根瘤菌接种通过优化黄淮海平原大豆的根系和叶片特征来提高其产量

《Food and Energy Security》：Rhizobia Inoculation Enhances Soybean Productivity Through Optimization of Root and Leaf Traits in the Huang-Huai-Hai Plain

　　**摘要**

根瘤菌接种是一种有效的策略，可以增强大豆产量，以确保粮食和饲料的安全。然而，在黄淮海平原（一个主要的高质量大豆生产区），根瘤菌与氮（N）施用的协同效应及其生理机制仍不清楚。因此，进行了一项为期两年、在两个地点开展的裂区实验，主要处理是是否进行根瘤菌接种，次要处理包括七种不同的氮施用量（0、30、36、42、48、54和60公斤氮/公顷；分别表示为N0、N30、N36、N42、N48、N54和N60），以评估它们对根系和根瘤特性、SPAD值、产量构成成分、种子产量以及潜在的产量提高机制的影响。结果表明，与非接种相比，接种处理在所有氮施用量下都能提高产量，尤其是在较低氮输入量下效果更明显（从N0到N60，分别提高了37.1%、18.5%、14.3%、14.1%、9.9%、6.5%和4.9%）。同时，在接种处理下，随着氮施用量的增加，产量的增加幅度相对于非接种处理较小，这表明根瘤菌接种有可能减少对合成氮肥的依赖。此外，在氮施用量为60公斤/公顷的情况下，与不接种相比，接种处理使产量进一步增加了4.9%，净收益增加了6.8%；即使在氮施用量减少20%（N48）的情况下，产量和收益也保持了相似的水平。这可能是因为根瘤菌接种部分缓解了氮肥过量施用对根瘤数量（减少13.9%–26.7%）、根瘤重量（减少11.6%–24.0%）和固氮酶活性（减少31.6%–55.0%）的抑制作用，同时进一步增强了根系重量（增加20.1%–30.3%）、根系长度（增加16.0%–41.2%）和SPAD值（增加9.6%–18.2%）。这些变化共同促进了地上生物量的积累（增加4.5%–16.2%）和每株种子数量（增加8.0%–21.5%），这些都是决定产量的关键因素。总之，接种处理结合氮肥施用促进了根系和叶片的发育，这是产量提高的主要驱动因素。建议在氮施用量为60公斤/公顷的情况下进行根瘤菌接种以 further 提高产量；或者在氮施用量为48公斤/公顷的情况下进行接种，以在保持产量的同时减少氮肥投入和环境风险。本研究为优化该地区的绿色、高效和可持续大豆生产提供了理论支持和实证依据。

