（3当量）、DIPEA（6当量）和PEM(OMe)2（3当量）作为偶联试剂，在DMF中偶联。通过LC-MS分析确认反应完成后，从树脂中分离出肽，同时通过将粗肽溶解在1:1（v/v）的0.1 M NaOH和丙酮混合物中60分钟来去除甲基酯的保护基团。使用的氢氧化钠的浓度约为甲基酯的2.5倍摩尔量。去保护过程通过RP-HPLC监测。随后通过加入200 μL的0.1 M HCl来中和溶液。最后，通过HPLC纯化肽，并通过核磁共振（NMR）光谱确认其身份和结构完整性（补充材料图S9面板B）。

2.5. NMR 实验部分
Ac-C(Dox)-GGG-K(EPA)-CONH?和Ac-C(Dox)-PLGSYL-GGG-K(EPA)-CONH?的NMR分析是在有机溶剂CD?OD（99.8% D，Sigma Aldrich）中进行的，因为它们在298 K下的溶解度较低，使用的是位于那不勒斯“Federico II”大学药学系的700 MHz Bruker Neo Avance光谱仪，该光谱仪配备了5 mm的三共振梯度冷冻探头。样品溶液是通过将适量的产品溶解在600 μL的CD?OD中制备的。溶液呈透明红色。1D质子NMR谱的记录间隔时间（d?）为10秒，并使用MESTRENOVA 6.0软件（Mestrelab Research, S.L.，圣地亚哥-德孔波斯特拉）进行分析。2D同核谱如TOCSY（混合时间70 ms）和NOESY（混合时间300 ms）使用States方法在相位敏感模式下记录，t?有4096个数据点，t?值等距分布。异核（1H13C）HSQC谱使用t?有2048个数据点，t?值等距分布。残余水信号通过梯度抑制。所有2D谱均使用CARA程序进行分析。化学位移参考甲醇的CHD?质子：1H为3.35 ppm，13C为49.3 ppm。

类似地，PEM-EPA（Ac-E(PEM)PLGSYL-GGG-K(EPA)-CONH?的NMR分析也是在DMSO-d?（99.8% D，Sigma Aldrich）中进行的，因为其在298 K下的溶解度较低，使用的是相同的仪器和条件。样品溶液是通过将适量的产品溶解在600 μL的DMSO-d?中制备的。1D质子NMR谱的记录间隔时间（d?）为10秒，并使用MESTRENOVA 6.0软件进行分析。2D同核谱，包括TOCSY（混合时间30和70 ms）和NOESY（混合时间300 ms），使用States方法在相位敏感模式下记录，t?有4096个数据点，t?值等距分布。异核（1H13C）HSQC谱同样使用2048个数据点，t?值等距分布。残余水信号通过梯度抑制。所有2D谱均使用CARA程序进行分析。化学位移参考DMSO的CHD?质子：1H为2.49 ppm，13C为39.7 ppm。

2.6. EPA纳米粒子的制备
EPA纳米粒子是通过基于低能量的纳米乳液-溶剂蒸发方法制备的。使用乙醇（EtOH）这种可与水混溶的溶剂，以不同的比例溶解基于EPA的肽。所得溶液使用注射泵（流速50 μl/min）通过20号针头逐滴加入到水相中，在1500转/分钟的磁力搅拌下进行。乙醇与水的比例为1:2。然后使用旋转蒸发器去除有机溶剂，得到仅含水的EPA纳米粒子。

2.7. 尺寸和ζ电位的测量
使用Zetasizer Nano-ZS（Malvern Instruments，Worcestershire，英国）进行动态光散射（DLS）测量，以确定不同EPA纳米粒子制剂的尺寸和ζ电位。测量重复三次，使用4 mW的HeNe激光在633 nm波长下进行， scattering角度固定在173°，温度为25°C，每次运行包含10个周期。连续测量之间设置30秒的延迟。

2.8. 反向滴定以确定临界聚集浓度（CAC）
EPA单独及EPA偶联肽的CAC是通过使用Nile Red（一种溶致变色探针）的荧光测定法确定的。Nile Red倾向于定位在聚集系统等疏水区域，导致蓝移和增色效应。将3000 mM的EPA储备液加入到500 nM的Nile Red水溶液中，进行滴定，加入少量乙醇溶液（大约0.5–1 μl），以避免由于乙醇体积大导致的蓝移。每次添加后，振荡比色皿，随后在0.5–30 mM的EPA和EPA偶联肽范围内进行测量。使用Cary Eclipse Varian光谱仪测量每次添加后Nile Red的发射光谱。对于每个样品，至少进行三次Nile Red发射光谱的测量（激发波长550 nm，发射波长范围570至700 nm）。从三次独立测量（n=3）获得的数据中，通过绘制最大发射荧光对应波长（y）作为肽浓度（x）的函数，并用Sigmoidal Boltzmann方程进行拟合（OriginPro软件用于绘图）：
y = A1 ? A2 / (1 + ex^(-x0) + A2)
其中，A1和A2分别对应于Sigmoid曲线的上限和下限。x0和Δx分别表示Sigmoid曲线的拐点和陡峭程度。

2.9. 药物负载
Dox和PEM通过EPA的疏水相互作用负载到EPA纳米粒子的表面。药物负载量（DLC）是根据以下公式实验计算的：
DLC% = 纳米粒子中的药物重量 / EPA-NPs的重量 × 100
DLC可以直接从校准线读取，补充材料图S10。

2.10. 通过扫描电子显微镜（SEM）进行形态表征
EPA-gH、EPA-gH-Dox和EPA-gH-TP-PEM纳米粒子在200 μM浓度下制备，并通过SEM分析。每种配方的5 μL液滴滴在干净的硅片上，并在室温下空气干燥。图像是使用ThermoFisher Scientific公司的 dual beam FIB-SEM Aquilos 2获得的。采集参数为电流0.2 nA，电压7.5 kV，工作距离2.6 mm，视野4.14 μm，载物台倾斜0度，放大倍数为50,000倍。