**1 引言**

大豆（Glycine max L.）是一种全球重要的作物，是食品、饲料和工业应用中植物性蛋白质和油脂的主要来源（FAOSTAT 2023）。中国是世界上最大的大豆消费国，其国内需求的80%以上依赖进口，年进口量约为1亿吨（Wang等人2023）。这种高度依赖进口的情况是由于国内生产能力不足，平均产量仅达到全球水平的60%（NBSC 2024）。因此，在耕地有限的情况下，提高大豆产量对于确保国家粮食和饲料安全至关重要。黄淮海平原（HHHP）是中国最重要的大豆生产区之一，贡献了全国总产量的近30%（Wu等人2024）。然而，该地区面临诸多挑战，包括在关键生长阶段频繁出现高温和干旱条件，导致叶片黄化等早衰症状和根系发育受阻（Du等人2024；Xu等人2021）。除了这些环境压力外，低利润也阻碍了农民投资于提高产量的投入，如氮肥和根瘤菌接种剂（Wang等人2024；Wu等人2024）。这些综合因素严重限制了HHHP的大豆产量潜力。因此，开发有效的农艺策略来应对这些限制并提高产量对于增加大豆自给率和防止粮食供应短缺至关重要。氮肥管理是影响作物产量的关键因素，合理施用氮肥在实现高产量方面起着关键作用（Sinclair和Rufty 2012）。在HHHP，大约60公斤氮/公顷的施用量被认为是大豆生产的最佳剂量（Nie等人2023；Wu等人2024；Yang等人2025；Zheng等人2024）。然而，作为一种豆科作物，大豆具有很强的生物固氮能力，可以通过与根瘤菌的共生关系满足其大部分氮需求（Ciampitti和Salvagiotti 2018）。进一步的研究表明，这一过程对外部氮的可用性非常敏感：适量的氮输入可以促进根瘤的形成和发育，而过量的氮会抑制根瘤菌感染，显著减少根瘤的数量和质量，从而影响固氮作用（Gelfand和Robertson 2015）。研究表明，根瘤菌接种可以提高感染效率，促进根瘤发育，并增强固氮能力（Mathenge等人2019）。基于这些发现，推荐氮施用量与根瘤菌接种的联合应用可能会产生协同效应，从而进一步提高大豆产量（Ke等人2023；Zhou等人2006）。然而，在HHHP进行此类综合氮管理策略的研究仍然很少。此外，目前尚不清楚根瘤菌接种是否能在减少氮肥投入的情况下维持高产量，以及可以在不降低产量的情况下减少多少氮肥施用量。因此，迫切需要开展田间试验来填补这些知识空白，从而优化区域氮肥管理策略，降低投入成本（特别是氮肥成本），并促进农业生产的生态可持续性。在关键生长阶段（如始花期R1和结荚期R3）建立强大的根系对于大豆的水分和养分吸收至关重要，直接影响生物量积累和产量潜力（Wu等人2024）。同样重要的是维持叶片功能。叶片叶绿素含量作为光合作用效率和养分状态的敏感指标，反映了植物的生长、胁迫响应和衰老情况，广泛用于评估冠层寿命和功能（Qiang等人2025）。为了缓解由干旱引起的早衰问题，已经探索了多种策略，包括优化秸秆处理方案（如播种前清除残渣并在播种后覆盖地膜（Wu等人2024）；应用垄沟塑料膜系统（Liao等人2022）；用石灰调节土壤pH值（Bossolani等人2021）；用生物炭改良土壤（Liu等人2025）；以及实施精准灌溉技术（Chen等人2025）。尽管这些方法在改善根系发育和叶片寿命方面显示出有效性，但在HHHP的应用往往受到高成本、劳动力需求或潜在副作用的限制。相比之下，根瘤菌接种提供了一种实用的替代方案，既经济高效又操作简单，同时有效促进了根系和地上部分的发育（Thilakarathna和Raizada 2017）。从肯尼亚内罗毕（Mathenge等人2019）到南非波切夫斯特鲁姆（Igiehon等人2021）和西澳大利亚Mialup（Liu等人2022）的不同环境下取得的成功应用证明了根瘤菌-氮肥联合施用的产量优势。然而，在以沙江黑土为主的低产量农田中（Yang等人2026），大豆根系和叶片对这种双养分处理的生理响应尚未得到研究。这一知识空白限制了根瘤菌接种在当地条件下的有效应用。因此，系统研究氮-根瘤菌相互作用对根系形态结构、冠层光合能力和产量形成的影响不仅有助于评估根瘤菌接种的适用性，也为抗逆和稳定的大豆生产提供理论和技术支持，最终促进HHHP地区大豆生产的绿色和可持续发展。因此，我们在HHHP南部的博州市和扶阳市两个代表性地点进行了为期两年的田间实验（2023年和2024年），包括七种不同的氮施用量（0–60公斤氮/公顷），探讨了在不同处理下根系形态特征、根瘤特性、关键生长阶段的SPAD值以及成熟期的种子产量、产量构成成分、种子质量和经济效益。实验的目的是（1）评估根瘤菌接种是否能在推荐的氮施用量下进一步提高大豆产量，并确定可以在不降低产量的情况下减少多少氮肥投入；（2）通过分析R3阶段根系和叶片的发育来阐明产量响应的生理机制。本研究的结果预计将为优化氮-根瘤菌协同管理策略提供科学依据，以在HHHP具有挑战性的农业生态条件下提高大豆产量和可持续性。

**2 材料与方法**

**2.1 研究地点**

田间实验于2023年6月在安徽省的两个地点同时进行：博州市固阳县（33°29′26″N, 116°10′04″E）和扶阳市太和县（33°12′52″N, 115°35′58″E）。这两个地点都属于黄淮海平原，具有温暖湿润的季风气候。根据中国的土壤分类系统，两个实验地点的土壤均被归类为沙江黑土（Yang等人2021）。博州地点的年平均气温为15.2°C，年平均降水量约为850.0毫米（Yang等人2025）。实验前，0–20厘米深度的土壤具有以下性质：pH值为8.2，土壤有机碳（SOC）为12.1克/千克，总氮（TN）为1.3克/千克，总磷（TP）为0.9克/千克，有效磷（Olsen-P）为17.6毫克/千克，有效钾（AK）为71.5毫克/千克。扶阳地点的年平均气温为14.9°C，年平均降水量约为800.0毫米。实验前，其表层土壤（0–20厘米）的pH值为7.7，SOC为11.3克/千克，TN为1.4克/千克，TP为0.8克/千克，Olsen-P为16.0毫克/千克，AK为86.5毫克/千克。土壤性质通过标准方法测定。简要来说，SOC通过K2Cr2O7-H2SO4氧化法测定，TN通过凯氏定氮法测定。TP通过过氯酸消化后的比色法测定。AK用1 M NH4OAc提取并通过火焰光度法测定。土壤pH值在1:2.5的土壤-水比例下使用pH计测量。这些参数是根据Bao（2000）描述的方法确定的。Olsen-P用0.5 M NaHCO3提取，并按照Olsen等人（1982）的方法测定。实验期间（2023年和2024年的6月至10月）的日平均气温和降水量见图1。

**2.2 实验设计**

田间实验采用裂区设计，共三个重复。主要处理包括两种情况：接种根瘤菌（+R）和不接种根瘤菌（?R）。根瘤菌接种剂是一种液体制剂，由安徽新西蒙生物技术有限公司生产，其中活菌数量超过2 × 10^8 CFU/mL。该制剂含有两种根瘤菌：Bradyrhizobium elkanii和Sinorhizobium fredii，这两种根瘤菌因高固氮效率和对不同土壤条件的适应性而在大豆栽培中广泛应用（Ji等人2023；Suzuki等人2014）。为了提高接种效率，根瘤菌接种剂与其配套的种子保护剂一起施用（同样由该公司生产）。播种前8–12小时，将3毫升根瘤菌制剂与2毫升种子保护剂手动混合到1千克大豆种子中。次要处理包括七种不同的氮施用量：60公斤氮/公顷（N60，推荐剂量），54公斤氮/公顷（N54，减少10%），48公斤氮/公顷（N48，减少20%），42公斤氮/公顷（N42，减少30%），36公斤氮/公顷（N36，减少40%），30公斤氮/公顷（N30，减少50%），以及0公斤氮/公顷（N0，减少100%）。每个处理区的面积为120平方米（12米×10米），之间间隔1米的走道。夏季大豆品种Wandou 37于6月中旬播种（博州：2023年6月16日和2024年6月18日；扶阳：2023年6月19日和2024年6月21日），播种密度为2.25 × 10^5株/公顷，收获时间为10月初（博州：2023年10月2日和2024年10月4日；扶阳：2023年10月5日和2024年10月7日）。所有处理都接受了相同量的P2O5（60公斤/公顷）和K2O（60公斤/公顷）作为基肥，在播种前施用。所有作物残余物在收获后均被翻入土壤中。田间管理措施，包括灌溉、耕作以及病虫害控制，均遵循当地常规做法。

**2.3 测量与计算**

**2.3.1 产量、地上生物量、收获指数和产量构成成分**

在大豆成熟期（R8），在每个处理区内选择8平方米的区域（四行，每行5米长）进行产量测量。具体来说，选定区域内的所有作物都被割到地面并放在实验室中风干至恒重。干燥后的样本被分离成种子和残渣，以便测量种子产量（kg ha?1，标准化至13%的水分含量）、地上生物量（kg ha?1，种子和残渣的总干重）以及收获指数（通过种子产量与地上生物量的比值计算得出）。植物数量（plants m?2）是通过计算四个1 m × 1 m样方内的植物数量来确定的。每个豆荚的种子数量（No. pod?1）和每株植物的种子数量（No. plant?1）是通过分别计算10株随机选取的植物每个豆荚中的种子数量以及20株随机选取的植物每株上的种子数量来评估的。每株植物的豆荚数量（No. plant?1）是通过计算25株随机选取的植物每个植物上的豆荚数量来确定的。100粒种子的重量（g）是通过称量100粒种子并重复五次实验来得出的。

2.3.2 绝对和相对产量变化
绝对（kg ha?1）和相对（%）产量变化被用来评估根瘤菌接种对大豆产量的影响，计算方法如下（Yan等人，2025年）：
(1)
(2)其中Y+R和Y?R分别代表在同一氮肥施用水平下接种根瘤菌与否的大豆产量。同样，绝对和相对产量变化也被用来量化增加氮肥施用水平对大豆产量的影响。为了标准化不同区间间的产量变化，这些变化被调整以反映每增加10%（6 kg ha?1）氮肥水平时的平均效果。公式如下：
(3)
(4)其中Ni和Nj分别代表i和j千克/公顷的氮肥施用水平（i > j），而YNi和YNj代表相应氮肥水平下的大豆产量。

2.3.3 粗蛋白和粗脂肪含量
粗蛋白含量（%）是使用FOSS Kjeltec 8400自动分析仪（GB/T 6432-2018）测定的。大约0.5克样品与10毫升浓硫酸（98%，w/w）和催化剂片（含有K2SO4和CuSO4）在420°C下消化60-90分钟。消化后的样品随后自动蒸馏并用0.1摩尔盐酸滴定。粗蛋白含量计算为总氮乘以6.25。粗脂肪含量（%）是通过Soxhlet提取法（GB/T 5009.6-2016）测定的。大约2.0克干燥样品被放置在一个无水醚提取器中，并用石油醚（沸点范围30°C–60°C）提取6-8小时。 solvent蒸发后在60°C下称重残余脂肪来计算粗脂肪含量（Sun等人，2024年）。