2.11. 圆二色性（CD）分析
用于CD研究的结合到EPA（gH-EPA）上的肽细胞在磷酸盐缓冲液5 mM和20% 2,2,2-三氟乙醇（TFE）存在下制备，最终浓度为8 μM。使用Jasco J-180光谱仪在氮气流量下，在室温下从200 nm到260 nm记录CD光谱。每个光谱记录三次，并转换为平均摩尔椭圆率。

2.12. 通过MMP-9蛋白酶切割的体外Dox释放
EPA-gH-Dox配方在350 μM浓度下制备。首先用APMA 100 μM和Tris-HCl 50 mM（pH 7.2）预激活酶，并在37°C下放置3小时。然后将配方稀释到175 μM，并用缓冲液混合：50 mM HEPES、200 mM NaCl、10 mM CaCl2和1 mM ZnCl2，pH 7。之后，将纳米粒子与MMP-9（40 nM）在37°C下孵育。在每个时间点（30、60和120分钟），从混合物中取50 μL，以13,000 rpm的速度离心30分钟，然后通过NanoDrop ? 2000/2000C光谱仪（Jasco，米兰，意大利）在480 nm波长下分析上清液的吸光度（Dox）。

2.13. EPA-gH-Dox的血清稳定性
EPA-gH-Dox的血清稳定性通过DLS评估。EPA-gH-Dox在最终浓度350 μM下制备，并与10%的胎牛血清（FBS）在37°C下孵育不同时间（0、3、24、48、72小时）。在逐渐增加的时间间隔内，取出一部分纳米粒子并在90% ACN存在下以14,000 × g rpm的速度离心30分钟。上清液通过DLS分析，根据纳米粒子的大小强度评估PA-gH-Dox的稳定性。实验重复三次。

2.14. 细胞培养
HeLa、MSTO-211H和MET-5A细胞系来自美国典型培养 kolektion 2（ATCC, CCL-2），并在Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基（Thermo Fisher Scientific）中培养。培养基补充了10%的胎牛血清（FBS，Thermo Fisher Scientific）、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 μg/ml）和2 mM的谷氨酰胺。细胞在含有5% CO?的潮湿气氛中保持在37°C。MSTO-211H细胞系（双相间皮瘤）和MET-5A细胞系（正常间皮上皮细胞）在相同的条件下培养。Human HaCaT角质形成细胞系在DMEM（Sigma）中培养，补充了10%的胎牛血清（FBS，Cambrex，Verviers，比利时）、l-谷氨酰胺（2 mM，Sigma）和青霉素（100 units/ml，Sigma），并在含有5% CO?的潮湿气氛中保持在37°C。

2.15. 荧光共聚焦光谱
通过共聚焦显微镜研究了HeLa和MSTO-211H细胞对EPA-NPs的摄取情况，使用的是结合到肽gH-EPA上的罗丹明B荧光信号。孵育1小时后，细胞用PBS洗涤两次，并用4%的戊二醛固定20分钟。对于HeLa细胞，纳米系统的最终浓度为175 μM，其中gH-EPA的最终浓度为10 μM。对于MSTO-211H细胞，EPA-gH-TP-PEM系统的最终浓度为100 μM，其中6%的gH-EPA肽被罗丹明B标记。细胞核使用Hoechst染色。免疫荧光分析使用Zeiss confocal microscope LSM900 Airyscan 2进行，图像分析使用Zen软件。

2.16. 抑制活性代谢途径
通过用40 μM的叠氮化钠（NaN?）处理HeLa细胞来评估活性代谢途径的抑制效果，提前30分钟加入培养基中。随后在整个样品孵育期间（3小时）保持相同的NaN?浓度。测试的样品包括：(i) EPA-gH-Dox系统（350 μM），通过内在的多柔比星荧光监测；(ii) EPA-gH（350 μM），通过gH-Rho标记的肽信号评估。所有配方与对照培养基按1:1比例稀释。对于每种配方，设置两种实验条件：细胞先预处理30分钟与NaN?（40 μM），然后去除培养基并在含有NaN?（40 μM）的情况下孵育3小时；细胞在不含NaN?的情况下孵育作为对照。抗体和Western Blotting实验

所使用的初级抗体包括：MMP9（N端）多克隆抗体（1:1000，#10375–2-AP，Proteintech），抗EGF受体（D38B1）XP?兔单克隆抗体（1:1000，#4267，Cell Signaling Technology），β-actin抗体（1:1000，#sc-47,778，Santa Cruz Biotechnology）以及次级抗体小鼠抗兔IgG-HRP（1:5000，#sc-2357，Santa Cruz Biotechnology）和m-IgGκ BP-HRP（1:5000，#sc-516,102，Santa Cruz Biotechnology）。总蛋白提取是通过在4°C下使用含有50 mM HEPES（pH 7.5）、1% Triton X-100、150 mM NaCl和5 mM EGTA的缓冲液裂解细胞，并添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（Roche Applied Science，Penzberg，德国）来完成的。细胞裂解液在4°C下以13,000 ×g的速度离心20分钟后澄清。在加入初级抗体之前，膜在室温下用5%牛奶和1× TBS-T（Tris缓冲盐水含0.1% Tween-20）封闭1小时。初级抗体在4°C下轻轻振荡孵育过夜，然后三次用1× TBS-T清洗10分钟。次级抗体在室温下孵育1小时，再依次用1× TBS-T清洗三次。为了可视化，硝酸纤维素膜与Thermo Scientific Pierce ECL Western Blotting底物孵育5分钟。化学发光信号由Invitrogen iBright Imaging Systems 1500捕获。Western blot分析使用上述抗体进行，以β-actin作为蛋白质加载对照。

2.17. γ-H2AX组蛋白磷酸化免疫荧光分析

HeLa细胞培养在玻璃盖玻片上，并用4%甲醛固定。固定后，用0.2% Triton X-100渗透细胞。室温下用1% BSA封闭10分钟。随后在37°C下用以下初级抗体孵育1小时：γ-H2AX S-139（1:200，ab2893，Abcam）。清洗后，在37°C下用次级抗体AlexaFluor 647驴抗兔IgG（H+L）孵育45分钟。最后，使用ProLong? Gold Antifade Mountant和hoechst将细胞固定在玻璃载玻片上（ThermoFisher Scientific）。图像使用配有63×/1.4油镜的Zeiss LSM 900 AiryScan2显微镜获取，并用Zen软件进行分析。