2.3.4 根系形态和根瘤
在开始结荚阶段（R3），使用直径20厘米的根钻从0-40厘米的土层中收集根系，以保持完整的根系结构（Wu等人，2024年）。挖出的根系用去离子水轻轻清洗以去除土壤颗粒。新鲜的根系使用根系分析系统（EPSON Expression 13000XL，日本精工爱普生公司）扫描，以测量根长（cm）和根表面积（cm2）。扫描后，仔细地将根瘤从根系上分离并计数。所有样本随后在60°C下烘干至恒重，然后使用分析天平（±0.001克）测量根系（包括根瘤）和单独根瘤的干重。

2.3.5 固氮酶活性和SPAD值
固氮酶活性（μmol h?1 g?1）是使用乙炔还原试验（Hardy等人，1968年）测定的。在R3阶段，小心地切下新鲜的根瘤（0.2克），并在含有10%（v/v）乙炔气体的10毫升密封试管中于25°C下培养1小时。产生的乙烯量通过气相色谱法定量，并表示为每小时每克新鲜根瘤重量产生的μmol C2H4。叶绿素含量在R3阶段使用SPAD-502 Plus叶绿素仪非破坏性地测定。测量是在最上面的三片完全展开的三出复叶上进行，每个小叶在叶脉和叶缘之间的中间位置取五个读数，同时避开主要叶脉。这些测量的平均值被计算为代表SPAD值。

2.3.6 经济分析
进行了投入-产出分析，以评估在不同氮肥施用率下，无论是否接种根瘤菌，大豆生产的经济效益（Yang等人，2023年）。总投入成本（USD ha?1）是通过将每个单独投入量与其在本地实验条件下的相应市场价格相乘得出的。总产出价值（USD ha?1）是通过将谷物产量乘以本地市场价格确定的。净收益（USD ha?1）是通过总产出价值减去总投入成本来计算的。实验期间的所有生产投入及其相应价格在表1中呈现。表1显示了在两年（2023年和2024年）内，两种地点（亳州和阜阳）下，分别接种根瘤菌（+R）和未接种根瘤菌（?R）的七种氮肥施用率下大豆生产的平均成本和收益。

2.3.5 绝对和相对产量变化
绝对（kg ha?1）和相对（%）产量变化被用来评估根瘤菌接种对大豆产量的影响，计算方法如下（Yan等人，2025年）：
(1)
(2)其中Y+R和Y?R分别代表在相同氮肥施用水平下接种（+R）和未接种（?R）根瘤菌的大豆产量。同样，绝对和相对产量变化也被用来量化增加氮肥施用水平对大豆产量的影响。为了标准化不同区间间的产量变化，这些变化被调整以反映每增加10%（6 kg ha?1）氮肥水平时的平均效果。公式如下：
(3)
(4)其中Ni和Nj分别代表i和j千克/公顷的氮肥施用水平（i > j），而YNi和YNj代表相应氮肥水平下的大豆产量。

2.3.3 粗蛋白和粗脂肪含量
粗蛋白含量（%）是使用FOSS Kjeltec 8400自动分析仪（GB/T 6432-2018）测定的。大约0.5克的样品与10毫升浓硫酸（98%，w/w）和催化剂片（含有K2SO4和CuSO4）在420°C下消化60-90分钟。消化后的样品随后自动蒸馏并用0.1摩尔盐酸滴定。粗蛋白含量计算为总氮乘以6.25。粗脂肪含量（%）是通过Soxhlet提取法（GB/T 5009.6-2016）测定的。大约2.0克的干燥样品被放置在一个无水醚提取器中，并用石油醚（沸点范围30°C–60°C）提取6-8小时。溶剂蒸发后，在60°C下称重残留脂肪来计算粗脂肪含量（Sun等人，2024年）。

2.3.4 根系形态和根瘤
在开始结荚阶段（R3），使用根钻（直径20厘米）从0-40厘米的土层中收集根系，以保持完整的根系结构（Wu等人，2024年）。挖出的根系用去离子水轻轻清洗以去除土壤颗粒。新鲜的根系使用根系分析系统（EPSON Expression 13000XL，日本精工爱普生公司）扫描，以测量根长（cm）和根表面积（cm2）。扫描后，小心地将根瘤从根系上分离并计数。所有样本随后在60°C下烘干至恒重，然后使用分析天平（±0.001克）测量根系（包括根瘤）和单独根瘤的干重。

2.3.5 固氮酶活性和SPAD值
固氮酶活性（μmol h?1 g?1）是使用乙炔还原试验（Hardy等人，1968年）测定的。在R3阶段，小心地切下新鲜的根瘤（0.2克），并在含有10%（v/v）乙炔气体的10毫升密封试管中于25°C下培养1小时。产生的乙烯量通过气相色谱法定量，并表示为每小时每克新鲜根瘤重量产生的μmol C2H4。叶绿素含量在R3阶段使用SPAD-502 Plus叶绿素仪非破坏性地测定。测量是在最上面的三片完全展开的三出复叶上进行，每个小叶在叶脉和叶缘之间的中间位置取五个读数，同时避开主要叶脉。这些测量的平均值被计算为代表SPAD值。

2.3.6 经济分析
进行了投入-产出分析，以评估在不同氮肥施用率下，无论是否接种根瘤菌，大豆生产的经济效益（Yang等人，2023年）。总投入成本（USD ha?1）是通过将每个单独投入量与其在本地实验条件下的相应市场价格相乘得出的。总产出价值（USD ha?1）是通过将谷物产量乘以本地市场价格确定的。净收益（USD ha?1）是通过总产出价值减去总投入成本来计算的。实验期间的所有生产投入及其相应价格在表1中呈现。表1显示了在两年（2023年和2024年）内，两种地点（亳州和阜阳）下，分别接种根瘤菌（+R）和未接种根瘤菌（?R）的七种氮肥施用率下大豆生产的平均成本和收益。

2.3.5 绝对和相对产量变化
绝对（kg ha?1）和相对（%）产量变化被用来评估根瘤菌接种对大豆产量的影响，计算方法如下（Yan等人，2025年）：
(1)
(2)其中Y+R和Y?R分别代表在相同氮肥施用水平下接种（+R）和未接种（?R）根瘤菌的大豆产量。同样，绝对和相对产量变化也被用来量化增加氮肥施用水平对大豆产量的影响。为了标准化不同区间间的产量变化，这些变化被调整以反映每增加10%（6 kg ha?1）氮肥水平时的平均效果。公式如下：
(3)
(4)其中Ni和Nj分别代表i和j千克/公顷的氮肥施用水平（i > j），而YNi和YNj代表相应氮肥水平下的大豆产量。

2.3.3 粗蛋白和粗脂肪含量
粗蛋白含量（%）是使用FOSS Kjeltec 8400自动分析仪（GB/T 6432-2018）测定的。大约0.5克的样品与10毫升浓硫酸（98%，w/w）和催化剂片（含有K2SO4和CuSO4）在420°C下消化60–90分钟。消化后的样品随后自动蒸馏并用0.1摩尔盐酸滴定。粗蛋白含量计算为总氮乘以6.25。粗脂肪含量（%）是通过Soxhlet提取法（GB/T 5009.6-2016）测定的。大约2.0克的干燥样品被放置在一个无水醚提取器中，并用石油醚（沸点范围30°C–60°C）提取6–8小时。溶剂蒸发后在60°C下称重残余脂肪来计算粗脂肪含量（Sun等人，2024年）。

2.3.4 根系形态和根瘤
在开始结荚阶段（R3），使用根钻从0–40厘米的土层中收集根系，以保持完整的根系结构（Wu等人，2024年）。挖出的根系用去离子水轻轻清洗以去除土壤颗粒。新鲜的根系使用根系分析系统（EPSON Expression 13000XL，日本精工爱普生公司）扫描，以测量根长（cm）和根表面积（cm2）。扫描后，仔细地将根瘤从根系上分离并计数。所有样本随后在60°C下烘干至恒重，然后使用分析天平（±0.001克）测量根系（包括根瘤）和单独根瘤的干重。

2.3.5 固氮酶活性和SPAD值
固氮酶活性（μmol h?1 g?1）是使用乙炔还原试验（Hardy等人，1968年）测定的。在R3阶段，小心地切下新鲜的根瘤（0.2克），并在含有10%（v/v）乙炔气体的10毫升密封试管中于25°C下培养1小时。产生的乙烯量通过气相色谱法定量，并表示为每小时每克新鲜根瘤重量产生的μmol C2H4。叶绿素含量在R3阶段使用SPAD-502 Plus叶绿素仪非破坏性地测定。测量是在最上面的三片完全展开的三出复叶上进行，每个小叶在叶脉和叶缘之间的中间位置取五个读数，同时避开主要叶脉。这些测量的平均值被计算为代表SPAD值。

2.3.6 经济分析
进行了投入-产出分析，以评估在不同氮肥施用率下，无论是否接种根瘤菌，大豆生产的经济效益（Yang等人，2023年）。总投入成本（USD ha?1）是通过将每个单独投入量与其在本地实验条件下的相应市场价格相乘得出的。总产出价值（USD ha?1）是通过将谷物产量乘以本地市场价格确定的。净收益（USD ha?1）是通过总产出价值减去总投入成本来计算的。实验期间的所有生产投入及其相应价格在表1中呈现。表1显示了在两年（2023年和2024年）内，两种地点（亳州和阜阳）下，分别接种根瘤菌（+R）和未接种根瘤菌（?R）的七种氮肥施用率下大豆生产的平均成本和收益。