2.18. 细胞活力检测

HeLa细胞以每孔1500个细胞的密度接种到96孔板中，静置24小时。接着，用指定浓度的药物处理细胞，并再孵育48或72小时。处理期结束后，用50% v/v三氯乙酸固定细胞，并用0.4% w/v磺罗丹明B（SRB）在1% v/v醋酸中染色。细胞活力相对于未处理对照组（设为100%）进行量化。

MSTO-211H和MET-5A以每孔3000个细胞的密度接种到96孔板中，并用指定浓度的药物处理。经过48和72小时的孵育后，按照HeLa细胞的方法，通过基于SRB染色的比色法评估细胞活力。

2.19. 体外生物相容性筛选

通过结合细胞活力评估和细胞计数来研究纳米系统的生物相容性（Ferraro等人，2021年）。细胞存活指数是通过MTT测定和自动细胞计数得出的百分比值的算术平均值。HaCaT细胞以每孔10^4个细胞的密度接种到96孔培养板中，生长24小时。然后更换新鲜培养基，并用Dox（10和20 μM）、EPA-gH-Dox（150和300 μM）、EPA（150和300 μM）处理细胞48和72小时。通过MTT测定（Sigma）评估存活率，该方法基于活线粒体的氧化还原能力将溶解的MTT转化为不溶性的紫色甲酚兰。处理后，去除培养基，将20 μL/well的MTT溶液（5 mg/mL）加入细胞中，在37°C的5% CO2湿润培养箱中孵育1小时。通过加入100 μL/well的DMSO溶解形成的甲酚兰，然后使用微孔板读数器（ThermoFisher）在550 nm处监测吸光度。细胞计数由TC20自动细胞计数器（Bio-Rad）完成，该计数器使用特异性染料（Trypan Blue）一步法提供准确且可重复的总细胞计数和存活/死亡比率。在96孔培养板处理后，去除培养基并收获细胞。将10微升细胞悬浮液与0.4% Trypan Blue溶液按1:1比例混合，加载到一次性载玻片室中。结果表示为总细胞计数（每毫升细胞数）。如果检测到trypan blue，仪器还会考虑稀释度并显示活细胞计数和存活百分比。使用GraphPad Prism 8.0曲线拟合程序获得浓度效应曲线，并表示为平均值±SEM（n = 30）。

2.20. 细胞荧光分析

HeLa细胞按图1中的描述进行处理。1×10^6个细胞在室温下用4%甲醛固定20分钟，直至进行细胞荧光分析。在FACS分析之前，细胞用1× PBS清洗三次。

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图1. 本研究中使用的肽的示意图以及EPA-NPs的组装过程，EPA各部分的疏水相互作用促进了基于肽的部分在表面的暴露。该图用BioRender创建。

2.21. 统计分析

使用GraphPad Prism软件（Mac版本9）进行统计分析。两组之间的差异使用Student's t检验进行评估，p<0.05被认为具有统计学意义。独立重复次数和p值在图例中报告。多组之间的差异使用ANOVA统计后验进行评估。

3. 结果与讨论

3.1. 基于EPA的纳米粒子设计及肽序列的合成

我们设计并制备了结构明确的EPA-NPs，使用了含有不同生物官能团的EPA和基于EPA的肽混合物（表1），这些官能团旨在位于纳米粒子的表面。因此，EPA提供了纳米粒子组装的疏水驱动力，使基于肽的部分能够暴露在表面。在我们的组装设计中，纳米粒子表面装饰有不同的肽基序，以优化细胞摄取并增强EPA-NPs的功能性（图1）。EPA-NPs的配方采用了理性设计方法，以实现精确的自组装、最佳的药物负载和靶向递送。EPA的两亲性质确保了其通过自聚集过程掺入纳米粒子中，但每个基序在EPA-NPs表面的共价结合比例经过系统优化，以平衡纳米粒子的稳定性、大小和表面性质，同时保持治疗效果，如下一段所述。从选择EPA到药物-肽的共价结合以及组分比例的优化，每一个步骤都经过精心设计，以结合结构稳定性和可控的、位点特异性的治疗效果。

为了有效地将EPA-NPs输送穿过细胞膜屏障，必须选择合适的载体。为此，我们使用固相方法将能够穿透细胞的肽gH625（序列：HGLASTLTRWAHYNALIRAF）与EPA结合。我们的研究小组广泛研究了gH625肽，发现它能增强细胞膜渗透性并穿过血脑屏障，通过诱导临时脂质膜重排，使其在药物递送应用中非常有用（Del Genio等人，2022a；Bellavita等人，2024；Del Genio等人，2022b；Falanga等人，2018；Guarnieri等人，2015；Galdiero等人，2015）。我们还结合了一个靶向序列falGea，该序列能够识别过度表达的表皮生长因子受体及其变异体EGFR和EGFRvIII（Gan等人，2013；Mansour等人，2022）。gH625和falGea肽都通过Gly-Gly-Gly连接子与EPA-NPs结合，而C端赖氨酸残基用于EPA-NPs的形成。所有肽都通过EPA结合，这对于驱动EPA-NPs的形成至关重要。

药物负载（DLC）可以直接从我们的校准线（补充材料图S10）中读取。特别是，我们获得了多柔比星（Dox）的DLC为13.42%，培美曲塞（Pemetrexed）为8.83%。