2.3.5 绝对和相对产量变化
绝对（kg ha?1）和相对（%）产量变化被用来评估根瘤菌接种对大豆产量的影响，计算方法如下（Yan等人，2025年）：
(1)
(2)其中Y+R和Y?R分别代表在相同氮肥施用水平下接种（+R）和未接种（?R）根瘤菌的大豆产量。同样，绝对和相对产量变化也被用来量化增加氮肥施用水平对大豆产量的影响。为了标准化不同区间间的产量变化，这些变化被调整以反映每增加10%（6 kg ha?1）氮肥水平时的平均效果。公式如下：
(3)
(4)其中Ni和Nj分别代表i和j千克/公顷的氮肥施用水平（i > j），而YNi和YNj代表相应氮肥水平下的大豆产量。

2.3.3 粗蛋白和粗脂肪含量
粗蛋白含量（%）是通过使用FOSS Kjeltec 8400自动分析仪（GB/T 6432-2018）测定的。大约0.5克的样品与10毫升浓硫酸（98%，w/w）和催化剂片（含有K2SO4和CuSO4）在420°C下消化60-90分钟。消化后的样品随后自动蒸馏并用0.1摩尔盐酸滴定。粗蛋白含量计算为总氮乘以6.25。粗脂肪含量（%）是通过Soxhlet提取法（GB/T 5009.6-2016）测定的。大约2.0克的干燥样品被放置在一个无水醚提取器中，并用石油醚（沸点范围30°C–60°C）提取6–8小时。溶剂蒸发后在60°C下称重残余脂肪来计算粗脂肪含量（Sun等人，2024年）。

2.3.4 根系形态和根瘤
在开始结荚阶段（R3），使用根钻从0–40厘米的土层中收集根系，以保持完整的根系结构（Wu等人，2024年）。挖出的根系用去离子水轻轻清洗以去除土壤颗粒。新鲜的根系使用根系分析系统（EPSON Expression 13000XL，日本精工爱普生公司）扫描，以测量根长（cm）和根表面积（cm2）。扫描后，仔细地将根瘤从根系上分离并计数。所有样本随后在60°C下烘干至恒重，然后使用分析天平（±0.001克）测量根系（包括根瘤）和单独根瘤的干重。

2.3.5 固氮酶活性和SPAD值
固氮酶活性（μmol h?1 g?1）是使用乙炔还原试验（Hardy等人，1968年）测定的。在R3阶段，小心地切下新鲜的根瘤（0.2克），并在含有10%（v/v）乙炔气体的10毫升密封试管中于25°C下培养1小时。产生的乙烯量通过气相色谱法定量，并表示为每小时每克新鲜根瘤重量产生的μmol C2H4。叶绿素含量在R3阶段使用SPAD-502 Plus叶绿素仪非破坏性地测定。测量是在最上面的三片完全展开的三出复叶上进行，每个小叶在叶脉和叶缘之间的中间位置取五个读数，同时避开主要叶脉。这些测量的平均值被计算为代表SPAD值。

2.3.6 经济分析
进行了投入-产出分析，以评估在不同氮肥施用率下，无论是否接种根瘤菌，大豆生产的经济效益（Yang等人，2023年）。总投入成本（USD ha?1）是通过将每个单独投入量与其在本地实验条件下的相应市场价格相乘得出的。总产出价值（USD ha?1）是通过将谷物产量乘以本地市场价格确定的。净收益（USD ha?1）是通过总产出价值减去总投入成本来计算的。实验期间的所有生产投入及其相应价格在表1中相比之下，接种处理下每株植物的种子数量平均比未接种处理高11.9%（p<0.05），并且在两种接种条件下，随着氮肥施用量的减少，种子数量呈现下降趋势。表2显示了2023年和2024年在博州和阜阳，在7种不同氮肥施用量下，接种根瘤菌（+R）与未接种根瘤菌（?R）处理的大豆产量构成、地上生物量（AGB）和收获指数（HI）的差异。表2：产量构成、地上生物量和收获指数。

3.3 种子质量
两年的两地点试验结果表明，根瘤菌接种对种子质量参数（粗蛋白和粗脂肪含量）没有显著影响（p>0.05；图5）。同样，不同氮肥施用量对这些质量性状也没有显著差异，表明种子质量在各种处理间相对稳定。图5显示了2023年和2024年在博州和阜阳，在7种不同氮肥施用量下，接种根瘤菌（+R）与未接种根瘤菌（?R）处理的大豆种子的粗蛋白（a–d）和粗脂肪（e–h）含量。数值为平均值±标准误差（n=3）。不同的小写字母表示根据LSD检验在p<0.05水平上处理间存在显著差异。N60、N54、N48、N42、N36、N30和N0分别代表60、54、48、42、36和0千克/公顷的氮肥施用量。

3.4 根系形态、根瘤、氮酶活性和SPAD值
根瘤菌接种使根系重量、根系长度和根系表面积分别平均增加了24.0%、29.0%和29.5%，优于未接种处理（p<0.001；表3）。然而，这些根系性状对氮肥施用量的反应不同：根系重量随着氮肥供应的减少而持续下降，而根系长度和根系表面积则先增加后减少。表3显示了2023年和2024年在博州和阜阳，在7种不同氮肥施用量下，接种根瘤菌（+R）与未接种根瘤菌（?R）处理的大豆在结荚初期（R3）的根系重量（干重）、长度和表面积。

3.5 经济分析
由于根瘤菌接种剂（3.36美元/公顷）、种子保护剂（12.26美元/公顷）和种子接种劳动（12.03美元/公顷）的额外费用，接种根瘤菌处理的年总投入比未接种处理高出27.67美元/公顷（表1）。然而，根瘤菌接种导致的种子产量增加使年总产出平均增加了13.2%，年净收益增加了28.1%（p<0.05）。无论接种状态如何，净收益随着氮肥施用量的减少而下降，其中N60+R处理的净收益最高（1050美元/公顷），其次是N54+R（1024美元/公顷）、N60?R（983美元/公顷）和N48+R（956美元/公顷）。

4 讨论
4.1 不同氮肥施用量下根瘤菌接种对种子产量的影响
我们的研究表明，根瘤菌接种显著提高了在不同氮肥施用量下的大豆种子产量（图2）。观察到的产量增加（14.3%–16.3%）在黄淮海平原的研究范围内（6.5%–31.7%；Yang等人，2018年），并且高于Barbosa等人（2022年）报告的全球平均增加幅度（6.4%–11.4%）。这一差异可能归因于研究区域沙江黑土有机质含量低且肥力较差（Ding等人，2026年），这使得接种后有更大的产量提升潜力。接种带来的产量优势可能与增强的根瘤形成和生物固氮作用有关，从而提高了植物可利用的氮素含量。因此，植株的营养生长得到加强，冠层的光合作用能力得到改善，干物质积累增加，最终导致更高的种子产量（Thilakarathna和Raizada，2017年）。在低氮输入条件下，这种效应更为明显（图3），这可能是由于外来氮素抑制了根瘤形成和氮酶活性（Ntambo等人，2017年）。相反，高氮输入会抑制根瘤形成和氮酶活性（图6），从而限制了生物固氮的贡献（Sogut等人，2006年；Zhou等人，2006年）。尽管氮肥施用量增加提高了产量，但在接种处理下的增幅较低（图4）。当氮肥施用量从0增加到60千克/公顷时，接种处理下每增加10%氮肥，产量增加量为112–128千克/公顷，而未接种处理下为165–171千克/公顷。这表明由于生物固氮作用的增强，对化学氮（chemical N）的依赖性降低了（Albareda等人2009年；Sogut 2006年）。此外，接种根瘤菌可以改善根际条件并增加养分吸收（例如，磷和钾；Wen等人2024年），进一步支持产量的形成（Wang等人2010年，2022年）。总体而言，根瘤菌接种不仅提高了大豆产量，特别是在低氮投入条件下，还减少了对合成肥料的依赖，使其成为实现可持续和高效大豆生产的有前景的策略。

4.2 根瘤菌接种和氮施用率对大豆根系形态及叶片SPAD值的影响

本研究揭示，在R3生长阶段增加氮施用率显著改善了大豆根系形态和叶片SPAD值，而根瘤菌接种进一步增强了这些有益效果（图6；表3）。换句话说，根瘤菌接种与氮肥的联合应用可能缓解了R3阶段（约8月，图1）高温胁迫引起的早衰现象，这与之前的研究结果一致（Kibido等人2019年）。从根系形态的角度来看，这种改善归因于根瘤菌接种和氮肥的互补作用，两者共同显著增加了根长、表面积和重量（表3）。具体来说，化学氮在共生固氮作用受限的早期生长阶段提供 readily available 的氮（An等人2025年），而根瘤菌则在后期通过生物固氮作用持续供应氮（Gelfand和Robertson 2015年）。因此，这种“化学氮+生物氮”综合策略确保了更均衡的氮供应，促进了根系发育，并增强了水分和养分的吸收（Freitas等人2022年；He等人2025年）。然而，当氮过量供应时，由于土壤养分探索的需求减少，根系生长可能会受到抑制（McCoy等人2018年）。与塑料薄膜或秸秆覆盖等替代方法相比，后者通常成本较高或可能产生副作用（Wu等人2021年，2024年），本研究中提出的氮肥与根瘤菌接种的联合策略提供了一种更简单、更高效且环境可持续的方法来促进根系发育。在整株植物层面，强化的根系通过促进水分和养分的吸收进一步支持地上部分的生理表现（Li等人2023年）。这种协调体现在更高的SPAD值和功能性叶片的延迟衰老上（Chen等人2024年）。相关性分析显示SPAD值与根系性状之间存在显著的正相关关系，结构方程模型也进一步证实了这一点（图7和图8）。这些结果表明，根瘤菌接种与氮肥的结合确保了叶绿素合成的持续氮供应。此外，根瘤菌可能通过细胞分裂素等植物激素调节叶片衰老（Fahde等人2023年）。总之，增加氮肥施用量并结合根瘤菌接种不仅增强了根系结构，还维持了叶片的生理功能，提供了双重机制来保证高质量和稳定的大豆产量。