为了通过共聚焦显微镜研究细胞内化，gH625的N端还用罗丹明B（Rho）标记。我们使用了两种药物Dox和PEM；Dox作为荧光模型药物，用于促进纳米粒子的摄取和细胞内分布研究以及HeLa细胞的初步细胞毒性评估，而PEM因其在中皮瘤治疗中的临床相关性而被选中。在两种构建体（Dox-EPA和PEM-EPA）中，药物通过一个由赖氨酸残基和三甘氨酸间隔区组成的结构化连接子与EPA结合，以及MMP-9可切割肽序列“PLGSYL”（图1）。这种模块化设计使药物能够在肿瘤微环境中选择性释放，其中MMP-9在多种分子癌症亚型中过度表达。肽连接子在酸性条件下稳定；实际上，它是使用固相协议合成的，并在95%三氟乙酸处理过程中被切割。然后在溶液中将药物共价连接，所得化合物在酸性条件下通过HPLC纯化。我们还合成了不含蛋白酶切割序列的含Dox肽（Dox-EPA-NC），并将其作为实验对照，因为它不会在细胞内释放药物。包括MMP-9识别序列，结合酸稳定性，确保药物主要在病理部位释放，从而提高治疗效果并减少全身副作用。

关于合成，每种肽（表1）都是在固相上使用Fmoc/tBu策略合成的。首先添加Fmoc-Lys(Mtt)-OH作为第一个氨基酸，在肽组装完成后参与EPA侧链氨基的连接。合成完成后，每种肽从固相支持物上切割下来，脱保护并通过制备HPLC纯化，并通过电喷雾离子ization（补充材料图S2-S8）进行表征。Dox的结合是在溶液中通过纯肽的半胱氨酸侧链上的游离巯基与Dox-EMCH上的马来酰亚胺基团之间进行的。反应通过NMR光谱（补充材料图S9, 面板A）确认。Dox-EPA-NC的一维NMR质子谱显示了Dox和肽部分的共振峰。Gly和Lys的酰胺NH基团的存在通过TOCSY光谱识别，其中出现了它们的自旋系统的交叉峰。通过二维光谱分析确定了化学位移。为了估计肽与Dox的功能化程度，比较了属于每个部分的明确信号的积分。选择了Dox的4.08 ppm（4 OCH3，13C 57.0 ppm）和肽的2.01 ppm（COCH3，13C 20.7 ppm）的积分。比较结果显示Dox过量约1.4倍。关于Dox-EPA，NMR谱显示了Dox的清晰信号和少量肽部分的微弱信号，支持了Dox与肽的结合。峰数的差异可能与肽部分与长不饱和脂肪酸的结合程度较差有关。

PEM的结合是在固相上进行的。首先，PEM中的两个羧酸基团被保护为二甲酯（PEM(OMe)?），然后使用特定偶联试剂将其添加到谷氨酸的侧链上。沉淀和纯化后，通过NMR光谱确认了结合。PEM(OMe)?-EPA的1D 1H NMR谱显示了肽和PEM部分的共振峰，后者更为强烈。 peptide的官能化程度通过比较选定的信号积分来估计：PEM（两个质子，积分1.00）在7.25 ppm，肽中的亮氨酸甲基团（六个质子，积分0.48）在0.84 ppm。此外，去除二甲酯后通过1D 1H NMR分析确认了PEM-EPA的鉴定（补充材料图S9面板B）。

3.2. Dox结合的细胞内化机制研究

3.2.1. Dox-EPA-NPs的构建和表征

我们最初致力于寻找获得适合治疗应用尺寸的EPA纳米粒子的最佳策略。由于EPA（鱼精蛋白）的聚集作用，EPA-NPs（EPA纳米颗粒）的大小可能会发生显著变化。我们评估了多种方法，在早期的尝试中，使用标准自组装程序（Lombardi等人，2019年）制备的EPA-NPs尺寸过大（>400纳米，见补充材料表S1）。因此，我们采用了纳米乳液-溶剂蒸发（NSE）方法（Gomaa等人，2022年），这是一种用于制备药物传递系统的成熟技术（图2，面板A）。在这种方法中，含有脂质相的有机溶剂被乳化到水相中，形成纳米级液滴，然后在室温下减压蒸发出有机溶剂，从而得到稳定的纳米颗粒。该方法能够精确控制颗粒大小并提高溶解度。利用这种方法，我们成功制备了浓度高达5000微米的EPA-NPs（补充材料表S1）。

为了测量10微米到5000微米浓度范围内EPA-NPs的尺寸，我们使用了动态光散射（DLS）技术（结果见补充材料表S2）。我们的结果表明，即使在较高浓度下，采用该协议制备的EPA-NPs尺寸也保持稳定。此外，我们还分析了储存过程中EPA-NPs尺寸的变化，发现仅在30天后尺寸略有减小，多分散指数（PdI）有所增加，这表明其结构完整性和尺寸分布一致性得以保持。EPA-NPs表面的gH625和Dox的存在可能会影响其聚集行为并导致颗粒性质的变化，为此我们使用NSE方法制备了装饰有gH625和Dox的EPA-NPs，并测量了它们的尺寸。

下一步是制备同时含有gH625和Dox的EPA-gH-Dox配方。我们选择了6%的Dox-EPA-NC或Dox-EPA比例，因为这种配方能最佳地防止系统过度聚集。较高比例的肽会导致颗粒聚集增加，而6%的配方则能维持更好的胶体稳定性。这一选择得到了初步共聚焦显微镜观察的支持，结果显示在最高浓度下确实出现了过度聚集现象（补充材料图S11）。EPA-gH-Dox配方包含了EPA、gH625和Dox-EPA，比例分别为9.1:0.3:0.6。为了评估按需释药策略的有效性，我们还制备了EPA-gH-Dox-NC作为细胞实验的对照。

在EPA-gH-Dox配方中添加Dox后，颗粒尺寸保持不变（表2）。扫描电子显微镜（SEM）观察到EPA-gH-Dox的颗粒直径为197纳米，而EPA-gH-Dox-NC的颗粒直径为140纳米，多分散指数（PdI）为0.19±0.01。通过DLS测量，两种配方的平均直径均在120至180纳米之间（图2，面板BC），与表2中的数据一致。EPA-gH-Dox-NC的颗粒直径稍大，这可能是由于其配方更加紧密，使得MMP-9序列更易暴露在水中。

为了确定系统发生聚集的浓度，我们使用尼罗红（NR）作为荧光探针，测量了0.5微米到30微米浓度范围内的临界聚集浓度（CAC）。当纳米颗粒加入NR溶液中时，NR的荧光光谱出现蓝移，表明染料转移到了更疏水的环境中（即聚集体中）。测量结果经过Boltzmann方程拟合得到CAC值为4.58±0.23微米（图2，面板D）。gH625在EPA-NPs表面的存在对CAC没有显著影响，其CAC值为4.73±0.24微米（图2，面板E）。相比之下，gH625和Dox的加入改变了纳米颗粒的表面性质，使CAC增加到8.72±0.10微米（图2，面板F）。Zeta电位分析表明，EPA-gH和EPA-gH-Dox的表面均带有轻微的正电荷。

通过圆二色性（CD）光谱确认了gH625在EPA-NPs表面的存在（补充材料图S12）。我们之前已证明，gH625在与膜双层相互作用时会从无规卷曲构象转变为螺旋构象（Ferraro等人，2021年）。我们在磷酸盐缓冲液和20% 2,2,2-三氟乙醇（TFE）中分析了其结合到EPA-NPs上的二级结构，TFE降低了溶液极性，有助于稳定二级结构。在水中，gH625结合的EPA-NPs会发生聚集，但在20% TFE中则呈现α-螺旋构象，这对膜相互作用和内化过程至关重要。

我们评估了完全配制的EPA-gH-Dox在350微米浓度下的稳定性，该浓度用于生物实验。EPA-gH-Dox在+4°C下储存长达30天，颗粒直径保持在150至200纳米范围内，储存期间没有显著变化（表4）。还评估了EPA-NPs在不同环境条件下的稳定性，包括稀释、离子强度和pH值（补充材料图S13）。我们使用DLS监测了这些参数对颗粒尺寸的影响。无论在何种条件下，EPA-NPs的尺寸均无显著变化，支持了它们在外部变化下保持稳定的假设。

此外，还评估了EPA-gH-Dox在胎牛血清中的稳定性。DLS测量显示，48小时后颗粒尺寸仅有轻微增加；但在72小时时系统变得不稳定，出现了大约39±2纳米的颗粒尺寸和1.00的多分散指数（表5）。

通过共聚焦荧光显微镜研究了EPA-gH在HeLa细胞中的细胞摄取情况。我们使用罗丹明B标记的gH-EPA肽进行实验，EPA-NPs的浓度为350微米，加入20微米的Rho-gH-EPA后稀释至175微米。培养1小时后，细胞被固定并成像。结果显示EPA-NPs分布在细胞质、核周和核区域。

我们还研究了Rho-gH-EPA和EPA-gH-Dox在HeLa细胞中的摄取机制。先前研究表明，gH625主要通过跨膜转运机制促进纳米系统的内化（Bellavita等人，2024年）。HeLa细胞先在37°C下用NaN3处理30分钟，随后与EPA-gH-Dox共孵育3小时。通过Fiji软件进行了Dox的定量分析，结果显示钠叠氮化物（NaN3）对Rho-gH-EPA和EPA-gH-Dox的内化过程影响不大，表明活性途径在其内化中起部分作用。