4.3 根瘤菌接种和氮施用率对大豆产量和盈利能力的影响

本研究表明，根瘤菌接种在推荐的氮施用率下提高了大豆产量，并且在氮肥减少20%的情况下仍能保持高产量（图2；表1）。这种产量优势主要与每株种子数量的增加有关（图7和图8），这与R3生长阶段根系和叶片表现的改善密切相关（图6；表3），确保了种子形成所需的同化产物供应（Li等人2023年）。尽管其他产量成分如种子重量或每株豆荚数量也可能有所贡献（Board和Tan 1995年；Borrás等人2004年），但每株种子数量通常对水分和氮的可用性等环境因素更为敏感（Wang等人2014年）。与此一致的是，种子质量（粗蛋白和粗脂肪含量）在不同处理下相对稳定（图5），表明其主要由遗传因素决定，只有在极端环境条件下才会受到显著影响（MacMillan和Gulden 2020年；Sehgal等人2018年）。进一步分析显示，根瘤菌接种与较高的氮输入结合使用在R3生长阶段增强了根系发育和叶片SPAD值（图6；表3），表明具有更强的水分和养分吸收能力以及叶片衰老的延迟。结果，开花后的干物质积累得以维持，碳和氮同化产物的分配得到了改善（Wang等人2020年；Wu等人2024年），最终增加了地上生物量及收获指数（表2）。随机森林模型进一步支持了这一结果，该模型将地上生物量确定为大豆产量的最重要预测因子（图7）。值得注意的是，根瘤菌接种部分缓解了高氮输入对结瘤和硝酸还原酶活性的抑制作用（图6），表明在高氮条件下生物固氮作用仍然可以发挥作用（Ciampitti和Salvagiotti 2018年；McCoy等人2018年）。这种化学氮与生物氮的互补作用确保了后期生长阶段更稳定的氮供应。尽管接种会带来额外的成本，但产量增长抵消了这些投入，从而提高了盈利能力（Yang等人2024年）。与传统做法（不接种，氮施用量为60公斤/公顷）相比，在相同氮水平下接种使净收益增加了6.8%，而氮肥减少20%也能获得相当的经济效益。总之，氮管理和根瘤菌接种的协调优化不仅实现了资源节约和产量提升，还为开发绿色高效的大豆生产系统提供了坚实的理论和实践基础。

5 结论

本研究基于为期两年、在两个地点进行的田间实验，评估了根瘤菌接种与氮肥管理结合对HHHP地区大豆生产的影响。总体而言，无论是否接种根瘤菌，氮投入都能增加大豆产量；然而，在接种条件下，产量对氮的响应较弱，表明对化学氮肥的依赖性降低了。一致的是，在所有氮水平下，接种处理的产量都高于未接种处理，尤其是在低氮投入条件下优势更为明显。这种模式可能是由于根系生长和叶片SPAD值的改善，以及减少了氮对结瘤和硝酸还原酶活性的抑制作用，从而促进了生物量积累和每株种子数量的增加。基于这些结果，根瘤菌接种不仅在推荐的氮施用率（60公斤/公顷）下提高了产量和经济效益，而且在氮肥减少20%（48公斤/公顷）的情况下仍保持了产量，体现了其在平衡产量和环境风险方面的潜力。因此，建议在播种时接种根瘤菌，特别是在氮肥投入减少的情况下，以实现高产量并促进HHHP地区的可持续大豆生产。

作者贡献

Lei Yang：概念化、数据整理、形式分析、方法学、软件使用、验证、可视化、初稿撰写。Xiaofei Chen：数据整理、调查、验证。Wenjun Jin：数据整理、调查、验证。Dagang Wang：数据整理、资源提供、监督、验证。Changfu Tian：监督、验证。Chong Xu：调查、验证。Lingcong Kong：资源提供、监督。Zhiping Huang：资源提供、监督。Yifei Lu：调查、项目管理、监督、验证。Chang Liu：调查、监督、验证。Zhaohai Zeng：监督、撰写——审阅和编辑。Wenfeng Chen：概念化、数据整理、形式分析、项目管理、资源提供。Xiangbei Du：概念化、数据整理、形式分析、资金筹措、方法学、项目管理、资源提供、软件使用、撰写——审阅和编辑。

致谢

本研究得到了安徽省重点科技项目（202423110050045）、科技创新2030重大项目（2023ZD0403305）、国家重点实验室植物环境韧性开放基金（SKLPERKF2403）以及国家大豆产业技术体系项目（CARS-04）的财政支持。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可向 Corresponding Author Xuangbei Du 请求获得。