最后，通过紫外-可见光谱（UV-Vis）研究了EPA-gH-Dox和EPA-gH-Dox的Dox释放情况。在EPA-NPs与MMP-9共孵育30、60和120分钟后，测量了Dox的释放情况。该酶能识别PLGSYL序列并切割Gly和Ser氨基酸之间的键。结果显示，EPA-gH-Dox在60分钟后释放了约50±2%的Dox，在120分钟后释放了约80±2%的Dox；而EPA-gH-Dox-NC则没有释放Dox。Western blot分析证实了MMP-9在HeLa细胞中的表达。在确认MMP-9存在后，我们评估了EPA-gH-Dox-NC和EPA-gH-Dox在体外释放多柔比星（Dox）的情况。下载：下载高分辨率图像（269KB）下载：下载全尺寸图像 图5.A) 在HeLa细胞中通过Western blotting分析MMP-9的表达。B) 共聚焦显微镜图像（B组）显示在不可切割系统中没有多柔比星的释放，而在可切割序列存在的系统中检测到了药物的释放（EPA-gH-Dox）。C) 通过共聚焦显微镜和Fiji软件对多柔比星信号进行定量分析。我们监测了每种条件下的30个细胞，来自三个独立实验，并报告了标准差（SD）。**** p<0.001。统计分析使用Welch校正的学生t检验进行，以减少分析样本中异方差性引起的失真。D) 在含有或不含有MMP9切割序列的情况下，通过流式细胞术（flow cytometry）分析HeLa细胞中的多柔比星信号。这里我们报告了三个独立实验中的一个。在没有MMP9切割连接子的情况下（EPA-gH-Dox-NC），与EPA-gH-Dox相比，多柔比星的信号强度降低，这一点也通过共聚焦显微镜和流式细胞术的定量分析得到了证实（图5，B组）。相比之下，切割序列的存在允许多柔比星的释放，使其能够自由地定位到细胞核中（图5，B组）。这表明多柔比星的释放是有效的，由MMP9切割序列介导的，而不可切割系统则将药物保留在纳米粒子（NP）上，导致信号较低。此外，如图5D所示，流式细胞术分析进一步证实了这些发现，显示EPA-gH-Dox的多柔比星阳性细胞比例显著高于EPA-gH-Dox-NC（约71% vs 约2.5%）。为了评估载体EPA和EPA-gH对持续表达MMP-9的健康细胞的影响，我们在48小时和72小时时测量了HaCaT细胞的存活指数。如图6（A-B组）所示，即使在最高测试浓度（300 mM）下，载体也没有降低细胞的活力。随后，我们比较了EPA-gH-Dox与自由状态下的多柔比星在48小时和72小时对HaCaT细胞的活性，以确认在持续表达MMP-9的细胞中多柔比星没有显著释放。如图6（C-D组）所示，自由状态下的多柔比星在48小时时就表现出明显的毒性，而EPA-gH-Dox则没有影响细胞活力。在72小时时，自由状态下的多柔比星毒性增加，而EPA-gH-Dox在150 μM浓度下仍然无毒；只有在300 μM的EPA-gH-Dox浓度下才观察到轻微的毒性。这些发现支持EPA-NPs被健康细胞良好耐受的观点，这可能是由于细胞内的MMP-9水平较低，限制了多柔比星的释放。下载：下载高分辨率图像（229KB）下载：下载全尺寸图像 图6.A, B) 分别在48小时（A）和72小时（B）时，EPA单独使用和EPA-gH配方对HaCaT细胞的存活情况。C, D) 分别在48小时（C）和72小时（D）时，EPA-gH-Dox配方和自由状态下的多柔比星对HaCaT细胞的存活情况。为了进一步确认多柔比素在HeLa细胞中的内化和细胞内释放，我们使用针对γ-H2AX的免疫荧光检测来评估DNA损伤，γ-H2AX是由ATM介导的组氨酸H2AX在第139位丝氨酸上的磷酸化引起的基因毒性应激的标志物。细胞用EPA-gH-Dox及其对照EPA-gH-Dox-NC（缺乏MMP-9切割序列）进行处理，两者都含有3%的gH625（5.25 μM）和6%的多柔比星（10.5 μM），并以自由状态下的多柔比星作为对照。经过3小时的孵育，足以进行MMP-9介导的切割和药物释放后，使用特异性抗体检测到γ-H2AX焦点，作为多柔比星活性引起的DNA损伤的指标（图7）。下载：下载高分辨率图像（312KB）下载：下载全尺寸图像 图7. 共聚焦显微镜图像显示用自由多柔比素、EPA-gH-Dox-NC和EPA-gH-Dox处理的HeLa细胞。细胞核用Hoechst染成蓝色，组蛋白磷酸化显示为红色，多柔比素荧光显示为黄色。最右侧的列显示了三个通道的合并图像。（关于图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）在用EPA-gH-Dox-NC处理的细胞中，多柔比素在细胞核中的定位不易检测到。尽管如此，由于部分EPA-NP的解体导致多柔比素释放受限，仍有一些红色的γ-H2AX焦点，表明存在DNA损伤。相比之下，EPA-gH-Dox显示出多柔比素的明显细胞核定位和更广泛的DNA损伤。这归因于MMP-9的过表达及其随后导致的多柔比素释放。与自由状态下的多柔比素相比，观察到的DNA损伤较轻，反映了受控的、渐进式的释放过程。这一过程依赖于通过gH625的初始EPA-NP内化，随后是酶触发的多柔比素释放。多柔比素的释放导致了组蛋白损伤，表现为红色的γ-H2AX焦点（图7）。然而，组蛋白磷酸化的程度低于自由状态下的多柔比素，反映了从EPA-NPs中逐渐释放的过程。在这个系统中，多柔比素主要位于细胞核中，但也注意到了一些细胞质中的存在，特别是在膜附近，表明药物释放过程仍在进行中。此外，紫外/可见光研究也表明，与预激活的MMP-9一起孵育的系统在2小时后大约释放了80%的药物，表明多柔比素尚未完全释放，并且是逐步释放的（如表5中所报告的）。3.2.5. 细胞增殖实验此外，还在用EPA-gH和EPA-gH-Dox处理48小时和72小时的HeLa细胞上进一步研究了多柔比素的释放及其细胞毒性效应。所有处理在48小时时就显示出与对照组相比细胞增殖的显著减少。EPA-gH在48小时和72小时也表现出一定的毒性，表明所开发的递送平台在癌症应用方面具有潜力（Tsugane, 2021）。与相同多柔比素浓度的EPA-gH单独使用相比，EPA-gH-Dox系统在1、2、3、4和6 μM的多柔比素浓度下表现出更显著的细胞活力降低，证实了释放药物的细胞毒性效应。在6 μM和72小时时，EPA-gH-Dox处理后的细胞活力约为40%，而自由状态下的多柔比素将活力降低到约10%（图8）。下载：下载高分辨率图像（117KB）下载：下载全尺寸图像 图8.A,B) 在48小时（A）和72小时（B）时，用EPA-gH和EPA-gH-Dox处理的HeLa细胞的细胞毒性分析。图表代表3个独立实验的平均值±标准差。统计分析使用单因素重复测量ANOVA进行，所有组与对照组进行比较，显著差异用以下符号表示：*P值<0.05，***P值<0.01，**P值<0.01。3.3. 为间皮瘤定制的装饰有PEM的EPA-NPs 3.3.1. 装饰有PEM的EPA-NPs（EPA-gH-TP-PEM）的生物物理特性在模型细胞系统（HeLa细胞）中成功验证后，该纳米系统随后在间皮瘤（一种治疗选择有限的高度侵袭性癌症）中进行了概念验证。为此，我们专门为间皮瘤治疗配制并表征了EPA-gH-TP-PEM配方，其中包含了靶向肽falGea（TP）。进行了生物物理特性表征，包括优化纳米颗粒组成和评估关键物理化学性质，如大小、粒子密度（PdI）和表面电荷，以确保其在间皮瘤模型中的稳定性和适用性。为了进一步改进我们的先前配方，我们通过以9.09:0.3:0.6:0.0的摩尔比例整合膜活性肽gH625、靶向肽falGea和化疗药物PEM来工程化EPA-gH-TP-PEM。使用共聚焦显微镜测试含有3%、6%和9%肽的配方，以评估gH625的最佳量（图9）。图像分析显示6%的gH625在细胞可视化和防止纳米颗粒聚集之间提供了最佳平衡。下载：下载高分辨率图像（95KB）下载：下载全尺寸图像 图9. 含有3%、6%和9% EPA-gH的纳米颗粒处理的细胞的共聚焦显微镜图像。基于先前的发现，6%也被确定为增强细胞内化的最佳浓度（Bellavita等人，2025）。最后，通过评估其半数抑制浓度（IC50）来确定PEM的有效浓度，发现其为50 nM。EPA-gH-TP-PEM的粒径为228±7 nm，PdI为0.16±0.03（表7）。使用SEM进一步评估了形态和大小，显示平均直径在220至270 nm之间（图10），与DLS数据一致。表7. 通过DLS分析的不同配方的特性。配方 脂质和肽比例 浓度（mM） 直径（nm）PdI EPA-gHEPA: gH-EPA = 9.4:0.6 234±30.37±0.10 EPA-gH-TPEPA: gH-EPA: falGea-EPA = 9.1:0.6:0.3 250±190.18±0.01 EPA-gH-TP-PEMEPA: gH-EPA: falGea-EPA: PEM-EPA = 9.09: 0.3: 0.6:0.01 250±228±0.03 下载：下载高分辨率图像（87KB）下载：下载全尺寸图像 图10.A,B) 25000倍放大（A，比例尺=1 μm）和80,000倍放大（B，比例尺=500 nm）的EPA-gH-TP-PEM的SEM图像。所有配方的CAC测量进行了三次重复。EPA-gH的CAC为4.10±0.10 μM（图11，A组），而添加靶向肽（TP）后纳米颗粒变小，CAC降至2.70±0.10 μM（图11，B组）。此外，随后添加药物并没有改变CAC。值得注意的是，这些结果突显了表面复杂性对聚集行为的影响。下载：下载高分辨率图像（181KB）下载：下载全尺寸图像 图11.A,B,C) EPA-gH（A）、EPA-gH-TP（B）和EPA-gH-TP-PEM（C）的CAC，以尼罗红的最大荧光发射波长为函数绘制，并使用Sigmoidal Boltzmann方程进行拟合（OriginPro图形程序）。我们还确定了所得EPA-NPs的ζ电位，发现所有配方的ζ电位都略微为正（表8）。这一特性有助于限制过度聚集，同时减少通常与高正表面电荷相关的毒性风险。实际上，所得的EPA-NPs在尺寸和表面电荷方面都定义明确，使其适用于治疗应用。表8. 每种配方的临界聚集浓度（CAC）值。配方 脂质和肽比例 CAC（μM） ζ电位（mV） EPA-gH 9.4:0.6 4.10±0.11 + 5.9±0.6 EPA-gH-TP 9.1:0.6:0.3 2.70±0.12 + 6.9±0.2 EPA-gH-TP-PEM 9.09: 0.30:0.6 0:0.01 2.70±0.13 + 3.6±0.1 在用于间皮瘤模型系统的生物试验的 stock溶液浓度250 μM下评估了稳定性。EPA-gH-TP-PEM显示出稳定性，尽管在72小时时观察到稳定性下降，如颗粒大小的变化所示（补充材料图S14）。重要的是，这些发现表明当前配方适用于短期生物研究，但需要进一步优化以满足体内长期循环的稳定性要求。此外，还使用DLS评估了稀释、离子强度和pH对EPA-NPs大小的影响。为了评估稀释效应，最初将EPA-NPs制备为250 μM浓度，然后进行稀释。通过添加1至5 mM的NaCl来测试离子强度稳定性，并在pH 3、7和10的值下评估pH稳定性。在所有测试条件下，均未观察到EPA-NPs大小的显著变化，表明纳米颗粒保持稳定，没有因这些外部刺激而解聚（补充材料图S15）。3.3.2. EPA-PEM的摄取和细胞增殖实验还使用共聚焦荧光显微镜评估了用EPA-gH和EPA-gH-Dox处理48小时和72小时的HeLa细胞的多柔比素释放及其细胞毒性效应。所有处理在48小时时就显示出与对照组相比细胞增殖的显著减少。此外，EPA-gH在48小时和72小时也表现出一定的毒性，表明所开发的递送平台在癌症应用方面具有潜力（Tsugane, 2021）。在1、2、3和6 μM的多柔比素浓度下，EPA-gH-Dox系统显示出比EPA-gH单独使用更大的细胞活力降低，证实了释放药物的细胞毒性效应。在6 μM和72小时时，EPA-gH-Dox处理后的细胞活力约为40%，而自由状态下的多柔比素将活力降低到约10%（图8）。下载：下载高分辨率图像（117KB）下载：下载全尺寸图像 图8.A,B) 在48小时（A）和72小时（B）时，用EPA-gH和EPA-gH-Dox处理的HeLa细胞的细胞毒性分析。图表表示3个独立实验的平均值±标准差。统计分析使用单因素重复测量ANOVA进行，所有组与对照组进行比较，显著差异用以下符号表示：*P值<0.05，***P值<0.01，**P值<0.01。3.3. 为间皮瘤定制的装饰有PEM的EPA-NPs 3.3.1. 装饰有PEM的EPA-NPs（EPA-gH-TP-PEM）的生物物理特性在模型细胞系统（HeLa细胞）中成功验证后，该纳米系统随后在间皮瘤中进行了概念验证，间皮瘤是一种治疗选择有限的高度侵袭性癌症。为此，我们配制并表征了专门为间皮瘤治疗设计的EPA-gH-TP-PEM配方，其中加入了靶向肽falGea（TP）。进行了生物物理特性表征，包括优化纳米颗粒组成和评估关键物理化学性质，如大小、粒子密度（PdI）和表面电荷，以确保其在间皮瘤模型中的稳定性和适用性。为了进一步改进我们的先前配方，我们通过整合膜活性肽gH625、靶向肽falGea和化疗药物PEM，以9.09:0.3:0.6:0.01的摩尔比例进行了工程化。使用共聚焦显微镜评估了3%、6%和9%肽的配方，发现6%的gH625在细胞可视化和防止纳米颗粒聚集之间提供了最佳平衡。下载：下载高分辨率图像（95KB）下载：下载全尺寸图像 图9. 含有3%、6%和9% EPA-gH的纳米颗粒处理的细胞的共聚焦显微镜图像。基于先前的发现，6%也被确定为增强细胞内化的最佳浓度（Bellavita等人，2025）。最后，通过评估其半数抑制浓度（IC50）确定了PEM的有效浓度，发现其为50 nM。EPA-gH-TP-PEM的粒径为228±7 nm，PdI为0.16±0.03（表7）。使用SEM进一步评估了形态和大小，显示平均直径在220至270 nm之间（图10），与DLS数据一致。表7. 通过DLS分析的不同配方的特性。配方 脂质和肽比例 浓度（mM） 直径（nm）PdI EPA-gHEPA: gH-EPA = 9.4:0.6 234±30.37±0.10 EPA-gH-TPEPA: gH-EPA: falGea-EPA = 9.1:0.6:0.3 250±190.18±0.01 EPA-gH-TP-PEMEPA: gH-EPA: falGea-EPA: PEM-EPA = 9.09: 0.3: 0.6:0.01 250±228±0.03 下载：下载高分辨率图像（87KB）下载：下载全尺寸图像 图10.A,B) 25000倍放大（A，刻度尺=1 μm）和80,000倍放大（B，刻度尺=500 nm）的EPA-gH-TP-PEM的SEM图像。所有配方的CAC测量进行了三次重复。EPA-gH的CAC为4.10±0.10 μM（图11，A组），而添加靶向肽（TP）后纳米颗粒变小，CAC降至2.70±0.10 μM（图11，B组）。此外，随后添加药物并没有改变CAC。值得注意的是，这些结果突显了表面复杂性对聚集行为的影响。下载：这些发现突显了该纳米系统的选择性细胞毒性，证明了其在健康细胞中的安全性，同时也表明载体本身对恶性细胞具有抗癌作用。这一结果尤为重要，因为EPA-NPs被设计为仅对癌细胞具有选择性，并且在药物未释放到癌细胞时也仍然有效。随后，我们进行了Western blot分析，以确认MET-5A和MSTO-211H细胞系中的MMP-9和EGFR表达情况。正如预期的那样，与MET-5A相比，MSTO-211H肿瘤细胞系中EGFR和MMP-9的表达量较高（图14，A-B panels）。为了建立细胞毒性谱，我们用EPA-gH-TP-PEM和游离PEM处理了MET-5A和MSTO-211H细胞。所有处理方法在48小时时都显示出显著的细胞增殖减少效果。在缺乏EGFR和MMP-9过表达的细胞系中，EPA-gH-TP-PEM并未显著降低细胞活力，这表明在没有MMP-9介导的切割情况下，药物的释放有限；而在MSTO-211H细胞系中，EPA-gH-TP-PEM在50 nM浓度下处理72小时后，细胞活力降低到了大约60-70%。相反，在MSTO-211H细胞系中，EPA-gH-TP-PEM的细胞毒性与游离药物相当，50 nM浓度下细胞活力减少了约50-60%。

结论：开发生物相容性载体材料对于提高药物递送效果至关重要。在肿瘤学领域，开发具有预定特性的纳米颗粒是一种令人有望的新策略，可以实现抗癌药物的控制性和靶向递送，从而提高疗效并减少副作用。本研究旨在使用EPA作为结构成分来开发生物相容性的EPA-NPs。虽然之前的研究已经证明了欧米伽-3脂肪酸与多西他赛（Dox）等药物的协同作用，但本研究首次报道了一种完全由EPA组成的纳米载体，从而最大限度地减少了与载体相关的潜在全身毒性。EPA主要存在于富含脂肪的鱼类中，在减少炎症、支持心血管健康和心理健康方面发挥着关键作用。通常与纳米载体相关的毒性问题往往与合成材料或不可生物降解材料、赋形剂的积累或化学修饰的脂质有关。相比之下，EPA是一种天然存在的欧米伽-3脂肪酸，具有确立的安全性特征，并可以通过内源性脂质途径迅速代谢。因此，使用未结合的EPA作为唯一结构成分预计可以减少长期积累并降低载体相关毒性的风险。未来的体内研究将系统地评估其生物分布、清除率及安全性，以进一步验证这些假设。我们的结果表明，所开发的EPA-NPs保持了出色的生物相容性，这一点通过HaCaT细胞的细胞毒性研究得到了证实：多西他赛对健康细胞具有毒性，而我们开发的EPA-NPs与多西他赛结合后（EPA-gH-Dox）在用于抗癌活性的浓度下72小时内未显示出任何毒性。此外，制备的EPA-NPs在体外抑制HeLa细胞活力方面与游离多西他赛具有相似的效果；实际上，我们的EPA-NPs之所以有效，是因为药物可以按需释放，因此不会引起任何全身毒性。事实上，对照组化合物中多西他赛通过共价键连接到EPA-NPs表面（而没有蛋白酶切割序列），在HaCaT和HeLa细胞中均未显示出任何毒性，这表明EPA-gH-Dox仅在过表达MMP-9的癌细胞中起作用，而在仅 constitutively 表达MMP-9的健康细胞中则没有作用。此外，多西他赛的释放导致了组蛋白损伤，但其程度低于游离多西他赛，反映了EPA-NPs中的药物释放是逐步且可控的。

为了将这些初步结果扩展到更具有临床相关性和疾病特异性的环境，我们随后使用了间皮瘤细胞来评估我们的EPA-NPs。具体来说，我们使用了非肿瘤性间皮细胞系（MET-5A）和双相间皮瘤细胞系（MSTO-211H）来评估其差异性反应。结果证实，EPA-gH-TP对健康间皮细胞无毒，但对癌细胞表现出细胞毒性。重要的是，当装载化疗药物（PEM）时，EPA-NPs的效果与游离药物相当。此外，含有gH625肽的配方促进了EPA-NPs从内吞囊泡中的转运和释放（图15），使得PEM能够按需释放，这归因于肿瘤微环境中过表达的MMP-9的酶活性。这种酶响应行为支持了我们纳米系统的靶向和可控药物释放能力。鉴于间皮瘤的侵袭性进展以及有效治疗方法的稀缺，这种方法展示了我们纳米系统的多功能性和转化潜力。

另外，EPA本身具有抗癌活性，同时还能降低对健康细胞的毒性，从而提供了一种更有效且更安全的治疗方式。总之，研究结果表明了体外细胞相容性、酶响应的药物释放和抗癌活性。然而，需要注意的是，这些在2D模型中进行的研究是初步的且存在固有的局限性，因为它们无法完全模拟肿瘤微环境的复杂性。下一步将在更复杂的3D系统中进行验证，并进行后续的体内研究，以评估药代动力学、生物分布、肿瘤靶向性和整体治疗效果，以及解决与血清稳定性相关的问题。